miR-30a-5p調(diào)控USP22對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖和凋亡的影響

姜永寧

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要發(fā)生于>60歲人群。PD的主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元丟失和殘存神經(jīng)元胞內(nèi)α-突觸核蛋白聚集沉積。研究認(rèn)為，PD黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性中存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，凋亡是PD多巴胺能神經(jīng)元死亡的主要機(jī)制[1]，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)于PD疾病的治療具有積極意義。1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)是一種常用的多巴胺神經(jīng)元毒素，其誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元凋亡已廣泛用于PD的體外細(xì)胞模型研究[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為18～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，可與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)靶向結(jié)合，抑制靶mRNA翻譯或降解靶mRNA，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與PD的發(fā)生發(fā)展過程[3,4]。研究顯示，經(jīng)左旋多巴治療后的PD患者血清中miR-30a-5p的表達(dá)水平顯著上調(diào)，miR-30a-5p可能是PD的潛在生物標(biāo)記物[5]。但miR-30a-5p與PD的具體關(guān)系及調(diào)控機(jī)制還未被闡明。Starbase生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，泛素特異性蛋白酶22(ubiquitin specific protease 22，USP22)的3’UTR與miR-30a-5p的核苷酸序列存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)，提示USP22可能是miR-30a-5p的靶基因。USP22屬于DUBs家族，參與組蛋白去泛素化、乙?；M(jìn)而參與hSAGA復(fù)合物所調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)等。目前認(rèn)為USP22是腫瘤標(biāo)志物，與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[6]，其在PD中的作用筆者還未見相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討miR-30a-5p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SK-N-SH)細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其能否通過調(diào)控USP22影響MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖和凋亡，以期為PD的靶向分子治療提供新途徑。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Hycolne公司，DMEM培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒和雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑和LipofectamineTM 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，PCR引物購自上海生工生物工程有限公司，細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase-3)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自美國Santa Cruz公司，miR-30a-5p 模擬物(mimcs)及模擬陰性對(duì)照序列(miR-NC)、miR-30a-5p抑制劑(anti-miR-30a-5p)及抑制劑陰性對(duì)照序列(anti-miR-NC)、USP22的小干擾RNA(si-USP22)及亂序無意義陰性序列(si-NC)、USP22過表達(dá)載體(pcDNA-USP22)及空載體(pcDNA-NC)購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:SK-N-SH細(xì)胞用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件：溫度37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度97%。每2～3天更換一次新鮮的培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長密度至80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的SK-N-SH細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中。待細(xì)胞生長密度至60%時(shí)，更換不含F(xiàn)BS的DMEN培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM 2000試劑盒說明書，分別將miR-30a-5p mimcs(miR-30a-5p 組)、miR-NC(miR-NC組)、anti-miR-30a-5p(anti-miR-30a-5p組)、anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、si-USP22(si-USP22組)、si-NC(si-NC組)、miR-30a-5p mimcs與pcDNA-USP22(miR-30a-5p+pcDNA-USP22組)及miR-30a-5p mimcs與pcDNA-NC(miR-30a-5p+pcDNA-NC組)轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組處理:未轉(zhuǎn)染的SK-N-SH細(xì)胞分為對(duì)照組(NC組)和MPP+組，每組3個(gè)復(fù)孔，NC組細(xì)胞正常培養(yǎng)，MPP+組細(xì)胞采用含1 mmol/L[7]MPP+的培養(yǎng)基作用24 h。miR-30a-5p組、miR-NC組、si-USP22組、si-NC組、miR-30a-5p+pcDNA-USP22和miR-30a-5p+pcDNA-NC組細(xì)胞均用含1 mmol/L MPP+的培養(yǎng)基作用24 h，每組3個(gè)復(fù)孔，并分別記為MPP++miR-30a-5p組、MPP++miR-NC組、MPP++si-USP22組、MPP++si-NC組、MPP++miR-30a-5p +pcDNA-USP22和MPP++ miR-30a-5p+pcDNA-NC組。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)細(xì)胞中miR-30a-5p和USP22 mRNA表達(dá):Trizol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，微量核酸儀檢測(cè)RNA的純度和濃度，其在260 nm和280 nm處吸光度值(absorbance，A)的比值A(chǔ)260 nm/A280 nm處于1.8～2.0范圍內(nèi)說明其純度較好，可用于擴(kuò)增。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-30a-5p正向引物5’-CGTAGAGCTGATCGACGATG-3’，反向引物5’-GTG TCACCGTAACGTGACG-3’；USP22正向引物5’-TTCACCAGACCAGAGCACTT-3’，反向引物5’-CATACGTGGTGATCTTCCGC-3’；U6正向引物5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGCAGC-3’，反向引物5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；β-actin正向引物5’-GCCGGGACCTGACT GACTAC-3’，反向引物5’-CGGAGTACTTGCGCTCAGGA-3’。miR-30a-5p以U6為內(nèi)參，USP22以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-30a-5p和USP22 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中USP22、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá):細(xì)胞以每孔2.5×104個(gè)接種于24孔板中，按照1.2.2分組處理后，吸棄培養(yǎng)基，加入RIPA細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白。BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度后進(jìn)行定量，以每泳道30 μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)至聚偏乙烯二氟(PVDF)膜，并置于5%脫脂奶粉中封閉2 h。分別置于USP22、CyclinD1、Cleaved-caspase-3和β-actin抗體孵育液中，4℃冰箱孵育過夜。TBST洗膜后，置于辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗孵育液中，37℃孵育1 h。TBST洗膜后，滴加ELC化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率:細(xì)胞以每孔0.5×104個(gè)接種于96孔板中，按照1.2.2分組處理后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h后酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定A。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/ANC組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:細(xì)胞以每孔2.5×104個(gè)接種于24孔板中，按照1.2.2分組處理后，吸棄培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，適量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗2次。取1.0×106個(gè)細(xì)胞，加入500 μl結(jié)合緩沖液?；鞈壹?xì)胞后，加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。加入5 μl PI，室溫避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-30a-5p與USP22靶向關(guān)系:PCR擴(kuò)增含miR-30a-5p結(jié)合位點(diǎn)的USP22的3’UTR序列，將其克隆至GV272載體中，構(gòu)建USP22野生型雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(WT-USP22)。利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變后，同樣克隆至GV272載體中，構(gòu)建USP22突變型雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(MUT-USP22)。分別將WT-USP22、MUT-USP22與miR-30a-5p mimic、miR-NC共轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，收集細(xì)胞并裂解，參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 MPP+對(duì)SK-N-SH細(xì)胞中miR-30a-5p和USP22表達(dá)的影響 與NC組比較，MPP+組細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，USP22 的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western Blot檢測(cè)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞后USP22蛋白表達(dá)

表1 MPP+對(duì)SK-N-SH細(xì)胞中miR-30a-5p和USP22表達(dá)的影響

2.2 上調(diào)miR-30a-5p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與NC組比較，MPP+組細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與MPP++miR-NC組比較，MPP++miR-30a-5p組細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 上調(diào)miR-30a-5p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;A 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；B Western Blot檢測(cè)CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

表2 上調(diào)miR-30a-5p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 下調(diào)USP22對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與MPP++si-NC組比較，MPP++si-USP22組細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 下調(diào)USP22對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 Western Blot檢測(cè)USP22、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

2.4 miR-30a-5p靶向USP22表達(dá) Starbase生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，USP22的3’UTR與miR-30a-5p的核苷酸序列存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-USP22的miR-NC組比較，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-USP22的miR-30a-5p組細(xì)胞雙熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而與共轉(zhuǎn)染MUT-USP22的miR-NC組比較，共轉(zhuǎn)染MUT-USP22的miR-30a-5p組細(xì)胞雙熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。與miR-NC組比較，miR-30a-5p組細(xì)胞中USP22蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-30a-5p組細(xì)胞中USP22蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖4，表4、5。

圖4 miR-30a-5p靶向USP22表達(dá);A miR-30a-5p和USP22的結(jié)合位點(diǎn)；B Western Blot檢測(cè)USP22蛋白表達(dá)

表4 雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

表5 miR-30a-5p對(duì)USP22蛋白表達(dá)的影響

2.5 上調(diào)USP22逆轉(zhuǎn)miR-30a-5p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與MPP++miR-30a-5p+pcDNA-NC組比較，MPP++miR-30a-5p+pcDNA-USP22組細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 Western Blot檢測(cè)USP22、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表6 上調(diào)USP22逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-30a-5p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

PD的發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病，是第二大神經(jīng)退行性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確[8]。PD的特征性病理改變是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性和壞死，延緩多巴胺能神經(jīng)元的變性可阻止PD發(fā)展進(jìn)程。研究顯示，多巴胺能神經(jīng)元的過度凋亡引起帕金森病的中心環(huán)節(jié)，多種病因最終都是引起細(xì)胞凋亡導(dǎo)致帕金森發(fā)病[9]。MPP+具有神經(jīng)毒性，可誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)元的凋亡，常被用于體外帕金森細(xì)胞模型研究。本研究顯示，MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力降低，凋亡率升高，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果[10]一致，說明MPP+抑制SK-N-SH細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

miRNA在真核生物中廣泛存在，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)行為，在人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。miR-30a-5p屬于miR-30家族成員，目前對(duì)其研究主要集中在腫瘤方面。研究顯示，miR-30a-5p在非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤中表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等，是腫瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)[11-13]。然而，miR-30a-5p在PD發(fā)生發(fā)展中的作用和調(diào)控機(jī)制還未知。CyclinD1是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，其表達(dá)增殖可加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。本研究顯示，上調(diào)miR-30a-5p后，MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達(dá)升高，上調(diào)miR-30a-5p可能通過上調(diào)CyclinD1蛋白表達(dá)促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與細(xì)胞凋亡過程。caspase-3是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要分子，其受到上游信號(hào)刺激被激活后產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本研究顯示，上調(diào)miR-30a-5p后，MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，提示上調(diào)miR-30a-5p可能通過抑制細(xì)胞中Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)降低MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞凋亡。

USP22基因定位于人染色體17p11.2，由14個(gè)外顯子組成，其編碼蛋白表達(dá)于細(xì)胞核。研究顯示，USP22在非小細(xì)胞肺癌和胃癌等腫瘤中表達(dá)升高，下調(diào)其表達(dá)可顯著降低了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[16,17]。高糖可促進(jìn)足細(xì)胞中USP22表達(dá)，上調(diào)USP22表達(dá)可明顯增強(qiáng)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)[18]。目前，USP22對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究顯示，MPP+可促進(jìn)SK-N-SH細(xì)胞中USP22的mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)USP22可促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，提示USP22可能參與PD的發(fā)生和發(fā)展過程。

為了進(jìn)一步探究上調(diào)miR-30a-5p促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，USP22可能是miR-30a-5p的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-30a-5p可與USP22的3’UTR靶向結(jié)合。此外，SK-N-SH細(xì)中miR-30a-5p上調(diào)后，USP22蛋白表達(dá)水平降低，而下調(diào)miR-30a-5p后，USP22蛋白表達(dá)水平升高，進(jìn)一步證實(shí)了miR-30a-5p在SK-N-SH細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控USP22表達(dá)。本研究還顯示，上調(diào)USP22逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-30a-5p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖和凋亡的影響，提示上調(diào)miR-30a-5p通過靶向抑制USP22表達(dá)促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，MPP+可抑制SK-N-SH細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而上調(diào)miR-30a-5p表達(dá)可促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞增殖及降低MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中USP22表達(dá)有關(guān)，miR-30a-5p/USP22軸可能為PD的治療提供了潛在分子靶點(diǎn)。