復(fù)方景川片對(duì)大鼠缺血性腦損傷的保護(hù)作用及對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化的影響

劉偉偉，聶衛(wèi)，崔曉雪，王宏，張婷，劉慶煥，王文彤

腦缺血可引起神經(jīng)元壞死，釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)而誘導(dǎo)中樞小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞為主的外周免疫細(xì)胞在缺血區(qū)域聚集并激活，介導(dǎo)腦組織炎癥瀑布效應(yīng)［1］。研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化在卒中引起的腦損傷中起關(guān)鍵作用，尤其是M2型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在促進(jìn)腦修復(fù)過程中起重要作用［2-3］。復(fù)方景川片為在研的復(fù)方六類新藥，選用紅景天、川芎、延胡索、冰片為組方配伍，諸藥合用，共奏益氣活血、化瘀通絡(luò)之效。本課題組前期研究已建立了穩(wěn)定的復(fù)方景川片質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［4］，并證實(shí)其可明顯降低腦梗死的面積及神經(jīng)元凋亡程度［5］。但其神經(jīng)保護(hù)作用是否與小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化有關(guān)，目前尚不明確。本研究采用大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型，觀察復(fù)方景川片在大鼠腦缺血損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用，并探討其治療作用與小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化的相互關(guān)系，旨在探究復(fù)方景川片治療缺血性腦損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量160～180 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2016-0006，購入后自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（25±2）℃。復(fù)方景川片由天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所制劑中心提供，規(guī)格0.5 g/片，以紅景天苷計(jì)為3.35 mg/g；尼莫地平片，規(guī)格30 mg/片（天津市中央藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：171102）；2432-A4線栓（北京西濃科技有限公司）。兔抗CD86 多克隆抗體、兔抗精氨酸酶1（Arg1）多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），小鼠β-actin 單抗、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）免疫組化染色試劑盒及DAB顯色劑（武漢博士德生物工程有限公司），蘇木素-伊紅（HE）染液（北京索萊寶科技有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。ASP200S 全自動(dòng)組織脫水機(jī)、Leica EG1150H組織包埋機(jī)、Leica RM2255全自動(dòng)切片機(jī)（德國(guó)徠卡）；尼康Ci-L 圖像采集顯微鏡、NIS-BRML圖像分析系統(tǒng)（日本尼康）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和給藥 60 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組，模型組，尼莫地平組和復(fù)方景川片低、中、高劑量組，每組10 只。按成人等效劑量，尼莫地平給藥劑量為0.012 g/kg；復(fù)方景川片低、中、高劑量組分別給予復(fù)方景川片0.78、1.56、3.12 g/kg。造模前7 d 開始各給藥組灌胃給藥，1 次/d，給藥體積10 mL/kg，連續(xù)10 d。空白對(duì)照組和模型組灌胃等體積純凈水。

1.2.2 動(dòng)物模型制備 采用Longa線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型［6-7］?？瞻讓?duì)照組只分離血管，不結(jié)扎不插栓線。模型組、尼莫地平組和復(fù)方景川片中劑量組各有1只大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中死亡，予以舍棄。

1.2.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià) （1）神經(jīng)功能評(píng)分：造模48 h 后采用Longa 評(píng)分法［8］對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評(píng)定，分值0～4分，得分越高，神經(jīng)功能越差。（2）橫木行走實(shí)驗(yàn)：取長(zhǎng)1.2 m、寬和高均為2.5 cm的橫木，水平放置于距地面0.6 m處，在末次給藥1 h 后，進(jìn)行橫木行走實(shí)驗(yàn)［7］，并對(duì)其腦缺血損傷后運(yùn)動(dòng)行為能力進(jìn)行評(píng)定，橫木行走實(shí)驗(yàn)滿分為6分，得分越高表示運(yùn)動(dòng)能力越差。

1.2.4 腦組織處理 造模48 h后，10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，迅速斷頭取腦組織，部分新鮮組織低溫凍存，余固定于4%多聚甲醛。固定24 h后冠狀面取材，切取包括大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)在內(nèi)的組織塊，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度為3 μm。

1.2.5 HE染色觀察腦組織病理改變 切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，放入蘇木素染液4 min，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，伊紅染色1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理改變。

1.2.6 免疫組化染色檢測(cè)大腦皮質(zhì)CD86和Arg1的定位及表達(dá) 常規(guī)石蠟切片脫蠟至水，滴加體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2，室溫孵育10 min 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；微波加熱修復(fù)抗原，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 g/L的牛血清白蛋白封閉20 min；滴加兔抗CD86多克隆抗體或兔抗Arg1多克隆抗體（1∶100），4 ℃過夜；磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后加入生物素化山羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育20 min；PBS 沖洗后加入SABC，37 ℃孵育20 min；PBS 沖洗后加入二氨基聯(lián)苯胺顯色；蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每張切片于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)讀取3 個(gè)視野，采用NIS-BRML 圖像分析系統(tǒng)采集圖像并分析，記錄灰度平均值。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)腦組織CD86 和Arg1 的蛋白表達(dá)水平 各組取3 只大鼠，將缺血皮質(zhì)腦組織切成小塊，加入RIPA 裂解液勻漿、裂解 30 min，4 ℃下 12 000 r/min 離心5 min，提取樣品中總蛋白，并檢測(cè)總蛋白含量。蛋白變性后在10%SDS-PAGE中進(jìn)行電泳后采用半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉2 h，加入一抗CD86（1∶1 000），Arg1（1∶5 000），置于4 ℃條件下孵育過夜。加入HRP 標(biāo)記二抗（1∶50 000），使PVDF 膜浸泡于二抗孵育液，室溫?fù)u床孵育2 h 后洗膜，除去游離二抗。添加ECL 工作液，待熒光帶明顯后，吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X線片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗晾干后掃描膠片。用Imageproplus 軟件分析膠片光密度值，以CD86、Arg1 與β-actin 的光密度比值反映其蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)改變 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、橫木行走評(píng)分均顯著增高（P＜0.05），大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損傷和行為能力下降。與模型組比較，各給藥組神經(jīng)功能評(píng)分、橫木行走評(píng)分均顯著降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of scores of nerve function and crossbar walking test between the six groups表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較（分，）

Tab.1 Comparison of scores of nerve function and crossbar walking test between the six groups表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較（分，）

＊＊P＜0.01；a與空白對(duì)照組比較，b與模型組比較，c與復(fù)方景川片低劑量組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組復(fù)方景川片低劑量組復(fù)方景川片中劑量組復(fù)方景川片高劑量組尼莫地平組F n 10 9 10 9 10 9神經(jīng)功能評(píng)分0.00±0.00 3.22±0.67a 2.60±0.70ab 2.44±0.73ab 1.90±0.57abc 2.11±0.60ab 33.504＊＊橫木行走評(píng)分0.00±0.00 4.67±0.87a 3.30±0.82ab 2.89±0.78ab 2.60±0.97ab 3.00±0.87ab 36.571＊＊

2.2 大腦皮質(zhì)病理改變 HE 染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及毛細(xì)血管形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰，胞漿無紅染。模型組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元大片消失，錐體細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞間隙增寬，排列紊亂，胞體變小，尼氏小體消失，變性壞死后形成大量空泡，同時(shí)可見小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞增生較明顯。各給藥組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)病變減輕，壞死神經(jīng)元減少，正常錐體細(xì)胞數(shù)量增多，形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常，細(xì)胞核較規(guī)則，仍見小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞增生，水腫較輕，尤以高劑量組和尼莫地平組減輕較明顯，其次為中劑量組和低劑量組，見圖1。

Fig.1 Pathological changes on cerebral cortex of rats in six groups(HE staining,×200)圖1 各組大鼠大腦皮質(zhì)病理改變（HE染色，×200）

2.3 各組免疫組化染色結(jié)果

2.3.1 大腦皮質(zhì)CD86表達(dá)及定位 CD86陽性表達(dá)為棕黃色或褐色，定位于細(xì)胞膜，陽性細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞?？瞻讓?duì)照組大腦皮質(zhì)可見CD86少量表達(dá)。與空白對(duì)照組比較，模型組及各給藥組CD86 表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組CD86 表達(dá)水平降低，其中復(fù)方景川片高劑量組相比中、低劑量組降低較為明顯（P＜0.05），見圖2、表2。

Fig.2 The expressions of CD86 on cerebral cortex in six groups of rats(immunohistochemical staining,×400)圖2 各組大鼠大腦皮質(zhì)CD86表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色，×400）

2.3.2 大腦皮質(zhì)Arg1 表達(dá)及定位 Arg1 陽性表達(dá)亦為棕黃色或褐色，定位于細(xì)胞漿，陽性細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞?？瞻讓?duì)照組僅見極少量小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表達(dá)Arg1。與空白對(duì)照組比較，模型組Arg1 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。各給藥組與模型組比較，Arg1 表達(dá)均有所增加，其中尼莫地平組、復(fù)方景川片高劑量組Arg1 表達(dá)增加明顯（P＜0.05）；復(fù)方景川片不同劑量組間比較發(fā)現(xiàn)高劑量組較中、低劑量組陽性表達(dá)明顯增加（P＜0.05），見圖3、表2。

Fig.3 The expressions of Arg1 on cerebral cortex in six groups of rats(immunohistochemical staining,×400)圖3 各組大鼠大腦皮質(zhì)Arg1表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色，×400）

Tab.2 Comparison of expression levels of CD86 and Arg1 between six groups of rats表2 各組大鼠CD86和Arg1表達(dá)水平比較（灰度值，）

Tab.2 Comparison of expression levels of CD86 and Arg1 between six groups of rats表2 各組大鼠CD86和Arg1表達(dá)水平比較（灰度值，）

＊＊P＜0.01；a與空白對(duì)照組比較，b與模型組組比較，c與復(fù)方景川片低劑量組比較，d與復(fù)方景川片中劑量組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組復(fù)方景川片低劑量組復(fù)方景川片中劑量組復(fù)方景川片高劑量組尼莫地平組F n 10 9 10 9 10 9 CD86 132.98±8.40 97.75±6.14a 105.26±3.29a 118.59±10.38abc 117.42±5.66abc 112.58±9.60abc 24.639＊＊Arg1 129.04±5.98 113.51±6.35a 110.24±8.18a 110.88±5.49a 100.42±7.01abcd 105.37±6.32ab 21.296＊＊

2.4 各組腦組織CD86、Arg1表達(dá)水平比較 Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組及各給藥組大鼠缺血皮質(zhì)腦組織中CD86、Arg1的蛋白表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05）。與模型組比較，尼莫地平組及復(fù)方景川片高、中劑量組CD86蛋白表達(dá)水平顯著降低，各給藥組Arg1 的蛋白表達(dá)水平均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。復(fù)方景川片高、中劑量組CD86 蛋白表達(dá)水平低于低劑量組（P＜0.05），高劑量組Arg1的蛋白表達(dá)水平較中、低劑量組明顯增高（P＜0.05），見圖4、表3。

Fig.4 Protein expression levels of CD86 and Arg1 in ischemic cortex of rats圖4 各組大鼠缺血皮質(zhì)CD86、Arg1蛋白表達(dá)

Tab.3 Comparison of the protein expression levels of CD86 and Arg1 in ischemic cortex of rats表3 各組大鼠缺血皮質(zhì)CD86、Arg1蛋白表達(dá)水平比較（n=3，）

Tab.3 Comparison of the protein expression levels of CD86 and Arg1 in ischemic cortex of rats表3 各組大鼠缺血皮質(zhì)CD86、Arg1蛋白表達(dá)水平比較（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與空白對(duì)照組比較，b與模型組組比較，c與復(fù)方景川片低劑量組比較，d與復(fù)方景川片中劑量組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組復(fù)方景川片低劑量組復(fù)方景川片中劑量組復(fù)方景川片高劑量組尼莫地平組F CD86/β-actin 0.071±0.006 0.619±0.029a 0.591±0.019a 0.237±0.014abc 0.232±0.017abc 0.301±0.032ab 9.423＊＊Arg1/β-actin 0.083±0.006 0.354±0.011a 0.584±0.009ab 0.483±0.017ab 0.805±0.008abcd 0.728±0.021ab 7.984＊＊

3 討論

缺血性腦損傷屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，多為氣虛血滯、脈絡(luò)瘀阻所致，其中缺血性腦卒中占85%左右，發(fā)病急，病死率高，給患者家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前西醫(yī)治療缺血性腦損傷尚缺乏切實(shí)可行的方法，而中醫(yī)藥用于腦損傷的防治具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［9］。復(fù)方景川片以“益氣活血，化瘀通絡(luò)”為原則，對(duì)缺血性腦損傷具有一定的治療作用，可有效改善缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)行為學(xué)功能，減少壞死神經(jīng)元，且隨著給藥劑量的增加，療效更加明顯。

腦卒中后可導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷和多器官功能障礙，而炎癥介質(zhì)失控性釋放是這種改變的基礎(chǔ)［10］。炎癥反應(yīng)在腦缺血病理生理過程中作用復(fù)雜，是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程。在炎癥反應(yīng)早期或急性期，誘導(dǎo)促炎基因表達(dá)，加重組織損傷；炎癥反應(yīng)晚期或亞急性和慢性期，可表現(xiàn)為損傷修復(fù)。從有害作用轉(zhuǎn)變?yōu)橛幸孀饔玫年P(guān)鍵在于損傷程度和持續(xù)時(shí)間，這也成為決定藥物治療時(shí)間窗的核心［11］。炎癥微環(huán)境會(huì)極大地影響小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的表型變化，從而表現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞通過 TLR2-Sphk1、Janus 激酶 1/2（JAK1/JAK2）等信號(hào)通路，引起白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-17、IL-23和腫瘤壞死因子（TNF）-α 釋放，加重腦組織損傷［12］；而IL-4、IL-13等細(xì)胞因子可通過激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）-6等信號(hào)通路促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)［13］。M2 型巨噬細(xì)胞在大腦恢復(fù)過程中起促進(jìn)作用，包括神經(jīng)發(fā)生、軸突再生、血管生成、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞生成和髓鞘再生等［14］。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)在卒中引起的腦損傷中起關(guān)鍵作用，也是藥物治療的靶點(diǎn)。

CD86是M1型巨噬細(xì)胞的分子標(biāo)志物［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組及各給藥組CD86蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較明顯增加，表明大腦中動(dòng)脈閉塞后可觸發(fā)炎性機(jī)制，促進(jìn)M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化。各給藥組CD86 蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組，表明藥物干預(yù)后可降低M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化的程度，減輕了炎性損傷。M2型極化的特征在于高表達(dá) Arg1、CD206、IL-4 等［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組及各給藥組Arg1蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較明顯增加，表明大腦中動(dòng)脈閉塞后亦可引起M2型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化；但不同于CD86的表達(dá)，模型組中Arg1 蛋白表達(dá)水平低于各給藥組，說明藥物干預(yù)后增加了M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化的程度。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，壞死神經(jīng)元數(shù)量減少，正常神經(jīng)元數(shù)目增加，表明藥物干預(yù)促進(jìn)了M2 型活化，發(fā)揮其抗炎功能，增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用。尤其復(fù)方景川片高劑量組和尼莫地平組Arg1 蛋白表達(dá)水平較模型組和空白對(duì)照組明顯增強(qiáng)，表明此兩組M2型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化顯著，與HE染色顯示的腦組織病理改變結(jié)果一致，證實(shí)復(fù)方景川片對(duì)缺血性腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，且作用的發(fā)揮與其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控有關(guān)，可在一定劑量范圍內(nèi)抑制M1型極化，促進(jìn)M2型極化。