高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)寧南霉素在人參中的殘留及消解規(guī)律

宋雨桐, 陸 洋, 尤慶航, 侯新港, 朱宗利, 孫曉偉,方 楠, 侯志廣, 梁 爽, 逯忠斌

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

人參Panax ginsengC. A. Mey 作為藥食同源中藥材，具有抗疲勞、調(diào)節(jié)血糖和抗氧化等功能[1-3]。但由于人參的生育周期較長(zhǎng)，使得人參易受疫病、灰霉病和根腐病等多種病害的侵?jǐn)_，造成人參產(chǎn)量損失高達(dá)20%～50%[4]。生產(chǎn)中主要應(yīng)用化學(xué)殺菌劑防治人參上的病害，但化學(xué)農(nóng)藥的過(guò)度使用不僅會(huì)造成環(huán)境污染，還會(huì)對(duì)食品安全與人體健康產(chǎn)生影響。因此選擇一種高效、安全、低毒、低殘留的殺菌劑防治人參疫病顯得尤為重要。

寧南霉素是一種從牛鏈球菌中分離的新型農(nóng)用抗生素殺菌劑，由中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所創(chuàng)制[5-6]，屬于胞嘧啶核苷肽型新抗生素農(nóng)藥，對(duì)植物病害具有良好防效，已廣泛用于治療多種作物上的病毒病、莖腐病和白粉病等病害[7]，但尚未在人參上登記使用。

目前，對(duì)寧南霉素殘留的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜-紫外檢測(cè)器[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[9-10]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[11]，但由于人參中含有皂苷、多糖、微量元素、揮發(fā)油等未知成分導(dǎo)致基質(zhì)過(guò)于復(fù)雜[12]，所以上述報(bào)道所采用的QuEChERS法和HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化后，并不完全適用于人參基質(zhì)。鑒于此，本研究通過(guò)改進(jìn)上述方法，優(yōu)化固相萃取凈化手段，建立了一種簡(jiǎn)單、高效測(cè)定人參中寧南霉素殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (HPLC-MS/MS) 分析方法。并通過(guò)1年4地的田間試驗(yàn)研究了寧南霉素在人參及其植株中的最終殘留量和消解動(dòng)態(tài)，旨在為寧南霉素在人參中最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)制定和指導(dǎo)寧南霉素的安全使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260-6470高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó) Agilent 公司)；FW-100型谷物粉碎機(jī) (天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ-250DE型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；YXJ-A型離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)；0.22 μm有機(jī)濾膜 (天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；VORTEX 3型渦旋儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；3205型食品加工機(jī)(博朗電器)；IKA RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；自制氮吹儀 (自制)；50 mL離心管 (Biosharp公司)。

寧南霉素 (ningnanmycin，純度95.0%) 標(biāo)準(zhǔn)品，德強(qiáng)生物股份有限公司；8%寧南霉素水劑(德強(qiáng)生物股份有限公司)；乙腈和甲醇 (色譜純)，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；氨水和濃鹽酸 (分析純)，北京化工廠；甲酸 (色譜純)，天津福晨化學(xué)試劑廠；純凈水 (杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；500 mg ProElut PLS固相萃取柱和500 mg ProElut PXC固相萃取柱 (北京迪馬科技有限公司)。

1.2 田間試驗(yàn)

田間試驗(yàn)于2019年分別在吉林省白山市、撫松縣、延吉市和遼寧省桓仁縣進(jìn)行。供試人參品種為大馬牙，供試藥劑為8%寧南霉素水劑，按《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[13]和《農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[14]設(shè)計(jì)農(nóng)藥消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)和最終殘留試驗(yàn)。小區(qū)面積為50 m2。在人參疫病發(fā)病初期，莖葉噴霧，施藥次數(shù)為2～3次。

1.2.1 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn) 在人參疫病發(fā)病初期，于人參植株莖葉噴霧施藥1次，施藥劑量為制劑量900 g/hm2(有效成分72 g/hm2)，分別于施藥后2 h及0、1、3、7、14、20、30和45 d采集人參植株樣品。

1.2.2 最終殘留試驗(yàn) 以制劑量900 g/hm2(有效成分72 g/hm2) 在人參疫病發(fā)病初期，于人參植株莖葉噴霧施藥3次，施藥間隔期為7 d，采收間隔期分別為14 和21 d，分別采集人參莖葉及人參(地下肉質(zhì)根部分) 樣品。每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)采集兩個(gè)獨(dú)立樣品，每個(gè)樣品單獨(dú)采集，處理間設(shè)保護(hù)帶。另設(shè)清水空白對(duì)照。

1.3 樣品前處理

1.3.1 干人參樣品的制備 按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[15]規(guī)定方法。稱取 ?20 ℃冷凍保存的鮮人參100 g，經(jīng)鍘刀切片后，于80 ℃烘箱中烘干 (寧南霉素的熔點(diǎn)為195 ℃) 24 h后取出，用食品加工機(jī)粉碎，過(guò)180 μm孔徑篩，于4 ℃保存，備用。

1.3.2 樣品的提取 準(zhǔn)確稱取5 g (精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸水溶液，使總水量為25 mL (約加入22 mL)，渦旋振蕩5 min后于4 000 r/min下離心5 min，取上清液，用定性濾紙過(guò)濾后待凈化。

1.3.3 樣品的凈化 PLS柱用3 mL甲醇、3 mL體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸水溶液預(yù)淋洗，棄去淋洗液。取5 mL提取液過(guò)柱，收集流出液，待PXC柱凈化。PXC柱用5 mL甲醇、5 mL水和 5 mL 30 mmol鹽酸溶液預(yù)淋洗，棄去淋洗液。取5 mL上述過(guò)PLS柱濾液再過(guò)PXC柱，待樣液流盡后用5 mL水、5 mL甲醇淋洗，棄去流出液。用12 mL體積比為4 : 1的氨水-甲醇溶液洗脫。收集洗脫液，于50 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約0.5 mL，氮?dú)獯蹈桑皿w積比為1 : 1的乙腈-0.2%甲酸水溶液稀釋，定容至2 mL，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。

1.4 檢測(cè)條件

色譜條件：Waters XSelect? HSS T3色譜柱(2.1 mm × 100 mm, 2.1 μm)，柱溫30 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積5 μL，流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-甲醇混合溶液，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 寧南霉素流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 The mobile phase gradient elution conditions for ningnanmycin

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描模式(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 (MRM)；霧化氣為氮?dú)猓混F化氣壓力0.31 MPa；毛細(xì)管電壓3 500 V；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；鞘氣溫度380 ℃；鞘氣流速11 L/min；寧南霉素定量離子對(duì)444.2 > 315.1，源內(nèi)碎裂電壓25 V，碰撞能16 V；定性離子對(duì)444.2 > 333.1，源內(nèi)碎裂電壓25 V，碰撞能12 V。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.01 g (精確至0.001 g)寧南霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為 1 000 mg/L 的寧南霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于0～4 ℃避光密封保存。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：用體積比為1 : 1的乙腈-0.2%甲酸水溶液的混合溶液稀釋寧南霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成 0.05、0.1、0.2、0.5、1和2 mg/L 的系列寧南霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，于0～4 ℃避光貯存，備用。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取空白鮮人參、人參植株和干人參樣品各5 g，按1.3節(jié)樣品前處理步驟處理后分別用寧南霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋，配成系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，外標(biāo)法定量。以寧南霉素質(zhì)量濃度 (x) 為橫坐標(biāo)，峰面積 (y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。

1.6 添加回收試驗(yàn)

分別向空白樣品中添加寧南霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，鮮人參和人參植株添加水平為0.1、0.2和1 mg/kg干人參添加水平為0.2、1和2 mg/kg。每個(gè)水平重復(fù)5次，另設(shè)空白對(duì)照。按1.4節(jié)條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

比較了甲醇 (含0.1%甲酸)-水 (含0.1%甲酸)、乙腈 (含0.1%甲酸)-水 (含0.1%甲酸)、甲醇-水 (含0.1%甲酸) 和乙腈-水 (含0.1%甲酸)4種不同的流動(dòng)相組合對(duì)寧南霉素色譜峰的影響。由圖1可知：當(dāng)有機(jī)相為甲醇 (含0.1%甲酸) (a)、乙腈 (含0.1%甲酸) (b) 時(shí)寧南霉素的響應(yīng)值明顯高于甲醇 (c)、乙腈 (d)，這是由于寧南霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其在正離子模式下，能與甲酸中的H+結(jié)合，可以更好地提高寧南霉素的離子化效率，提高整體的響應(yīng)值[16]。鑒于寧南霉素在酸性條件下更穩(wěn)定，所以向溶劑中加入0.1%甲酸，優(yōu)于純?nèi)軇?。無(wú)論是否添加0.1%的甲酸，當(dāng)有機(jī)相為甲醇時(shí)，寧南霉素的色譜峰分離程度與響應(yīng)值均明顯高于有機(jī)相為乙腈時(shí)，這是因?yàn)橄啾扔诜琴|(zhì)子性的乙腈，質(zhì)子性的甲醇對(duì)加氫峰的農(nóng)藥母離子測(cè)定其質(zhì)譜峰面積的響應(yīng)更大，而乙腈偏堿性，具有更強(qiáng)的質(zhì)子親和力，在ESI過(guò)程中更容易捕獲質(zhì)子使其自身離子化，從而抑制農(nóng)藥的加氫峰母離子生成，使農(nóng)藥質(zhì)譜峰面積響應(yīng)降低[17]?；谏鲜鰲l件優(yōu)化，選用甲醇 (含0.1%甲酸)-水 (含0.1%甲酸) 為流動(dòng)相。

2.2 提取溶劑與提取方法的優(yōu)化

由于寧南霉素易溶于水，可溶于甲醇，難溶于丙酮、苯等溶劑[18]，所以本研究選用了0.2%甲酸水溶液 (酸性)、10%甲醇水溶液 (中性) 和0.1%氨水溶液 (堿性) 3種不同pH值的水性溶劑進(jìn)行提取。結(jié)果表明：在提取溶劑中加入適量的甲酸可以使寧南霉素在提取溶劑中更加穩(wěn)定，回收率為99%，而在堿性條件下易分解失活，回收率僅為2.4%，因此采用0.2%甲酸水溶液作為提取溶劑。

試驗(yàn)通過(guò)比較渦旋振蕩法、超聲波法和勻漿法提取人參中寧南霉素的回收率發(fā)現(xiàn)，三者的回收率均在90%左右，但由于勻漿過(guò)程中需要反復(fù)清洗刀頭，操作過(guò)程復(fù)雜，且易產(chǎn)生交叉污染。超聲跟渦旋振蕩雖不存在交叉污染的問(wèn)題，但超聲所需時(shí)間較長(zhǎng)。綜合考慮，最終采用渦旋振蕩法提取5 min。

2.3 凈化方法的優(yōu)化

由于人參基質(zhì)含有皂苷、揮發(fā)油等多種成分，若提取后直接測(cè)定，會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的檢測(cè)產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，因此需對(duì)提取液凈化。分別考察了分散固相萃取法 (d-SPE) 和固相萃取法 (SPE) 對(duì)寧南霉素凈化效果的影響。

2.3.1 分散固相萃取法 樣品經(jīng)0.2%甲酸水溶液提取，采用分散固相萃取法，使用N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基甲硅烷基 (C18) 和石墨化碳黑(GCB) 凈化。結(jié)果表明：d-SPE法對(duì)人參中雜質(zhì)的去除能力差，吸附劑在吸附極性與非極性雜質(zhì)的同時(shí)也會(huì)吸附目標(biāo)化合物，從而降低了寧南霉素在質(zhì)譜的離子化程度。

2.3.2 固相萃取法 分別考察了PLS (6 mL，500 mg，DIKMA公司)、C18(6 mL，500 mg，DIKMA公司)、PXC (6 mL，500 mg，DIKMA公司) 、PEP (6 mL，200 mg，Agilent 公司) 和HLB (12 mL，500 mg，SUPELCO公司) 5種固相萃取柱的凈化效果。結(jié)果 (表2) 顯示：5種固相萃取柱單獨(dú)使用時(shí), 寧南霉素的回收率均未達(dá)到農(nóng)藥殘留分析要求[13]；而采用PLS＋PXC固相萃取柱串聯(lián)使用，很好地解決了人參基質(zhì)過(guò)于復(fù)雜導(dǎo)致的凈化效果不足和吸附交換能力不足等問(wèn)題，減少了寧南霉素在人參樣品中存在的雜質(zhì)干擾影響和回收率偏低兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。

表2 不同固相萃取柱對(duì)寧南霉素回收率影響Table 2 The influence of different SPE cartridges on ningnanmycin recoveries

2.4 方法的線性范圍、定量限、準(zhǔn)確度及精密度

結(jié)果如表3所示：在0.05～2 mg/L范圍內(nèi)，不同基質(zhì)中，寧南霉素的質(zhì)量濃度與響應(yīng)值有良好的線性關(guān)系。

表3 寧南霉素在人參中的線性范圍、回歸方程與定量限Table 3 Linear range, regression equation and limit of quantification of ningnanmycin in ginseng

由表4可知：寧南霉素在鮮人參中的平均回收率為90%～99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 為4.7%～5.6%；在人參植株中的平均回收率為92%～94%，RSD為4.0～5.6%；在干人參中的平均回收率為89%～95%，RSD為1.4%～10%。該結(jié)果表明所選定的方法符合農(nóng)藥殘留分析的要求[13]。

表4 寧南霉素在人參中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n = 5)Table 4 The recoveries and relative standard deviation of ningnanmycin in ginseng (n = 5)

2.5 寧南霉素在人參植株中的消解動(dòng)態(tài)

2019年白山、桓仁兩地人參植株上的消解動(dòng)態(tài)結(jié)果見(jiàn)表5。從中可看出，由于寧南霉素易降解的特性導(dǎo)致寧南霉素在人參植株中消解較快，且本試驗(yàn)的LOQ為0.1 mg/kg等原因，導(dǎo)致消解動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)中的部分?jǐn)?shù)值低于本試驗(yàn)的LOQ，致使消解曲線擬合時(shí)少于5個(gè)點(diǎn)，擬合的曲線R2值不高，所以本試驗(yàn)以3倍信噪比計(jì)算出寧南霉素的檢出限 (LOD) 為0.02 mg/kg，以高于LOD的數(shù)值模擬建立一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，得到的半衰期為0.76 d(桓仁)、11.77 d (白山)。寧南霉素在白山人參植株中的消解要比桓仁慢，可能與噴灑過(guò)程中人參植株的受藥面積和采樣均勻程度有關(guān)，還可能是受寧南霉素自身的理化性質(zhì)影響，由于寧南霉素屬于生物農(nóng)藥，極易被日光、植物或土壤微生物分解，而在試驗(yàn)過(guò)程中桓仁的平均日照數(shù)、施藥期間的降雨量和平均氣溫均大于白山，導(dǎo)致寧南霉素在白山人參植株中的半衰期較長(zhǎng)。

表5 寧南霉素在人參植株中的消解動(dòng)態(tài)Table 5 Dissipation dynamics of ningnanmycin in ginseng plants

2.6 寧南霉素在人參中的最終殘留量

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。從中可以看出，寧南霉素在鮮人參和干人參上的最終殘留量均低于LOQ；在人參植株上的最終殘留量為

表6 寧南霉素在人參中的最終殘留量Table 6 Terminal residues of ningnanmycin in ginseng

3 結(jié)論與討論

本研究建立了固相萃取法檢測(cè)人參中寧南霉素殘留的分析方法，比較了不同酸堿度提取體系與不同提取方式對(duì)寧南霉素回收率的影響，考察了不同固相萃取柱對(duì)其凈化效果的影響，優(yōu)化了前處理提取和凈化的過(guò)程。該方法簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確，通過(guò)以PLS+PXC固相萃取柱萃取，有效地實(shí)現(xiàn)了樣品凈化，通過(guò)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量，方法驗(yàn)證結(jié)果符合中國(guó)《農(nóng)作物中殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》要求。

應(yīng)用所建立的方法檢測(cè)吉林省白山市、撫松縣、延吉市及遼寧省桓仁縣人參中寧南霉素的殘留量。結(jié)果表明，寧南霉素在人參植株上估算半衰期為0.76～11.77 d。當(dāng)樣品采收間隔期為14、21 d時(shí)，鮮人參和干人參中寧南霉素的殘留量均低于LOQ；人參植株中寧南霉素的殘留量為

目前我國(guó)規(guī)定寧南霉素在稻米與糙谷中的臨時(shí)限量為0.2 mg/kg、在番茄、黃瓜和蘋果中的臨時(shí)限量為1.0 mg/kg、在香蕉中的臨時(shí)限量為0.5 mg/kg[19]，暫未設(shè)定寧南霉素在人參中的最大殘留限量 (MRL)。綜上所述，為達(dá)到防治人參疫病同時(shí)降低農(nóng)藥殘留的目的，建議我國(guó)寧南霉素在鮮人參中的MRL值為0.2 mg/kg，人參植株中的MRL值為0.5 mg/kg，干人參中的MRL值為0.5 mg/kg。建議將8%寧南霉素水劑在人參上登記使用，并推薦其用于防治人參疫病時(shí)，推薦施藥劑量675～900 g/hm2(有效成分54～72 g/hm2) 施藥3次，安全間隔期為14 d，收獲期人參安全。