甲草胺對(duì)非靶標(biāo)生物的毒理學(xué)研究進(jìn)展

歐陽(yáng)康, 馮唐奇, 明 坤, 方國(guó)斌, 許凌風(fēng), 馬洪菊*,

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2. 第四儲(chǔ)備資產(chǎn)管理局 哈爾濱管理站，哈爾濱 150030；3. 湖北省植物保護(hù)總站，武漢 430070)

甲草胺 (alachlor) 屬于氯乙酰胺類除草劑，是一種選擇性芽前土壤處理劑，主要通過抑制超長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶 (very-long-chain fatty acid elongase,VLCFAE) 的活性，從而阻礙超長(zhǎng)鏈脂肪酸 (verylong-chain fatty acid, VLCFA) 的生物合成發(fā)揮除草作用，對(duì)于出苗前土壤中萌發(fā)的雜草具有很好的防治效果，適用于大豆、花生、水稻等作物田防除一年生禾本科及部分闊葉雜草[1]。

甲草胺由美國(guó)孟山都公司于1966年研發(fā)，1969年商品化，在20世紀(jì)70年代被中國(guó)引進(jìn)，并逐步被廣泛使用，至20世紀(jì)末甲草胺已成為國(guó)際上應(yīng)用最為廣泛的除草劑之一[2]。然而，隨著甲草胺使用量的增加，其對(duì)非靶標(biāo)生物以及生態(tài)環(huán)境的影響也越來越受到人們的關(guān)注。

甲草胺在大田中的消解途徑主要為微生物降解和揮發(fā)，其次為光解、化學(xué)降解、滲漏、地表徑流和被植物吸收等。微生物降解和吸附主要發(fā)生在土壤表面，甲草胺一旦進(jìn)入根區(qū)以下，一般降解緩慢。由于甲草胺對(duì)土壤的吸附親和力較低，而在水體中的溶解度較高，并且具有較強(qiáng)的流動(dòng)性，導(dǎo)致在地表水或地下水中甲草胺常常被檢出[3]。有研究報(bào)道，氯乙酰胺類除草劑除具有本身特性外，其降解產(chǎn)物毒性更強(qiáng)[4-6]。因此，環(huán)境中殘留的甲草胺對(duì)非靶標(biāo)生物以及生態(tài)環(huán)境的潛在風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。

自20世紀(jì)80—90年代以來，國(guó)內(nèi)外對(duì)甲草胺毒理學(xué)展開了相關(guān)研究，明確了甲草胺在高濃度下具有致畸性及內(nèi)分泌干擾活性[7-8]，因此甲草胺已被部分國(guó)家或地區(qū)禁用。加拿大農(nóng)業(yè)部宣布自1985年12月31日起，禁止美國(guó)孟山都公司除草劑甲草胺的銷售[9]；日本國(guó)立研究所也因?yàn)榧撞莅肪哂兄禄约皟?nèi)分泌干擾活性，而將其列入具有內(nèi)分泌干擾作用的黑名單[10]；在2011年6月20—24日，鹿特丹公約第五次會(huì)議決定將甲草胺列入《鹿特丹公約》附件三，自2011年10月24日起適用事先知情同意程序[11]。甲草胺原藥和制劑在中國(guó)多個(gè)農(nóng)藥生產(chǎn)廠家仍具有登記，然而，目前關(guān)于甲草胺毒理學(xué)研究較為零散，缺乏系統(tǒng)性總結(jié)與歸納?；诖?，本文擬從急性毒性、慢性毒性和氧化應(yīng)激效應(yīng)等方面綜述甲草胺對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性效應(yīng)(表1)，旨在為甲草胺的環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)資料。

表1 甲草胺對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性效應(yīng)Table 1 Toxic effects of alachlor to non-target organisms

1 急性毒性

藻類是淡水水體中常見的類群，對(duì)群落初級(jí)生產(chǎn)及富營(yíng)養(yǎng)水體的凈化起著重要作用。甲草胺對(duì)藻類生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。Paule[12-13]等研究了光營(yíng)養(yǎng)生物膜群落對(duì)甲草胺的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，群落中藻類細(xì)胞的數(shù)量和甲草胺濃度呈顯著的負(fù)相關(guān)，甲草胺能顯著抑制光營(yíng)養(yǎng)生物膜的生長(zhǎng)。甲草胺對(duì)普通小球藻Chlorella vulgaris的96 h的EC50值為5.54 mg/L，當(dāng)甲草胺的質(zhì)量濃度為0.8、1.6、3.2、6.4和12.8 mg/L時(shí)，抑制率分別為37%、39%、44%、48%和62%；該研究還表明，甲草胺通過影響普通小球藻葉綠素a的含量從而對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響[14-15]。甲草胺對(duì)鞭毛藻Ostreococcus lucimarinus的72 h的EC50值為0.373 mg/L，隨著甲草胺劑量的增加和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，其光合效率和葉綠素含量顯著降低，光合作用相關(guān)基因PmpsbA、PmatpB和PmrbcL的轉(zhuǎn)錄水平均被顯著誘導(dǎo)上升[16]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，甲草胺對(duì)馬昆德擬青霉菌Paecilomyces marquandii和菲氏弧菌Vibrio fischeri的生長(zhǎng)均有抑制作用，其EC50值分別為50.0和72.4 mg/L[17-18]。Hirase等[19]研究發(fā)現(xiàn)，2.7 mg/L的甲草胺暴露可顯著抑制高粱芽長(zhǎng)，抑制率達(dá)50%以上。EINahhal等[20]研究發(fā)現(xiàn)，甲草胺暴露對(duì)甜瓜、苦菜和小麥生長(zhǎng)均有抑制作用，其48 h的EC50值分別為11.37、0.11和3.91 mg/kg，表明不同作物對(duì)甲草胺敏感性不同。

2 慢性毒性

2.1 致畸、致癌和致突變

畸形 (malformation) 是指發(fā)育生物體解剖學(xué)上形態(tài)結(jié)構(gòu)的缺陷，致畸試驗(yàn)是有毒物質(zhì)的安全性毒理評(píng)價(jià)的重要組成部分。Park等[21]研究表明，甲草胺對(duì)斑馬魚Danio rerio胚胎具有致畸效應(yīng)，隨著甲草胺暴露質(zhì)量濃度 (1、3、5、8、10 mg/L)的增加，斑馬魚胚胎孵化率逐漸降低，并出現(xiàn)心包囊水腫、游囊關(guān)閉、軀干彎曲等癥狀。斑馬魚幼魚在10 mg/L的甲草胺暴露下會(huì)出現(xiàn)體型彎曲、水腫以及活動(dòng)遲緩等形態(tài)學(xué)異?，F(xiàn)象[22]。大比目魚Hippoglossus stenolepis幼蟲在1 mg/L的甲草胺暴露下表現(xiàn)出發(fā)育缺陷，包括心包水腫和骨骼畸形[23-24]。此外，還有研究表明，甲草胺對(duì)兩棲動(dòng)物的形態(tài)發(fā)育具有毒性作用。例如：甲草胺對(duì)非洲爪蟾Xenopus laevis胚胎具有致畸性，其致畸指數(shù) (teratogenic index, TI) 為1.7[25]；1.25、2.5、5和10 mg/L的甲草胺暴露可導(dǎo)致東方鈴蟾Bombina orientalis發(fā)育畸形，包括軀干彎曲、尾彎、體厚和腹面水皰，其畸形率呈濃度依賴性增加[7]。

美國(guó)環(huán)境保護(hù)署于1984年對(duì)甲草胺的風(fēng)險(xiǎn)性開展過全方位評(píng)估，通過甲草胺在大鼠上的試驗(yàn)證實(shí)了甲草胺對(duì)哺乳動(dòng)物有致腫瘤的可能性[26]。有學(xué)者在此基礎(chǔ)上對(duì)甲草胺的致癌機(jī)制展開了進(jìn)一步研究。Nelson等[27]研究發(fā)現(xiàn)，1 mg/mL的甲草胺和小牛胸腺DNA在體外能形成加合物，而DNA加合物的形成是藥劑致癌過程的關(guān)鍵一步[28]，同時(shí)闡明了甲草胺潛在致癌的可能性機(jī)制。以甲草胺126 mg/(kg·d) 的劑量持續(xù)飼喂雄性大鼠120 d，其甲狀腺濾泡上皮出現(xiàn)肥大、肝臟尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性和血清促甲狀腺激素水平顯著增加，這些均與大鼠甲狀腺腫瘤發(fā)病相關(guān)[29]。Genter等[30]用260mg/(kg.d)劑量的甲草胺連續(xù)3個(gè)月飼喂小鼠，發(fā)現(xiàn)其嗅覺黏膜形態(tài)異常，黏膜內(nèi)嗜酸性物質(zhì)明顯積累。Genter進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，甲草胺能誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2) 和MMP-9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9) 基因表達(dá)顯著上調(diào)，MMP抑制劑能降低經(jīng)甲草胺處理的大鼠的腫瘤發(fā)病率[31]。

甲草胺能誘導(dǎo)生物產(chǎn)生突變。研究發(fā)現(xiàn)，甲草胺暴露可導(dǎo)致大鼠和小鼠的骨髓細(xì)胞出現(xiàn)染色體損傷，其染色體畸變頻率呈劑量依賴性增加[32-33]。甲草胺暴露能導(dǎo)致人外周血淋巴細(xì)胞姐妹染色單體交換的頻率顯著增加和染色體畸變的形成，表明甲草胺會(huì)導(dǎo)致人外周血淋巴細(xì)胞染色體損傷[34-35]。甲草胺處理后能顯著增加胡盧巴Trigonella foenum-graecum細(xì)胞染色體畸變率，且其有絲分裂指數(shù)呈濃度依賴性降低，表明甲草胺對(duì)胡盧巴具有遺傳毒性[36]。Torres等[37]研究發(fā)現(xiàn)，甲草胺能誘導(dǎo)黑腹果蠅Drosophila melanogaster性狀改變，270 mg/L的甲草胺暴露可導(dǎo)致黑腹果蠅翅斑總斑點(diǎn)的頻率顯著增加。Bonfanti等[38]研究發(fā)現(xiàn)，108 mg/L的甲草胺能誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞體外活化，導(dǎo)致DNA損傷。Ribas等[39]對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞電泳 (single cell gel electrophoresis, SCGE) 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)甲草胺暴露可導(dǎo)致人外周血淋巴細(xì)胞DNA斷裂損傷。鯉魚暴露于10、25、50和100 μg/L的甲草胺中4 d，其血細(xì)胞中DNA鏈出現(xiàn)斷裂，并呈現(xiàn)濃度依賴性增加[40]。虹鱒魚Oncorhynchus mykiss在1.52、3.44和7.60 μg/L的甲草胺中暴露10 min，其性腺細(xì)胞DNA鏈出現(xiàn)明顯斷裂，暴露30 min后性腺細(xì)胞DNA鏈斷裂較對(duì)照組顯著增加[41]。此外，甲草胺能誘導(dǎo)藍(lán)藻產(chǎn)生不同類型突變，包括對(duì)有毒化學(xué)物質(zhì)耐受性的正向突變、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變和原生營(yíng)養(yǎng)體突變[42-43]。

2.2 內(nèi)分泌干擾效應(yīng)

多種酰胺類除草劑屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptors, EEDs)，具有內(nèi)分泌干擾活性。環(huán)境雌激素是一類具有干擾生物體內(nèi)正常內(nèi)分泌物質(zhì)的合成、運(yùn)輸、代謝等過程，從而破壞機(jī)體內(nèi)部穩(wěn)態(tài)的化合物。據(jù)報(bào)道，甲草胺具有雌激素活性，能與生物體內(nèi)雌二醇競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合雌激素受體，進(jìn)而影響生物正常生命活動(dòng)[44-45]。以50 mg/(kg·d) 劑量的甲草胺飼喂大鼠30 d后發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠睪丸和甲狀腺的相對(duì)質(zhì)量增加，雌性大鼠卵巢的相對(duì)質(zhì)量下降，雌鼠血漿中甲狀腺激素T4和睪酮T的含量顯著減少[8]。甲草胺對(duì)人類精子的運(yùn)動(dòng)也有一定影響，暴露于甲草胺 (0、48、100、240和500 mg/L) 后，活精子率、游動(dòng)精子率和精子流速均呈濃度依賴性下降[46]。

水環(huán)境是很多環(huán)境污染物的聚集地，魚類是用來研究?jī)?nèi)分泌干擾作用的理想水生生物。低濃度的甲草胺 (250 μg/L) 暴露對(duì)鯽魚Carassius auratus有內(nèi)分泌干擾作用，可抑制鯽魚的肝臟和精巢的生長(zhǎng)、發(fā)育，破壞精巢結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致性腺指數(shù)和肝指數(shù)顯著下降；甲草胺暴露還能導(dǎo)致鯽魚體內(nèi)的血清雌二醇、促甲狀腺激素和甲狀腺激素水平顯著上升，睪酮水平顯著下降，鯽魚體內(nèi)雌二醇/睪酮值顯著增加，表明甲草胺能顯著干擾其體內(nèi)性激素平衡[47-49]。由此可見，甲草胺可影響非靶標(biāo)動(dòng)物生殖細(xì)胞正常發(fā)育，導(dǎo)致生物體內(nèi)激素水平的失衡，但其具體致毒機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

3 氧化應(yīng)激效應(yīng)

生物體內(nèi)氧化和抗氧化作用失衡會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生氧化應(yīng)激，抗氧化劑酶可清除生物體內(nèi)過量的活性氧自由基，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)活性氧平衡和保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷具有關(guān)鍵作用。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 和過氧化氫酶 (catalase,CAT) 是生命體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的第一道防線，其活性的變化可作為誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志。研究表明，用50 mg/L的甲草胺處理淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus48 h，該霉的SOD和CAT活性顯著降低，處理96 h后其CAT活性被誘導(dǎo)升高[50]。5和50 mg/L的甲草胺暴露可顯著抑制萵苣和豌豆種子中SOD和CAT活性，但萵苣和豌豆葉片經(jīng)5 mg/L的甲草胺處理后，其SOD和CAT活性顯著增加，表明萵苣和豌豆種子較葉片對(duì)甲草胺更為敏感[51]。Kim等[52]研究發(fā)現(xiàn)，單角輪蟲Brachionus koreanus暴露于300 μg/L的甲草胺24 h后，體內(nèi)總SOD蛋白酶的活性顯著降低，Bk-Cu/Zn-SOD轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而Bk-Mn-SOD轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照無顯著差異。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase, GST) 是參與宿主細(xì)胞解毒的關(guān)鍵酶。Jin-Clark等[53]研究發(fā)現(xiàn)，1 mg/L的甲草胺暴露使水搖蚊Chironomus tentansGST的總活性降低50%，乙酰膽堿酯酶 (acetylcholine esterase, AChE) 活性降低30%。將水搖蚊暴露于1、10、100和 1 000 μg/L的甲草胺72 h，其體內(nèi)GST活性呈濃度依賴性降低，在100和1 000 μg/L處理組中，GST的活性分別降低了65.5%和73.5%，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CtGSTs2和CtGSTs3的轉(zhuǎn)錄水平和甲草胺的暴露濃度呈顯著正相關(guān)[54]。將釀酒酵母暴露于400 mg/L的甲草胺，其細(xì)胞內(nèi)活性氧含量顯著增加，谷胱甘肽的產(chǎn)生受到抑制，而其利用率卻顯著增加，表明谷胱甘肽在保護(hù)細(xì)胞免受甲草胺侵害方面具有重要作用[55]。低濃度的甲草胺持續(xù)暴露也能導(dǎo)致生物體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)。持續(xù)低濃度 (1、4、16 μg/L)的甲草胺暴露60 d會(huì)對(duì)鯽魚肝臟谷胱甘肽 (glutathione, GSH)、解毒代謝關(guān)鍵酶GST和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生干擾[56]。在0.175 mg/L的甲草胺中暴露30 d，尼羅羅非魚Oreochromis niloticus的血清、腦和腎臟中AChE和GST的活性均顯著增加，并出現(xiàn)了輕微的組織損傷[57]。

甲草胺暴露可導(dǎo)致生物體內(nèi)活性氧自由基的積累，即使在安全劑量下，甲草胺也能誘導(dǎo)生物體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，干擾相關(guān)酶活性，影響生物正常生命活動(dòng)。生物體內(nèi)的抗氧化酶活性以及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化有助于對(duì)甲草胺暴露后產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化損傷起到保護(hù)作用。

4 其他毒性

甲草胺能抑制生物的生長(zhǎng)發(fā)育，干擾生物體內(nèi)能量合成及代謝。甲草胺對(duì)游離和固定化藍(lán)藻Cyanobacteria的生長(zhǎng)速率均表現(xiàn)出顯著的抑制作用，在25 mg/L的甲草胺中暴露8 d，藍(lán)藻的葉綠素a含量、蛋白質(zhì)含量和異形胞頻率均被抑制[58]。淡水魚龐克雷龍魚Channa punctata暴露于亞致死濃度 (1.2 mg/L) 的甲草胺中10 d，其體內(nèi)能量來源糖原和總蛋白質(zhì)含量均顯著降低，相關(guān)代謝酶天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和乳酸脫氫酶活性被誘導(dǎo)上升[59]。甲草胺暴露能顯著延長(zhǎng)豚草條紋葉甲Zygogramma suturalis的發(fā)育時(shí)間，其種群生長(zhǎng)參數(shù)和繁殖力均顯著降低[60]。

細(xì)胞毒性是指化學(xué)物質(zhì)作用于細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)或生理過程，影響細(xì)胞存活、增殖和功能的紊亂等。27 mg/L甲草胺暴露能破壞虹鱒魚性腺RTG-2和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系的細(xì)胞質(zhì)膜完整性[61]。還有研究表明，7.6 μg/L的甲草胺暴露能顯著抑制虹鱒魚性腺RTG-2細(xì)胞系活力，其生長(zhǎng)率呈濃度依賴性降低[41]。淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞的一種，由淋巴器官產(chǎn)生，是生物體免疫應(yīng)答功能的重要組成部分。甲草胺對(duì)鯽魚淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，其抑制中濃度 (IC50)為 27.7 μg/L；當(dāng)甲草胺的質(zhì)量濃度大于7 μg/L時(shí)，淋巴細(xì)胞增殖受到明顯抑制，表明其對(duì)鯽魚存在免疫毒性[62]。甲草胺 (54 mg/L) 還能誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞系細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響機(jī)體對(duì)病原體的免疫應(yīng)答[63]。鯉魚Cyprinus carpio在2.4 mg/L的甲草胺中暴露28 d，其平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度顯著降低，出現(xiàn)貧血狀態(tài)[64]。

5 總結(jié)

雜草苗前防治對(duì)田間雜草的控制至關(guān)重要。氯乙酰胺類除草劑是目前世界上使用量最多的芽前除草劑，對(duì)未出芽雜草具有很好的防治效果，并具有廣譜、低殘留等特性，被廣泛應(yīng)用于田間防除多種禾本科雜草和闊葉雜草，以乙草胺、丁草胺、異丙甲草胺等為代表的氯乙酰胺類除草劑在中國(guó)乃至全球市場(chǎng)占據(jù)重要的地位[65-66]，然而其帶來的生態(tài)環(huán)境以及人類健康問題也不容忽視。氯乙酰胺類除草劑對(duì)哺乳動(dòng)物急性毒性較低，但是對(duì)浮游動(dòng)物以及低等脊椎動(dòng)物毒性較高。此外，有研究表明，氯乙酰胺類除草劑 (如乙草胺、丙草胺、丁草胺和異丙甲草胺等) 能導(dǎo)致非靶標(biāo)生物產(chǎn)生氧化應(yīng)激和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，并具有致畸、致癌的風(fēng)險(xiǎn)[67-69]。然而，不同種類的氯乙酰胺類除草劑對(duì)非靶標(biāo)生物的致毒機(jī)制不同，不同生物對(duì)其敏感性也不同，如乙草胺可作為雌激素活性物質(zhì)干擾斑馬魚甲狀腺和性腺的發(fā)育[70-71]，異丙甲草胺可通過干擾雄性大鼠芳香化酶的合成，進(jìn)而影響類固醇激素的合成[72]。因此，開展酰胺類除草劑對(duì)非靶標(biāo)生物的毒理學(xué)研究，比較分析酰胺類除草劑對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性差異，對(duì)于酰胺類除草劑科學(xué)合理使用以及其安全性評(píng)價(jià)具有重要意義。

本文以甲草胺的毒理學(xué)研究為側(cè)重點(diǎn)，系統(tǒng)總結(jié)了甲草胺對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性效應(yīng)。綜上所述，甲草胺能抑制水生生物的生長(zhǎng)發(fā)育，造成水生生物的形態(tài)異常。此外，甲草胺具有內(nèi)分泌干擾活性，能干擾生物體內(nèi)激素的穩(wěn)態(tài)，影響性腺的發(fā)育，導(dǎo)致生殖毒性；多項(xiàng)研究證實(shí)甲草胺能誘導(dǎo)生物產(chǎn)生突變，并對(duì)哺乳動(dòng)物存在致癌的可能。有關(guān)甲草胺對(duì)非靶標(biāo)生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)潛在的致毒機(jī)制有待進(jìn)一步研究；甲草胺在環(huán)境介質(zhì)中的遷移、富集對(duì)人類的風(fēng)險(xiǎn)也不容忽視。