赤潮藻米氏凱倫藻抑藻細菌的篩選及鑒定*

丁 寧

(曲阜師范大學生命科學學院，273165，山東省曲阜市)

0 引 言

赤潮(Red tides)，國內(nèi)外學者稱之為“有害藻華”(Harmful algal blooms)的一種，它是海洋中一些有毒有害微藻、大型藻或藍細菌等生物量在一定環(huán)境條件下暴發(fā)性增長或高度聚集達到某一水平，引起局部海域水體變色，影響和危害水生生態(tài)系統(tǒng)以及人類健康的現(xiàn)象[1-2].赤潮被研究學者普遍劃分為兩大類別—無毒赤潮與有毒赤潮.無毒赤潮是指赤潮生物本身不具毒性或不分泌有害毒素.有毒有害赤潮是指以赤潮生物體內(nèi)含有某種毒素或能分泌毒素的生物為主形成的赤潮[3].當前，有毒有害赤潮的治理方法已成為全球區(qū)域內(nèi)海洋生態(tài)環(huán)境方向的研究內(nèi)容.物理和化學治理有害藻華的方法立竿見影，但是容易導致二次海洋生態(tài)環(huán)境污染問題.人們將赤潮防治領(lǐng)域的研究熱點聚焦于生物控藻方法.目前，生物防治赤潮主要有兩大研究方向：一是大型海藻與赤潮微藻間的相生相克及營養(yǎng)競爭作用[4].當前大型海藻對赤潮微藻的抑制作用主要集中在研究克生物質(zhì)的分離提取、克生機理的探究等方面[5]；二是利用細菌、真菌、病毒等微生物方法控藻.微生物是海水中調(diào)節(jié)藻類種群動態(tài)平衡的潛在因子，它們繁殖速度快、具有宿主專一性，是一種非常有潛質(zhì)的有害赤潮調(diào)控因子[3].在生物進化過程中，海洋微藻和細菌之間形成了復雜的生態(tài)關(guān)系.微藻能夠向周圍分泌有機物，這些有機物可以吸引大量以細菌為主的微生物，并且能夠刺激細菌的生長因子[6];而細菌代謝后形成的簡單有無物或者有機物，又能為微藻提供營養(yǎng)鹽和必要的生長因子，從而調(diào)節(jié)藻類的生長、繁殖、孢囊形成、形態(tài)改變、致死率[7]，這類細菌成為依附于微藻生長環(huán)境的“藻際細菌”.有一類細菌可以通過直接或者間接的方式抑制赤潮藻的生長、殺死或溶解赤潮藻細胞，這類細菌稱為抑藻細菌[8].由于細菌具有分布廣、繁殖快、無二次污染等特點，細菌抑藻已成為防治赤潮的重要方向.

米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)作為典型的有毒有害海洋赤潮藻類，隸屬于甲藻門，裸甲藻目，凱倫藻屬，常見于溫帶和亞熱帶的近海水域.自上世紀30年代以來，人們就發(fā)現(xiàn)這種藻類的大量繁殖，導致了許多國家沿海水域的魚類、貝類和其他無脊椎動物大量死亡[9].因此，分離篩選和鑒定抑藻細菌，探究抑藻細菌的多樣性，為防治米氏凱倫藻赤潮的爆發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試藻種及培養(yǎng)

實驗用米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)藻株從中國海洋大學微藻培養(yǎng)室購入.微藻培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中進行，溫度為(20±1) ℃，光照強度為2500 μmol m-2s-1，光暗比為12 h∶12 h，pH=7.5±0.1，鹽度為30±1.0.實驗所用天然海水均通過0.45 μm的膜過濾，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，每天定時搖動微藻培養(yǎng)瓶4～5次，以防止微藻附壁生長.

1.1.2 藻種及細菌培養(yǎng)基

米氏凱倫藻培養(yǎng)用f/2培養(yǎng)液[10].細菌培養(yǎng)基為2216E培養(yǎng)基：陳海水1000 mL、蛋白胨5.0 g、酵母膏1.0 g、磷酸高鐵0.1 g[11].

1.2 實驗方法

1.2.1 米氏凱倫藻生長曲線的測定采用血球計數(shù)法對微藻計數(shù).取1 mL搖勻的米氏凱倫藻藻液加入一滴魯格試劑進行固定，混勻取20 μL滴于血球計數(shù)板上，于光學顯微鏡(10×40)下觀察計數(shù)，每24 h觀察記錄一次,記錄7 d，實驗設置3組平行.

1.2.2 米氏凱倫藻異養(yǎng)細菌的分離純化

在超凈工作臺中取米氏凱倫藻藻液10 mL稀釋成不同的濃度梯度，各取100 μL至高溫滅菌后的2216E固體培養(yǎng)基上中，用涂布棒均勻涂布，將其倒置于21 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待平板中出現(xiàn)肉眼可見的大小、顏色、形態(tài)不同的單菌落，進而分離純化.將單菌轉(zhuǎn)移至2216E液體培養(yǎng)基(經(jīng)高溫滅菌)中，于溫度21 ℃、轉(zhuǎn)速100 r min-1條件的搖床中培養(yǎng).為保證單菌的純度用同樣方法分離純化3次.將純化后的單菌用15%的甘油于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆肹12].

1.2.3 細菌DNA提取及基因序列擴增

對待測菌株用AXYGEN AxyPrep基因組提取試劑盒提取細菌DNA.以正向27F和反向1492R為引物進行PCR系列反應[13].PCR(LC480Ⅱ型)擴增體系和反應程序為：TaqDNA聚合酶0.5 μL，dNTPs 1 μL，27F 1 μL、1492R 1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 15.5 μL；96 ℃預變性2.5 min，96 ℃擴增30 s,60 ℃退火30 s,70 ℃延伸30 s,循環(huán)35次后，70 ℃延伸4 min.取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠圖像處理系統(tǒng)觀察并選取條帶明亮且單一的擴增子送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序.

1.2.4 DNA序列分析

將測序所得的序列在GenBank中與已有的細菌16S rRNA序列進行blast比對以確定其進化地位和親緣，序列差異小于3%的被認為屬于同一種系型，Clustal X建立aln文件，用Mega 6.0軟件中neighbor-joining算法對菌株系統(tǒng)發(fā)育樹進行構(gòu)建.

1.2.5 抑藻效果的測定

將分離純化的單菌于2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，然后以體積比為3%和5%的細菌菌液添加至100 mL指數(shù)生長期的米氏凱倫藻培養(yǎng)液中進行共培養(yǎng)，以添加無菌2216E液體培養(yǎng)基為對照組，每24 h觀察米氏凱倫藻的生長情況，計數(shù)藻細胞數(shù)量,觀察藻細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，實驗設置3組平行.

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010軟件完成數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析.通過單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗處理組與對照組之間的差異顯著性，P<0.05表示具有顯著性差異.

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 米氏凱倫藻生長曲線

通過光學顯微鏡下血球計數(shù)法對米氏凱倫藻細胞計數(shù)，由圖1可見，米氏凱倫藻的生長可分為平穩(wěn)增長期、指數(shù)生長期和生長延滯期.藻細胞在前兩天處于緩慢增長期，隨即進入指數(shù)生長期，在第3天處于緩和后又進入二次指數(shù)生長期，直至第7天藻細胞密度生長緩慢(未列出)，進入生長停滯期.米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)是我國沿海一種分布廣泛的魚毒性赤潮微藻，通過對藻細胞生長周期的測定，為抑藻菌的篩選及分離奠定基礎.

圖1 米氏凱倫藻的生長曲線

2.2 米氏凱倫藻異養(yǎng)細菌的分離

從米氏凱倫藻培養(yǎng)液中分離純化得到了5株細菌2號至7號(圖2),菌落形態(tài)不一，顏色各異,見下圖.這些細菌均可以在2216E培養(yǎng)基中快速生長繁殖.

藻際異養(yǎng)細菌對于微藻的生長、繁殖和代謝活動都起著非常重要的作用,近年來對海洋細菌的關(guān)注已越來越多,分離鑒定方法也越來越多,傳統(tǒng)的平板涂布劃線方法能夠有效地分離篩選獲得單菌菌落，然后通過表型和化學方法加以初步鑒定.

圖2 細菌菌落形態(tài)及顏色

2.3 16S rRNA基因序列測序結(jié)果

對6株細菌進行16S rRNA基因序列擴增，PCR產(chǎn)物跑電泳后，經(jīng)凝膠圖像觀察6株細菌的條帶明亮且單一(圖3),送測序公司公司測序.將測序所得的6株米氏凱倫藻異養(yǎng)細菌的16S rRNA基因序列在NCBI上與所存在的序列進行對比，結(jié)果表明，6株細菌的基因序列與數(shù)據(jù)庫中已知的序列相似達96%～99%，其中包含Kocuriasp.,Paracoccussp.，Halomonassp.，Joostellamarina，Idiomarinasp.和Halobacillusalkaliphilus.

有些菌種的鑒定僅通過傳統(tǒng)的表型及化學方法無法滿足，隨著分子生物學方法研究的開展，目前16S rRNA序列方法已經(jīng)成為細菌系統(tǒng)分類學研究中常用也是最有效的分子指標,被廣泛應用于海洋、陸地等微生物的遺傳特性和分子差異的研究[14].利用分子生物學方法研究海洋藻類共生細菌群落的組成,是簡單、快捷又有效的一種方法.

圖3 PCR產(chǎn)物凝膠成像電泳檢測

2.4 抑藻效果

將分離獲得的6株異養(yǎng)細菌與米氏凱倫藻進行共培養(yǎng)觀察并記錄7 d，與對照組相比，其中一株米氏凱倫藻藻液顏色變淺，藻細胞數(shù)量減少，藻細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生破損變化，初步判定這株菌具有一定抑藻效果，即副球菌屬(Paracoccussp.).抑藻實驗結(jié)果表明(圖4)，對照組中，藻細胞密度從初始3×104cells·mL-1逐漸增加至第7 d的2.3×105cells·mL-1.由圖可知，隨著副球菌菌液作用濃度的升高，米氏凱倫藻密度隨時間延長呈現(xiàn)降低的趨勢.在1%副球菌液濃度下，僅在第1 d時藻細胞密度呈現(xiàn)下降趨勢，藻細胞密度隨即開始上升，在第2 d后抑藻菌對米氏凱倫藻表現(xiàn)為生長促進作用(負抑制)(P>0.05).這一現(xiàn)象普遍被認為是低濃度的毒物對微藻生長產(chǎn)生了刺激效應[15].當副球菌濃度為3%時，1 d以后即對米氏凱倫藻細胞的生長表現(xiàn)出顯著的抑制效應(P<0.05)，抑藻率維持在95%以上.在5%作用濃度下，副球菌對米氏凱倫藻呈現(xiàn)出最大的抑制效果，且隨時間的延長抑藻效果增強(P<0.05).實驗結(jié)果表明本課題組從微藻生長環(huán)境中分離得到的副球菌株對有害赤潮藻米氏凱倫藻的生長具有短期有效的滅殺效果，且作用濃度在3%以上時抑制效果尤為顯著.

越來越多的報道研究表明，在赤潮發(fā)生和消失過程中，細菌群落與赤潮藻華的組成、繁殖和生理狀態(tài)密切相關(guān).目前，許多對赤潮藻有抑制作用的溶藻微生物被從赤潮微藻生長繁殖的環(huán)境中分離得到，例如，譚爍(2016)在赤潮發(fā)生的海水樣本中分離獲得希瓦氏菌和芽孢桿菌能夠誘導有害微藻球形棕囊藻發(fā)生細胞程序性死亡[16].

圖4 副球菌對米氏凱倫藻生長的影響

2.5 抑藻菌進化樹分析

對所測得的抑藻細菌副球菌與在NCBI數(shù)據(jù)庫中同源性高的細菌16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5).由圖可知，基于16S rRNA的米氏凱倫藻抑藻菌隸屬于副球菌(Paracoccussp.).副球菌細胞呈球狀或短桿狀，為革蘭氏陰性菌，缺乏運動能力，屬于好氧菌，當硝酸鹽、亞硝酸鹽或氧化氮存在時能以它們?yōu)殡娮邮荏w營厭氧生長,常出現(xiàn)在土壤、天然和人工的鹽水中.本文中對米氏凱倫藻產(chǎn)生抑制作用的一株副球菌被從微藻生長的天然海水中分離得到.龔詩雁等(2014)從米氏凱倫藻藻際環(huán)境中分離到一株異養(yǎng)細菌，其與黃桿菌屬(Flavobacterium)序列相似度達99%，有研究表明,黃桿菌屬能誘導孔石莼形態(tài)發(fā)生變化，是常見的抑藻細菌[17].

圖5 基于16S rRNA的米氏凱倫藻抑藻菌系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié) 論

米氏凱倫藻因其分泌溶血性毒素是一種有毒藻類.本文從米氏凱倫藻生長環(huán)境中篩選得到1株具有潛在抑藻活性的細菌，通過分子生物學16S rRNA序列分析方法分析，抑藻細菌隸屬于副球菌屬(Paracoccussp.).通過藻菌共培養(yǎng)試驗表明，副球菌對米氏凱倫藻的生長呈現(xiàn)出短期高效的抑制效果，且抑藻效果隨著菌液作用濃度的增加和作用時間的延長而增強.本研究表明，米氏凱倫藻抑藻細菌存在于海洋環(huán)境中，抑藻菌副球菌的分離獲得及抑藻活性的探究也為研究赤潮的防治提供了重要的理論依據(jù).