寧夏部分地區(qū)奶牛球蟲感染情況調(diào)查與遺傳進化分析

趙洪喜，劉繼兵

(寧夏大學 農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021)

牛球蟲屬于原生動物門(Sporozoa)復頂亞門(Apicomlexa)孢子蟲綱(Sporozoa)球蟲目(Coccidia)艾美爾科(Eimeriidae)艾美爾屬(Eimeria)和等孢子屬(Isospora)[1]。奶牛球蟲病主要由艾美爾屬球蟲引起，目前已報道的牛球蟲種類共有21種，在中國共有13種，其中大部分為低致病性，只有牛艾美爾球蟲和邱氏艾美爾球蟲能夠引起犢牛嚴重疾病[2-4]；放牧條件下，阿拉巴艾美爾球蟲被認為是優(yōu)勢蟲種。奶牛球蟲病主要危害3周到12個月的犢牛，臨床上以水樣和血樣糞便為主，有時會出現(xiàn)腸黏膜破壞、腹痛、發(fā)熱、脫水、虛弱、厭食和體重減輕等并發(fā)癥[5]。成年奶牛以亞臨床表現(xiàn)為主，但其排泄的球蟲卵囊會長期存在于養(yǎng)殖環(huán)境，引起奶牛場潛在損失，導致動物飼料消耗增多、營養(yǎng)不良、生長不良和體重下降等[6]。奶牛球蟲病給世界各地的畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。Koutny等[7-8]報道，在全球范圍內(nèi)每年因球蟲造成的損失約為7.23億元。

奶牛業(yè)作為寧夏的支柱和優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，其平均奶產(chǎn)量和奶牛單產(chǎn)均位居國內(nèi)前列；但在奶牛的養(yǎng)殖過程中，由于技術(shù)、人員、條件等因素的限制，對奶牛球蟲病的檢測與診斷、流行病學、防控技術(shù)等方面了解和認識不夠，以及缺少必要的疫苗，使得該病在奶牛養(yǎng)殖過程中時有發(fā)生，嚴重影響奶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本研究對寧夏部分規(guī)?；膛龅那蛳x病發(fā)病情況進行調(diào)查，并對陽性樣品進行培養(yǎng)和鑒定，同時進行18S rRNA基因的克隆、測序與進化分析，為從分子水平上研究寧夏地區(qū)奶牛球蟲的進化關(guān)系、確定其分類學地位提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 糞樣采集

2019年6—10月從寧夏吳忠、石嘴山、賀蘭地區(qū)5個不同規(guī)?；膛霾杉迈r犢牛腹瀉糞便樣品179份，分別裝入自封袋帶回實驗室檢測。

1.2 檢測方法

利用飽和NaCl溶液飄浮法和麥克馬斯特蟲卵計數(shù)法記錄并統(tǒng)計球蟲形態(tài)與種類。具體方法如下：稱取2 g糞便加入盛有20 mL飽和NaCl溶液的燒杯中，充分攪拌均勻后靜置10～20 min，用60目銅篩過濾，棄掉濾渣。吸取適量濾液滴注于改良麥氏蟲卵計數(shù)板中，顯微鏡下統(tǒng)計每g糞便卵囊數(shù)(OPG)(NOPG=A×200，A為改良麥氏記數(shù)板下數(shù)到的卵囊數(shù))，每個糞樣檢測3次，取平均值。

1.3 卵囊形態(tài)觀察與鑒定

將顯微鏡觀察有球蟲卵囊的陽性糞樣放入1 000 mL燒杯中，加適量飽和NaCl溶液，用玻璃棒搗碎并充分混勻，靜置20 min。經(jīng)60目銅篩過濾，將濾液以4 000×g離心20 min。棄沉淀。取上清液，加10倍的清水，4 000×g離心20 min，棄上清液，取沉淀放入裝有2.5%重鉻酸鉀溶液的培養(yǎng)皿中，置于28 °C恒溫箱中培養(yǎng)使其完全孢子化。然后將孢子化后的卵囊液置于Motic光學顯微鏡下觀察孢子化卵囊的結(jié)構(gòu)，按照符敖齊等[9]和Flori?o等[10]的方法，通過觀察卵囊、孢子囊和子孢子的形態(tài)、顏色、大小等，對奶牛球蟲進行鑒定。

1.4 卵囊基因組DNA提取

參考龔振興[11]的方法，取適量卵囊液，加入直徑0.5 mm的玻璃珠，置于旋渦振蕩儀上振蕩10 s，至鏡檢時視野中95%以上的卵囊壁破碎為止。用基因組DNA提取試劑盒提取孢子化卵囊DNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 18S rRNA基因片段的PCR擴增

根據(jù)Genbank公布的牛艾美爾球蟲屬的18S rRNA序列設(shè)計1對通用引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列如下：上游引物：5′-GATACCGTCGTAATCTCTACCATAA-3′；下游引物：5′-ATCCATTGCTGAAAGTTTTTCTACT-3′。PCR擴增反應(yīng)體系50 μL：Premix ExTaq25 μL，上、下游引物(20 μmol·L-1)各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察擴增結(jié)果。

1.6 18 S rRNA基因克隆與序列分析

擴增產(chǎn)物用Agarose Gel DNA Puirfication Kit (TaKaRa)試劑盒切膠回收，并將回收產(chǎn)物與T-easy vetor(Promega)連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中，用含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆，陽性克隆經(jīng)PCR鑒定、測序。測序結(jié)果用BLASTn和DNAstar軟件比對分析，將與該序列相似度較高的GenBank中已登錄的序列下載至本地，利用MEGA7軟件進行多序列比對，并進行同源性分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 寧夏地區(qū)奶牛球蟲感染情況

2.1.1 不同奶牛場球蟲感染率與OPG值

由表1可知，寧夏吳忠、石嘴山、賀蘭地區(qū)5個規(guī)?；膛鼍嬖谇蛳x感染，感染率分別為50.00%、80.84%、50.50%、55.56%和40.00%，平均感染率為56.98%。在檢出的99頭陽性奶牛中，最大的OPG值為4 800。各奶牛場平均OPG值為1 358，其中牧場2的最高，平均OPG值為2 752(表1)。

表1 奶牛場球蟲感染率與OPG值Table 1 Infection rate and OPG of coccidia in dairy farms

2.1.2 球蟲卵囊的鑒定

根據(jù)符敖齊等[9]的球蟲鑒別方法，對奶牛場陽性樣品的孢子化卵囊進行了初步鑒定。結(jié)果顯示：5個奶牛場共存在6種艾美爾屬奶牛球蟲(圖1)，即牛艾美爾球蟲(Eimeriabovis)、邱氏艾美爾球蟲(Eimeriazurnii)、柱狀艾美爾球蟲(Eimeriacylindriac)、橢圓艾美爾球蟲(Eimeriaellipsoidalli)、加拿大艾美爾球蟲(Eimeriacanadensis)、皮利他艾美爾球蟲(Eimeriapellita)；其中，牛艾美爾球蟲和邱氏艾美爾球蟲為優(yōu)勢蟲種，其感染率分別為29.05%(52/179)、24.02%(43/179)；未發(fā)現(xiàn)等孢子屬奶牛球蟲。

A，邱氏艾美爾球蟲；B，柱狀艾美爾球蟲； C，牛艾美爾球蟲； D，加拿大艾美爾球蟲；E，皮利他艾美耳球蟲；F，橢圓艾美爾球蟲。A， Eimeria zurnii; B， Eimeria cylindriac; C， Eimeria bovis; D， Eimeria canadensis; E， Eimeria pellita; F， Eimeria ellipsoidalis.圖1 球蟲孢子化卵囊顯微鏡觀察圖Fig.1 Observations of sporulated coccidia oocysts by microscope

2.2 奶牛球蟲18S rRNA序列分析

2.2.1 PCR擴增結(jié)果

提取分離的奶牛球蟲DNA，利用牛艾美爾球蟲屬18S rRNA序列通用引物進行PCR擴增。擴增出的18S rRNA片段大小為1 200 bp，與預(yù)期片段大小一致(圖2)。

M，DL2000 DNA marker；1～8：奶牛球蟲擴增產(chǎn)物。M， DL2000 DNA marker; 1-8， Amplified product of dairy coccidian.圖2 奶牛球蟲18S rRNA PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification of 18S rRNA from dairy coccidia

2.2.2 奶牛球蟲18S rRNA序列分析及其系統(tǒng)進化樹

將奶牛球蟲18S rRNA基因擴增產(chǎn)物進行測序，并將此測序結(jié)果與GenBank中已登錄的牛艾美爾球蟲(Eimeriabovis，AB769572.1)、邱氏艾美爾球蟲(Eimeriazuernii，AB769655.1)、亞球形艾美爾球蟲(Eimeriasubspherica，AB769641.1)、橢圓艾美爾球蟲(Eimeriaellipsoidalis，AB769626.1)、加拿大艾美爾球蟲(Eimeriacanadensis，AB769608.1)、阿拉巴艾美爾球蟲(Eimeriaalabamensis，AB769555.1)、奧博艾美爾球蟲(Eimeriaauburnensis，AB769557.1)、皮利他艾美爾球蟲(Eimeriapellita，KU351731.1)、亞球艾美爾球蟲(Eimeriasubspherical，AB769641.1)、阿氏艾美爾球蟲(Eimeriaarloingi，MF356556.1)和柱狀艾美爾球蟲(Eimeriacylindrica，AB769618.1)的序列進行比對，并建立系統(tǒng)進化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，寧夏地區(qū)分離的奶牛球蟲與其他蟲株親緣關(guān)系較遠，但本地蟲株之間的親緣關(guān)系較近。

圖3 奶牛球蟲18S rRNA基因序列的進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of bovine coccidia based on 18S rRNA gene sequence

3 結(jié)論與討論

奶牛場引起犢牛腹瀉的原因較多，包括細菌、病毒和寄生蟲等，而寄生蟲也較多，包括常見的球蟲、隱孢子蟲、賈第蟲等[12]。奶牛球蟲病主要發(fā)生于春、夏、秋季節(jié)，呈世界范圍內(nèi)分布，不同地區(qū)、不同牛群的球蟲感染率和發(fā)病率有所差異，對養(yǎng)牛業(yè)的危害較為嚴重[6]。根據(jù)Koutny等[7]報道，澳大利亞被調(diào)查的牛場中有97.97%的牛場存在球蟲感染，樣品的陽性率為83.67%，共檢出11種球蟲。Bangoura等[13]對德國62個奶牛場進行奶牛球蟲病流行病學研究發(fā)現(xiàn)，牛艾美爾球蟲和邱氏艾美爾球蟲的感染率分別為76.9%和83.1%。Asfaw等[3]對埃塞俄比亞東南部阿塞拉進行的犢牛球蟲流行病學研究發(fā)現(xiàn)，其感染率為62.5%。Cardim等[5]調(diào)查巴西巴拉那州發(fā)現(xiàn)，其牛場球蟲感染率為52.12%，共檢查出10種球蟲。曹希亮等[14]對北京、上海、山東、河南、四川和內(nèi)蒙古6省市27個奶牛場進行奶牛球蟲感染情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)牛場平均感染率為96%。李豪等[15]對我國寧夏、黑龍江、吉林省、遼寧、北京、天津、河北、廣東8個省、市及自治區(qū)的43個奶牛場共534份糞樣進行了球蟲蟲卵檢測，發(fā)現(xiàn)39個奶牛場存在球蟲感染，平均感染率為90.7%，各地區(qū)的樣品陽性率為24.2%～37.2%，其中，寧夏的平均感染率為24.2%。李復煌等[16]調(diào)查北京地區(qū)30個奶牛場發(fā)現(xiàn)，其牛群平均感染率為23.88%，OPG值為549。郭志宏等[17]對放牧條件下青海省牦牛進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該省牦牛共感染13種艾美爾球蟲，其中牛艾美爾球蟲、邱氏艾美爾球蟲、橢圓艾美爾球蟲、加拿大艾美爾球蟲為主要蟲種。張寬寬等[18]調(diào)查新疆庫車縣牛球蟲感染情況發(fā)現(xiàn)，其感染率為40.82%，共發(fā)現(xiàn)8種球蟲。本研究中，寧夏吳忠、石嘴山、賀蘭地區(qū)5個不同規(guī)?；膛鼍嬖谇蛳x感染的情況，平均感染率為56.98%，最大的OPG值為4 800，各奶牛場平均OPG值為1 358；其中牧場2的最高，平均OPG值為2 752；該結(jié)果明顯高于前人研究的寧夏和其他省份的球蟲感染率[19]，原因可能與本次調(diào)查采樣全部來自腹瀉犢牛的糞便有關(guān)，但各牛場OPG值與國內(nèi)報道基本接近。本研究從陽性奶牛場中共查出6種艾美爾球蟲，即牛艾美爾球蟲、邱氏艾美爾球蟲、柱狀艾美爾球蟲、橢圓艾美爾球蟲、加拿大艾美爾球蟲、皮利他艾美爾球蟲，優(yōu)勢蟲種為牛艾美爾球蟲和邱氏艾美爾球蟲。該結(jié)果與國內(nèi)外奶牛、青海牦牛感染球蟲的優(yōu)勢蟲種存在部分交叉，說明牛艾美爾球蟲和邱氏艾美爾球蟲是大多數(shù)牛場致病的主要優(yōu)勢蟲種，各牧場應(yīng)給予足夠的重視。

由于球蟲孢子化卵囊壁比較堅固，球蟲卵囊基因組DNA的提取方法不同于血液和細胞基因組的提取，在提取前需要破碎卵囊壁。目前，卵囊壁的破碎方法有多種，有玻璃珠法、超聲波法和研磨器法等[11]。本試驗采用傳統(tǒng)的玻璃珠破碎法，通過PCR擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該提取方法既便捷又實用，并獲得了較為理想的結(jié)果。18S rRNA作為DNA序列中最保守的一類，已被廣泛應(yīng)用于寄生蟲分類鑒定和分子進化研究[20-21]。18S rRNA基因是由28S、18S、5.8S，以及被5.8S分隔的基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS-1和ITS-2共同組成，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS-1和ITS-2作為非編碼區(qū)，相對變化較大，較多用于種間鑒定[22]。本研究利用包括ITS-1和ITS-2非編碼區(qū)的18S rRNA引物序列進行了擴增，電泳陽性結(jié)果均出現(xiàn)了單一擴增條帶，片段大小約為1 200 bp，說明18S rRNA序列引物特異性較好；進而通過測定奶牛艾美爾球蟲屬18S rRNA的基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，寧夏地區(qū)所分離的奶牛球蟲與其他蟲株親緣關(guān)系較遠，但本地菌株之間有較近的親緣關(guān)系，為確定其分類學地位奠定了理論基礎(chǔ)。但本研究中所用的18S rRNA引物僅適合于牛艾美爾球蟲屬的擴增，無法鑒定到種。在后續(xù)工作中，可對各蟲種18S rRNA序列差異片段設(shè)計引物，進行擴增，從而實現(xiàn)通過測序就能鑒定到種，以輔助臨床蟲種鑒定。