RNA結(jié)合蛋白Musashi2與宮頸鱗狀細(xì)胞癌關(guān)系的研究

甄娟，劉玉東，宋春紅△，吳莎，畢學(xué)杰

宮頸癌是全球女性第4大常見的癌癥［1］，是世界范圍內(nèi)女性因癌癥死亡的第4 大原因［2］。宮頸癌最常見的病理類型是鱗狀細(xì)胞癌，且?guī)缀跛械膶m頸鱗狀細(xì)胞癌與人乳頭瘤病毒（HPV）感染有關(guān)。研究顯示，盡管使用了先進(jìn)的篩查手段、注射HPV疫苗，但仍有50%以上宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者被確診時(shí)已為晚期，此時(shí)治療選擇有限且預(yù)后較差，5年生存率僅16.8%［3］。因此，尋求有效的腫瘤標(biāo)志物對(duì)晚期宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的靶向治療及預(yù)后評(píng)估至關(guān)重要。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，RNA 結(jié)合蛋白Musashi2（MSI2）與腫瘤的惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切，是一個(gè)潛在的癌癥治療靶點(diǎn)［4］。系列研究顯示，MSI2 在卵巢癌［5-6］、食管癌［7］、胃癌［8］、結(jié)腸癌［9］、前列腺癌［10］及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［11］中均呈高表達(dá)狀態(tài)。然而，鮮見有關(guān)MSI2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的研究。本研究通過(guò)檢測(cè)MSI2 在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，分析MSI2與患者預(yù)后的關(guān)系，以期為宮頸鱗狀細(xì)胞癌的治療和預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012 年1 月—2019 年1 月于石家莊市第四醫(yī)院婦科就診并行陰道鏡活檢和宮頸癌手術(shù)切除的226例患者標(biāo)本，包括癌旁正常宮頸組織40例，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變組織60例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織126例。所有患者術(shù)前均未接受放化療及其他治療?；颊吣挲g25～82歲，中位年齡50（46，57）歲，分別由2 名主治及以上病理醫(yī)師根據(jù)2014第4版世界衛(wèi)生組織（WHO）宮頸腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)和2018國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期系統(tǒng)確定腫瘤的組織學(xué)類型以及手術(shù)病理分期。126 例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者均行全面分期手術(shù)，其中FIGOⅠ+Ⅱ期患者78 例，F(xiàn)IGOⅢ+Ⅳ期患者48 例。術(shù)中同時(shí)留取宮頸鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常宮頸組織（經(jīng)形態(tài)學(xué)證實(shí)為正常宮頸組織，無(wú)病變殘留），組織離體后取少量組織立即放入液氮，然后移入-80 ℃冰箱保存。所有標(biāo)本的使用均通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核，患者本人均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 免疫組化SP法試劑盒、磷酸鹽緩沖液（PBS）及DAB 顯色試劑均購(gòu)自福州邁新公司，兔抗人MSI2 抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司，β-actin抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)SP染色檢測(cè)MSI2蛋白表達(dá)變化 所有組織經(jīng)中性福爾馬林固定、石蠟包埋，制成4 μm 厚連續(xù)切片。按照SP 試劑盒說(shuō)明書染色，MSI2 抗體以1∶400 稀釋，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定：染色結(jié)果由2名有經(jīng)驗(yàn)的中級(jí)以上病理科醫(yī)師閱片審核，陽(yáng)性顯色為細(xì)胞質(zhì)及部分細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)讀取5 個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)瘤細(xì)胞。按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～80%計(jì)3分，＞80%計(jì)4分。按細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，黃褐色計(jì)3分。將上述兩項(xiàng)計(jì)分相乘：＜3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性［12］。

1.3.2 Western blot法檢測(cè)MSI2蛋白表達(dá)情況 收集新鮮宮頸組織，加入裂解液剪碎勻漿，4 ℃15 000 r/min離心30 min，取上清液為總蛋白，Bradford法測(cè)定細(xì)胞提取物的蛋白濃度，去除因蛋白降解等原因?qū)е碌鞍诐舛冗^(guò)低的標(biāo)本，30例宮頸鱗狀細(xì)胞癌及30例癌旁正常宮頸組織進(jìn)行聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳、恒壓轉(zhuǎn)印，脫脂奶粉封閉，抗MSI2（1∶800）、抗β-actin（1∶200）4 ℃孵育過(guò)夜，與相應(yīng)二抗室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光。Image J（V1.8.0）軟件半定量分析特異性條帶的光密度（OD）值，將目的蛋白與β-actin 的OD 值之比作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 隨訪 126例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后每6個(gè)月進(jìn)行1次隨訪，采用患者門診復(fù)查及醫(yī)生電話隨訪方式。接受手術(shù)的時(shí)間為開始時(shí)間，隨訪截止日期為2020年12月31日。患者死亡為結(jié)局事件，中途失訪者、死于其他疾病為截尾數(shù)據(jù)（刪失值）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，Log-rankχ2檢驗(yàn)比較組間累積總生存率（overall survival，OS）的差異。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型篩選宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸組織中MSI2 陽(yáng)性表達(dá)情況及與相關(guān)病理參數(shù)的關(guān)系 MSI2陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，見圖1。在正常宮頸組織、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變組織及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，分別為7.50%（3/40）、28.33%（17/60）及61.90%（78/126），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=44.104，P＜0.05）。FIGOⅢ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HPV16感染及Ki67高表達(dá)者M(jìn)SI2陽(yáng)性率更高（均P＜0.05），見表1。

Fig.1 The expression of MSI2 in cervical tissues(SP,×100)圖1 MSI2在宮頸組織中的表達(dá)（SP，×100）

Tab.1 The relationship between the positive expression of MSI2 and the different clinicopathologic parameters of cervical squamous cell carcinoma表1 宮頸鱗狀細(xì)胞癌的臨床病理學(xué)參數(shù)與MSI2陽(yáng)性表達(dá)間的關(guān)系 ［例（%）］

2.2 宮頸組織中的MSI2 蛋白表達(dá)水平 宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的MSI2 相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常宮頸組織（0.80±0.09vs.0.24±0.06；n=30，t=19.424，P＜0.05），見圖2。

Fig.2 The amount of expression of MSI2 in cervical tissues圖2 MSI2在宮頸組織中的表達(dá)量

2.3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌MSI2 陽(yáng)性表達(dá)患者5 年累積生存率分析 以126例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床病理參數(shù)中MSI2 陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的參數(shù)進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，MSI2陰性表達(dá)者、FIGOⅠ+Ⅱ分期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中位生存時(shí)間較長(zhǎng)（均P＜0.05），見圖3、表2。

Fig.3 The cumulative survival rates of patients with different expression of MSI2,FIGO stage and lymph node metastasis in cervical squamous-cell carcinoma(Kaplan-Meier)圖3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌不同MSI2表達(dá)、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者累積生存率情況（Kaplan-Meier法）

Tab.2 Univariate analysis of cumulative survival rate in patients with cervical squamous cell carcinoma表2 宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者累積生存率的單因素分析

2.4 宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后生存資料的多因素Cox 回歸分析 將 MSI2（陰性=0，陽(yáng)性=1）、FIGO 分期（Ⅰ+Ⅱ=0，Ⅲ+Ⅳ=1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無(wú)=0，有=1）、HPV16（陰性=0，陽(yáng)性=1）和 Ki67（低表達(dá)=0，高表達(dá)=1）作為自變量，以生存結(jié)局（生存=0，死亡=1）為因變量進(jìn)行Cox回歸分析顯示，MSI2陽(yáng)性、FIGOⅢ+Ⅳ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者生存的危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 Multivariate Cox regression analysis of postoperative cumulative survival data in patients of cervical squamous cell carcinoma表3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后生存資料的多因素Cox回歸分析

3 討論

目前，有關(guān)宮頸癌致病相關(guān)的基因位點(diǎn)的研究是期望在分子水平上對(duì)宮頸癌進(jìn)行干預(yù)［13］。MSI2基因位于人染色體17q23.2，編碼328 個(gè)氨基酸，其編碼蛋白MSI2 具有2 個(gè)剪接體形式（MSI2L 和MSI2S），分子質(zhì)量分別為 36.9 ku 和 35.7 ku［14］。MSI2基因的易位和缺失可導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞性白血病、急性髓系白血病和某些急性淋巴性白血病的發(fā)生，并且MSI2 蛋白在多種惡性腫瘤中高表達(dá)［15］。有研究顯示，晚期卵巢癌組織中MSI2 的表達(dá)明顯高于早期卵巢癌組織，過(guò)表達(dá)MSI2 可使卵巢癌細(xì)胞活性、腫瘤細(xì)胞增殖能力和生長(zhǎng)速率明顯增加［5］。Guo 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)MSI2 能夠促進(jìn)體內(nèi)和體外胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲以及肝轉(zhuǎn)移，敲低MSI2 后出現(xiàn)與之相反的結(jié)果。食管癌組織中MSI2 也呈高表達(dá)，并且其高表達(dá)與腫瘤的增殖侵襲和轉(zhuǎn)移惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切［7］。本研究結(jié)果顯示，MSI2 蛋白在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁正常宮頸組織，其陽(yáng)性表達(dá)率在正常宮頸組織、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中依次升高，并且HPV16 感染者M(jìn)SI2 陽(yáng)性率更高，表明MSI2 與宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生有關(guān)；另外，MSI2 表達(dá)與FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki67 關(guān)系密切，F(xiàn)IGOⅢ+Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67 高表達(dá)者M(jìn)SI2 陽(yáng)性率更高，表明MSI2 與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，筆者推測(cè)可能與其他惡性腫瘤相似，MSI2 在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中作為腫瘤促進(jìn)因子發(fā)揮生物學(xué)作用，有望成為宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生和進(jìn)展的分子標(biāo)志物。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性和耐藥性受MSI2 蛋白的調(diào)節(jié)，抑制MSI2 的表達(dá)可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇藥物的敏感性，增強(qiáng)紫杉醇介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而過(guò)表達(dá)MSI2能導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇藥物的抵抗［6］。另外，MSI2 的過(guò)表達(dá)與食管癌［7］、胃癌［8］、急性髓系白血?。?7］患者的不良預(yù)后關(guān)系密切。因此，MSI2在惡性腫瘤的治療和預(yù)后評(píng)估中可發(fā)揮一定的作用。本研究生存分析發(fā)現(xiàn)，MSI2 陰性表達(dá)者、FIGOⅠ+Ⅱ分期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者生存質(zhì)量較高，與MSI2 陰性表達(dá)患者相比，MSI2陽(yáng)性表達(dá)者的累積總生存率下降，中位生存時(shí)間顯著縮短，多因素Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)MSI2 陽(yáng)性是宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的危險(xiǎn)因素，表明MSI2與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后關(guān)系密切，MSI2陽(yáng)性表達(dá)提示患者預(yù)后不良，MSI2可作為臨床評(píng)估宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的參考指標(biāo)。

綜上所述，MSI2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)并且與腫瘤惡性生物學(xué)行為及患者預(yù)后關(guān)系密切，MSI2 具有成為宮頸鱗狀細(xì)胞癌診斷標(biāo)志物和臨床治療靶點(diǎn)的潛在可能，可以幫助臨床評(píng)估患者的預(yù)后。