構建乳腺癌免疫相關長鏈非編碼RNA預后風險模型

肖 冉，楊 盟，丁茹夢，譚遠遠，李朵璐

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院藥學部,河南 鄭州450052；2.鄭州市第七人民醫(yī)院心血管內科,河南 鄭州 450006)

乳腺癌(breast cancer,BRCA)是女性最多發(fā)的腫瘤之一，是女性死亡的主要原因，其發(fā)病率逐年上升[1-2]。隨著診療水平的提高，BRCA的死亡率顯著降低，但由于BRCA的高異質性，手術和化療仍是其主要的治療手段[3-4]。有研究報道，BRCA患者的預后與機體免疫力有關[5-7]。因此，有必要尋找與免疫相關的預測因子來改善BRCA的預后。長非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指轉錄長度超過200 nt的主要非編碼RNA類型[8]，其參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和腫瘤的免疫應答，并可導致不良預后[9]。干擾lncRNA的表達能夠改變腫瘤的實際情況，已在多種癌癥類型中得到廣泛認可[10]。而免疫相關lncRNA在乳腺癌預后中的作用尚不明確，因此，本研究擬探索免疫相關lncRNA與BRCA患者預后的關系，為臨床診斷和治療提供指導。

1 材料與方法

1.1 數據下載從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中獲得了BRCA的轉錄組RNA測序數據和臨床病理數據，包含113個非腫瘤組織和1 039個BRCA組織。收集并提取了患者的臨床病理數據(不包括總生存時間≤30 d的患者)。數據更新于2020年7月11日。

1.2 鑒定免疫相關的lncRNA結合ImmLnc數據庫(http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/ImmLnc)，篩選出BRCA免疫相關lncRNAs。單因素Cox回歸分析獲得了10個與免疫相關的lncRNA的預后(P<0.05)。根據AIC確定最優(yōu)的預測模型，建立免疫相關的lncRNAs模型(P<0.05)。計算每例患者的風險評分，公式如下：風險評分=Exp1×lncRNA1 + Exp2×lncRNA2 +…+ Expi×lncRNAi，其中Expi是樣本中每種免疫相關lncRNA的相對表達量，lncRNAi是多元分析模型的回歸系數。

1.3 模型評價及臨床病理參數分析根據中位風險評分，將BRCA患者分為高風險組和低風險組。通過Kaplan-Meier生存分析比較2組之間的差異。并構建受試者工作特征(receiver operator characteristics,ROC)曲線進一步驗證該模型的預測能力。結合TCGA數據庫中乳腺癌患者的臨床病理資料，用箱式圖驗證該模型中的lncRNA與BRCA患者T分期的關系。

1.4 統(tǒng)計學處理采用R 3.5.1處理數據，用單因素和多因素Cox回歸分析篩選與乳腺癌預后相關的lncRNA，建立風險模型，并用Kaplan-Meier生存分析和受試者工作特征(receiver operator characteristics,ROC)曲線檢驗該模型的辨別力,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 免疫相關lncRNA的獲取從TCGA數據庫得到368個差異表達的lncRNA。通過與ImmLnc數據庫中BRCA的lncRNA基因集進行匹配，選出了128個免疫相關的lncRNA。

2.2 免疫相關lncRNA對預后的影響單因素Cox回歸分析顯示，10個lncRNA(包括LINC00578、LINC01614、LINC00987、HOXB-AS1、HOXB-AS1、LINC00667、SH3BP5-AS1、MIR4435-2HG、LINC01235和HOTAIR)與BRCA患者的預后相關(P<0.05)。將以上變量(P<0.05)納入多因素Cox回歸分析，最終篩選出3個lncRNA(即LINC00578、NIFK-AS1、和LINC00667)是BRCA患者預后的獨立預后因素，以此建立與BRCA患者免疫相關lncRNA預后模型，根據中位風險評分將BRCA患者分為高風險組(模型評分>1.037 6)和低風險組(模型評分≤1.037 6)。Kaplan-Meier生存曲線表明，高風險組的生存時間明顯短于低風險組的生存時間(P<0.001)。低風險組和高風險組的5 a生存率分別為87.8.0%(95%CI：83.6%～92.1%)和76.2%(95%CI：70.7%～82.3%)。ROC曲線分析顯示，曲線下面積為0.706(95%CI：0.676～0.771，P<0.001)，具有良好的BRCA患者預后的辨別力。見表1、2，圖1、2。

圖1 高風險和低風險組的風險評分(A)和Kaplan-Meier生存曲線(B)

圖2 該模型預測BRCA患者的ROC曲線

表1 BRCA患者預后相關免疫相關lncRNA的單因素Cox回歸分析結果

2.3 該模型與臨床病理特征的關系為了進一步驗證該模型與臨床病理特征的關系，我們從TCGA數據庫下載1 039例BRCA患者的臨床病理資料。用箱式圖分析顯示，LINC00578、NIFK-AS1、和LINC00667與T分期關系密切(P<0.05)。見圖3。

圖3 3個免疫相關lncRNA與T分期的關系

表2 BRCA患者預后相關免疫相關lncRNA的多因素Cox回歸分析結果

3 討論

BRCA是高度異質性的惡性腫瘤，其具有基因組和遺傳多樣性的特點[11]。近年來，針對免疫檢查點的程序性死亡受體-1、程序性死亡受體-配體1抑制劑等新興免疫治療方法在腫瘤治療中發(fā)展迅速，并取得了一定的療效[12]。免疫治療在乳腺癌的治療中有廣泛的前景。然而，目前乳腺癌的治療仍有很大的改善空間，晚期BRCA患者的預后仍不理想。因此，有必要對BRCA的治療提出新的策略?；谶@些現狀，我們從TCGA數據庫中提取BRCA的轉錄組測序數據。由于lncRNA在機體的各種生物過程中發(fā)揮著廣泛的調控作用[9,13-14]，因此我們將研究重點放在lncRNA上，試圖找到免疫相關lncRNA，并建立預后模型。

由于腫瘤分子特征的復雜性，多種生物標志物能夠提高預后的準確性。本研究中，我們使用單因素Cox回歸分析篩選出10個與BRCA患者預后相關的免疫相關lncRNA。多因素Cox回歸分析鑒定出3個免疫相關lncRNA是BRCA患者獨立的預后因子，并建立BRCA患者的預后風險模型。該模型能夠較好預測BRCA患者的預后。且該模型在評估患者生存上有一定的優(yōu)勢。為了檢測該模型在臨床應用中的可行性，我們進一步聯(lián)合患者的臨床病理特征，驗證了模型中3個免疫相關lncRNA與臨床病理特征的關系。其可能與乳腺癌的惡性發(fā)展有關。

本研究中發(fā)現，lncRNA LINC00578在乳腺癌T分期晚期的患者中高表達，而NIFK-AS1和LINC00667的表達減少。查閱文獻發(fā)現，在這3個lncRNAs中，LINC00578與乳腺癌的自噬和乳腺癌干細胞相關[15-16]。NIFK-AS1的過表達抑制能夠子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲[17]。這些研究也進一步證實上述模型在BRCA患者預后中的價值。

綜上所述，我們證明了LINC00578、NIFK-AS1、和LINC00667等3個與免疫相關的lncRNA作為BRCA患者的預后模型，為免疫有關的研究和治療策略提供新的依據。然而，我們的研究仍有一些不足：首先，該研究是基于TCGA數據庫的一項探索性研究，患者信息更新不及時、檢測手段不一等均會影響數據的準確性。檢測本模型的有效性，仍需通過現實生活中的臨床病理資料進一步驗證。其次，盡管我們闡明了這些lncRNA在BRCA患者中的預后作用，他們作為免疫相關預后標志物的潛在機制尚不清楚，仍需進一步的廣泛驗證。