微小RNA加工剪切酶Dicer 1 rs1057035多態(tài)性與乳腺癌相關(guān)性研究

賈文遠(yuǎn)，蘆延峰，馮 巍，劉彩媛，秦豪杰，潘新民

(1.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471000；2.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 洛陽 471000)

乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致惡性腫瘤死亡的主要原因。2018年，約有210萬新病例，死亡人數(shù)達(dá)60余萬[1]。在發(fā)達(dá)國家，乳腺癌的5 a生存率為80%～90%，但在發(fā)展中國家卻很差[2-3]。乳腺癌已知的危險因素包括吸煙、大量飲酒、人工流產(chǎn)、初潮年齡過早和外源激素攝入等[4-5]，而遺傳因素亦在乳腺癌發(fā)病中發(fā)揮著極為重要的作用，其中微小RNA(micro RNA，miR)的作用近年來被逐漸加大研究。有研究[6]報道hsa-miR-146 rs2910164 GC和hsa-miR-196a2 rs11614913 CT基因型可能與北印度女性人群乳腺癌易感性相關(guān)。MiR-323b rs56103835 TT基因型增加了患者乳腺癌的發(fā)病年齡[7]。Bahreini等[8]的研究顯示，miR-559 rs58450758隱性基因型(TT)在乳腺癌患者中(23.3%)多于對照組(2%)，非顯性基因型(CT+TT)與乳腺癌易感性相關(guān)，生物信息學(xué)分析提示rs58450758可能改變了miR-559二級結(jié)構(gòu)，在miR前體區(qū)中形成新的Dicer位點。而miR加工剪切酶的遺傳變異，如位于Dicer1基因3’-UTR的rs1057035降低了結(jié)直腸癌和慢性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病風(fēng)險[9-10]。因此，本研究分析miR加工剪切酶Dicer1rs1057035多態(tài)性，探討其與中國漢族人群乳腺癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2017年1月至2019年12月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院的女性乳腺癌患者176例，年齡(50.73±11.07)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)女性；2)確診乳腺癌時無其他部位原發(fā)性腫瘤；3)病理診斷為乳腺導(dǎo)管癌；4)民族為漢族。排除標(biāo)準(zhǔn)：有乳腺癌家族史者。收集患者的臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)等臨床資料。2019年6月至12月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院的健康體檢女性216例，年齡(41.28±10.32)歲，民族為漢族，排除乳腺癌家族史者。

1.2 儀器與試劑ABI-9700型聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀(美國Thermo Fisher公司)；測序儀(美國Thermo Fisher公司)；D3024型臺式離心機(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司)；DYY-Ⅲ28A型垂直電泳儀(北京六一儀器廠)。全基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Taq酶購自寶生物工程大連有限公司；擴增引物購自上海百力格生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取 按試劑盒操作說明提取全基因組DNA。

1.3.2 基因分型Dicer1rs1057035擴增引物：5’-TGCAGTTGCTTTTTCAAGACA(上游)，5’-TGCAATGTGAGACCGAATGT(下游)。經(jīng)過3輪PCR擴增，電泳后切膠純化，對純化后產(chǎn)物進行測序，操作步驟按說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)，直接計數(shù)法計算Dicer1rs1057035不同基因型在2組研究對象中的分布，用χ2檢驗分析基因型分布是否符合Handy-Weinberg平衡，以比值比(odds ratio,OR)和95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)表示與乳腺癌風(fēng)險之間的相對風(fēng)險，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

Dicer1rs1057035在女性乳腺癌和健康體檢女性中基因型分布符合Handy-Weinberg平衡，在女性乳腺癌患者和健康體檢女性中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。Dicer1rs1057035等位基因T、C和基因型分布TT、CT、CC乳腺癌患病風(fēng)險差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(表2)。Dicer1rs1057035基因型分布與乳腺癌ER、PR、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)(表3)。

表1 2組Dicer 1 rs1057035等位基因、基因型分布比較 n(%)

表2 Dicer 1 rs1057035不同等位基因、基因型分布乳腺癌患病風(fēng)險比較

表3 Dicer 1 rs1057035基因型分布與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 n(%)

3 討論

MiR在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)過多種酶加工剪切成為前體，出細(xì)胞核后進一步加工成為成熟體，通過與靶RNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)內(nèi)的序列堿基配對，負(fù)向調(diào)節(jié)mRNA和蛋白翻譯。雖然miR不編碼蛋白質(zhì)，但是作為調(diào)控分子參與乳腺癌的病理生理過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、發(fā)育、代謝、侵襲、遷移和血管生成等。本課題組前期系統(tǒng)評價了miR前體區(qū)的單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)位于has-miR-196a2前體區(qū)的rs11614913多態(tài)性增加了乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險[11]。

Dicer1為miR加工剪切酶，在RNaseⅢ家族中對miR或小干擾RNA的產(chǎn)生起著至關(guān)重要的作用。Dicer及生成的miR與腫瘤又有著密切關(guān)系[12]。如Dicer1熱點區(qū)域突變?yōu)槁殉蔡卣餍缘姆肿硬±砀淖僛13]，人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7Dicer1表達(dá)明顯低于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A，過表達(dá)miR-186的MCF-7細(xì)胞中Dicer1表達(dá)明顯升高，說明miR-186通過靶向正調(diào)控Dicer1表達(dá)，抑制人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的侵襲、遷移能力[14]。

沉默Dicer1表達(dá)，能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，阻滯細(xì)胞周期分布，促進卵巢癌細(xì)胞凋亡[15]，Dicer基因低表達(dá)腫瘤更常表現(xiàn)出惡性程度高和預(yù)后差的特點[16]。而miR-590-3p在鼻咽癌中可通過靶向上調(diào)Dicer1表達(dá)，降低N-鈣黏蛋白的表達(dá)，進而抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[17]。有報道脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶可以降低二甲基苯蒽誘導(dǎo)的乳腺癌中miR-18a和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)并增加Dicer1的表達(dá)[18]。而miR-208a對乳腺癌和乳腺癌干細(xì)胞均有調(diào)控，以miR-208a-SOX2 /β-catenin-LIN28-let-7a-Dicer1調(diào)控反饋環(huán)在乳腺癌干細(xì)胞更新中發(fā)揮作用[19]。

曹文明等[20]研究65例乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)/BRCA2陰性家族性乳腺癌和100例健康女性發(fā)現(xiàn)，Dicer1rs2297730的G等位基因和A/G基因型在乳腺癌中的分布頻率顯著高于健康女性(OR=1.87,95%CI:1.17～2.99,P=0.008;OR=3.13,95%CI:1.56～6.29,P=0.004)。MiR-191/425簇與Dicer1的3’-UTR區(qū)結(jié)合，抑制Dicer1的表達(dá)，損害miR合成。通過miR-191或miR-425的強制表達(dá)，可刺激乳腺癌細(xì)胞的存活、增殖、遷移和侵襲；而抑制miR-191/425導(dǎo)致Dicer1的表達(dá)下調(diào)，則減輕了乳腺癌細(xì)胞的致癌性。此外，miR-191/425簇在體內(nèi)實驗促進了乳腺腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[21]，而且致癌的miR-146b也使Dicer1表達(dá)下調(diào)[22]，這些為基于RNA治療各種惡性腫瘤的方法(包括miR抑制劑)提供了思路。

ER、PR等免疫組化指標(biāo)的異常表達(dá)檢測對乳腺癌具有輔助診斷和預(yù)后評估價值[23]。而且，有報道三陰性乳腺癌術(shù)后輔助化療采用含鉑方案療效優(yōu)于非含鉑方案，且安全性良好[24]。促性腺激素釋放激素激動劑對激素受體陰性年輕乳腺癌輔助化療患者卵巢功能具有保護作用[25]，因此乳腺癌臨床病理特征與輔助治療和預(yù)后評估有關(guān)。但本研究中Dicer1rs1057035與乳腺癌ER、PR、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析未見顯著性差異。而且，本研究中Dicer1rs1057035不同基因型在女性乳腺癌人群和健康女性人群中也未觀察到顯著性差異。分析其原因：第一，可能是本研究樣本量不足，暫無法排除假陰性的結(jié)果；第二，乳腺癌發(fā)病是多因素交互作用的結(jié)果，本研究未考慮其他分層因素的影響；第三，本研究屬于回顧性研究，不可否認(rèn)存在樣本入選偏倚的風(fēng)險。因此，未來可考慮大樣本前瞻性研究驗證本結(jié)果。

綜上所述，Dicer1rs1057035多態(tài)性與中國漢族人群女性乳腺癌發(fā)生和乳腺癌ER、PR、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān)。進一步開展大樣本及不同種族的驗證性研究，有助于闡明Dicer1基因多態(tài)性對乳腺癌發(fā)病的影響。