LTBP2通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元凋亡

欒寧，劉丹，劉暢，王新楊，侯陽，張曉妍△

隨著糖尿病病程的延長，患者會(huì)出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降［1-2］，這與血糖控制不良有直接關(guān)系［3］。此外，糖尿病通常會(huì)增加患者癡呆的發(fā)病率［4］；也會(huì)導(dǎo)致海馬神經(jīng)元受損，包括細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起認(rèn)知障礙和記憶喪失［5］。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元凋亡與炎癥、氧化應(yīng)激聯(lián)系緊密［6］。潛在轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白2（latent transforming growth factor beta binding protein2，LTBP2）屬于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族的一員，與多種疾病中炎癥、氧化應(yīng)激形成有關(guān)［7-8］。但是，LTBP2 對糖尿病認(rèn)知功能障礙的影響尚鮮見報(bào)道。本研究擬探討LTBP2及其轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量180～220 g，購自錦州醫(yī)科大學(xué)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（遼）2019-16。

1.1.2 試劑及儀器 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma）；LTBP2、Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、GAPDH 一抗（英國Abcam公司）；免疫組化試劑盒、TUNEL染色試劑盒、Western blot二抗、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑及PCR試劑（北京碧云天公司）。正置顯微鏡（日本Olympus 公司），石蠟切片機(jī)（德國SLEE 公司），水平電泳儀、熒光定量PCR 儀（BIORAD），Morris 水迷宮（玉研儀器公司）。si-LTBP2 由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，其反義寡核苷酸序列為5'-CCGCAACAACGCCAUCUAUTT-3'，對 照 序 列 為 5'-AUAGAUGGCGUUGUUGCGGTT-3'。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 45只大鼠腹腔一次性注射STZ 55 mg/kg，72 h后采尾靜脈血測血糖，將血糖＞16.7 mmol/L的大鼠定為糖尿病模型，成模率為100%。模型誘導(dǎo)成功后，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成3 組：糖尿?。―M）組、si-LTBP2組（大鼠海馬給予腺病毒包裝的針對LTBP2的siRNA 10 μL）、sc-LTBP2組（大鼠海馬給予LTBP2對照序列10 μL），每組15只。另取15 只正常大鼠作為對照（CON）組。CON 組和DM組給予等劑量生理鹽水。常規(guī)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為20～25 ℃，濕度為50%～70%。腦立體定位注射：根據(jù)大鼠腦圖譜定位海馬部位進(jìn)行微量注射，給藥劑量為10 μL。12周后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。實(shí)驗(yàn)遵循國家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2.2 水迷宮檢測 12周后，每組應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法取5只大鼠，進(jìn)行定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：大鼠依次從水池的4個(gè)象限入水，大鼠登上平臺(tái)并維持2 s 后，計(jì)時(shí)停止并記為逃避潛伏期。大鼠登上平臺(tái)后，使其停留于平臺(tái)15 s以增強(qiáng)其學(xué)習(xí)記憶，擦干后放在溫暖環(huán)境中。如60 s內(nèi)未登上平臺(tái)，則進(jìn)行人工引導(dǎo)。第1～3 天，平臺(tái)置于液面上約1 cm；第4～5 天，平臺(tái)置于液面下約1 cm。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：將平臺(tái)移去，每只鼠從原平臺(tái)所在象限的對側(cè)象限入水，記錄60 s內(nèi)小鼠的游泳速度、在原平臺(tái)區(qū)域所處的時(shí)間。目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比=目標(biāo)象限內(nèi)游泳時(shí)間/總游泳時(shí)間×100%。

1.2.3 取材 隨機(jī)數(shù)字表法每組取5 只大鼠，以2%戊巴比妥鈉麻醉，4%多聚甲醛灌注固定后取出海馬，石蠟包埋切片，厚度為5 μm，用于免疫組化及TUNEL 染色。每組隨機(jī)取5 只大鼠，深度麻醉后取出海馬，提取總RNA，定量后于-80 ℃保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）。每組剩余的5 只大鼠深度麻醉，處死后取海馬，冰上剪碎，裂解，冰上靜置30 min后4 ℃、12 000 r/min離心25 min，留上清液。BCA法測蛋白濃度并制樣，-20 ℃保存用于Western blot。

1.2.4 免疫組化檢測大鼠海馬LTBP2 表達(dá) 經(jīng)1.2.3 制備的切片于PBS洗滌3次，每次5 min；切片置于體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫10 min，PBS洗滌3次，每次3 min；3%山羊血清室溫孵育30 min；不洗，滴加兔抗大鼠LTBP2（1∶400），4 ℃過夜；PBS洗滌3 次，每次3 min；滴加二抗，室溫30 min；PBS 洗滌3 次，每次3 min；滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（streptavidin-biotin complex，SABC）試劑，室溫30 min；PBS洗滌3次，每次3 min；二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色，復(fù)染、脫水、透明封片后熒光顯微鏡拍照，并應(yīng)用Image J 軟件分析同視野下LTBP2陽性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的比值作為表達(dá)陽性率。

1.2.5 qPCR 檢測海馬LTBP2 mRNA 表達(dá)變化 取1 μg RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù) 3 次。結(jié)果為Ct值。以GAPDH為內(nèi)參照，對目標(biāo)基因進(jìn)行歸一化處理，并應(yīng)用2-ΔΔCt法來比較每組各個(gè)部位樣品中LTBP2 mRNA 的表達(dá)差異。LTBP2 引物應(yīng)用DNASTAR 軟件設(shè)計(jì)，由上海吉瑪公司合成，引物序列為：上游5'-GGACGCGGAGTGTGTGAATACC-3'，下游 5'-GGGTAGCAGAAGGCAGGAGTAGG-3'。GAPDH 引物序列為：上游5'-TCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3'，下游5'-AGTGGCAGTGATGGCATGGACT-3'。

1.2.6 Western blot 檢測LTBP2、TLR4、NF-κB 蛋白相對表達(dá)量 取1.2.3制備的上清液，BCA 法測定蛋白濃度，電泳時(shí)加入12 μL 樣品；電泳、轉(zhuǎn)膜后1%BSA 室溫封閉2 h；加入一抗（兔抗大鼠LTBP2，1∶2 000；兔抗大鼠TLR4，1∶5 000；兔抗大鼠NF-κB，1∶8 000；兔抗大鼠GAPDH，1∶5 000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌 4 次，每次 5 min；加入二抗室溫 2 h，孵育后TBST 洗滌4 次，每次5 min；化學(xué)發(fā)光法ECL 顯影，Image J 軟件分析灰度值。

1.2.7 TUNEL 染色檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡 經(jīng)1.2.3制備的切片脫蠟，PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗 3 次，加入含 0.1%Triton X-100 的 PBS 冰浴孵育 2 min，配制TUNEL 檢測液，TUNEL 檢測液按照末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxyribonucleotidyl transferase，TdT）與熒光標(biāo)記液=1∶24的體積配制，PBS 洗2次，樣品加50 μL TUNEL 檢測液，37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，封片后熒光顯微鏡下拍照。計(jì)數(shù)TUNEL 陽性細(xì)胞，凋亡率=TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，方差不齊時(shí)采用Games-Howell 法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morries 水迷宮檢測結(jié)果 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與 CON 組相比，DM 組、si-LTBP2 組和 sc-LTBP2組大鼠平均逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05）；與DM 組相比，si-LTBP2 組明顯延長（P＜0.05）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON 組相比，DM 組、si-LTBP2 組和sc-LTBP2 組大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間百分比明顯降低；與DM組相比，si-LTBP2組明顯增加（P＜0.05）。大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡見圖1，水迷宮檢測結(jié)果見表1。

Fig.1 Morris water maze trajectory of rats in the four groups圖1 4組大鼠水迷宮運(yùn)動(dòng)軌跡圖

Tab.1 The Morris water maze results of the latency of escape and the percentage of the residence time in the target quadrant of the four groups of rats表1 4組大鼠水迷宮逃避潛伏期及目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比檢測結(jié)果 （n=5，）

Tab.1 The Morris water maze results of the latency of escape and the percentage of the residence time in the target quadrant of the four groups of rats表1 4組大鼠水迷宮逃避潛伏期及目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比檢測結(jié)果 （n=5，）

＊＊P＜0.01；a與CON組比較，b與DM組比較，c與si-LTBP2組比較，P＜0.05

組別CON組DM組si-LTBP2組sc-LTBP2組F逃避潛伏期（s）52.92±1.61 26.77±1.16a 45.26±1.44ab 26.69±1.01ac 300.470＊＊目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比（%）22.41±2.27 12.67±0.66a 18.55±0.71ab 12.88±1.17ac 35.873＊＊

2.2 4組大鼠海馬LTBP2蛋白表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，LTBP2 陽性表達(dá)主要分布于海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)，陽性信號(hào)呈棕黃色顆粒，見圖2。CON組、DM 組、si-LTBP2 組、sc-LTBP2 組 LTBP2 蛋白表達(dá)陽性率分別為 13.70%±0.94%、74.29%±1.93%、25.87%±1.38%和73.54%±1.74%（n=5，F(xiàn)=1 259.482，P＜0.01）。與CON組相比，DM組、si-LTBP2組和sc-LTBP2組大鼠海馬LTBP2蛋白表達(dá)明顯增加；與DM組相比，si-LTBP2 組LTBP2 蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。

Fig.2 Immunohistochemical staining of LTBP2 protein in hippocampus of rats in the four groups(×400)圖2 4組大鼠海馬LTBP2蛋白免疫組化染色（×400）

2.3 qPCR檢測4組大鼠海馬LTBP2mRNA表達(dá) 4組LTBP2mRNA 表達(dá)水平分別為 1.00±0.00、7.31±0.13、2.98±0.15 和 7.27±0.10（n=5，F(xiàn)=2 400.370，P＜0.01）。與 CON 組相比，DM 組、si-LTBP2 組和 sc-LTBP2 組大鼠海馬LTBP2mRNA 表達(dá)水平明顯增加；而與DM組相比，si-LTBP2組LTBP2mRNA表達(dá)水平明顯減少（P＜0.05），見圖3。

Fig.3 Comparison of LTBP2 mRNA expression in hippocampus of rats between the four groups圖3 4組大鼠海馬LTBP2 mRNA表達(dá)量比較

2.4 Western blot 檢測海馬LTBP2、TLR4、NF-κB 蛋白相對表達(dá)量 與CON組相比，DM組、si-LTBP2組和sc-LTBP2 組大鼠海馬LTBP2、TLR4、NF-κB 蛋白表達(dá)水平明顯增加；而與DM 組相比，si-LTBP2 組LTBP2、TLR4、NF-κB 蛋白表達(dá)水平明顯減少（P＜0.01），見圖4、表2。

Fig.4 The relative expressions of LTBP2,TLR4 and NF-κB in hippocampus detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測海馬LTBP2、TLR4、NF-κB蛋白相對表達(dá)量

Tab.2 Comparison of LTBP2,TLR4 and NF-κB protein expressions in hippocampus of rats between the four groups表2 4組大鼠海馬LTBP2、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 （n=5，%，）

Tab.2 Comparison of LTBP2,TLR4 and NF-κB protein expressions in hippocampus of rats between the four groups表2 4組大鼠海馬LTBP2、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 （n=5，%，）

＊＊P＜0.01，a與CON組比較，b與DM組比較，c與si-LTBP2組比較，P＜0.01

組別CON組DM組si-LTBP2組sc-LTBP2組F TLR4/GAPDH 15.44±1.09 140.92±3.35a 25.36±0.73ab 141.63±2.05ac 3 417.929＊＊NF-κB/GAPDH 20.55±1.13 123.20±2.33a 83.02±2.50ab 122.06±2.57ac 1 428.562＊＊LTBP2/GAPDH 17.38±0.99 118.59±2.13a 32.77±1.74ab 117.99±1.71ac 3 084.710＊＊

2.5 TUNEL 染色檢測海馬神經(jīng)元凋亡 CON 組、DM 組、si-LTBP2 組、sc-LTBP2 組凋亡 率分別為2.83%±0.29%、64.03%±1.71%、17.14%±1.29% 和63.21%±1.29%（n=5，F(xiàn)=1 876.135，P＜0.01）。 與CON 組相比，DM 組、si-LTBP2 組和 sc-LTBP2 組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡明顯增加，而與DM組相比，si-LTBP2組細(xì)胞凋亡明顯減少（P＜0.01），見圖5。

Fig.5 Apoptosis of hippocampus of rats detected by TUNEL staining in the four groups(×400)圖5 TUNEL染色檢測4組大鼠海馬細(xì)胞凋亡（×400）

3 討論

3.1 糖尿病海馬神經(jīng)元凋亡誘導(dǎo)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降 1型糖尿?。═1DM）和T2DM都會(huì)引起神經(jīng)損傷并發(fā)癥，包括學(xué)習(xí)記憶功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)增加。越來越多的動(dòng)物模型證據(jù)表明，糖尿病在不同程度上損害了認(rèn)知功能，包括學(xué)習(xí)、記憶和注意力，并增加了抑郁和焦慮的發(fā)病率［9-10］。隨著糖尿病患者癡呆風(fēng)險(xiǎn)增加，更加重了學(xué)習(xí)和記憶缺陷［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中平均逃避潛伏期明顯縮短，在目標(biāo)象限停留的時(shí)間百分比明顯降低，說明糖尿病會(huì)引起大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)，糖尿病可誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，TUNEL 陽性細(xì)胞明顯增多，這也在某種程度上加重了大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。以上結(jié)果表明，糖尿病可降低大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，這提示本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驼T導(dǎo)成功。

3.2 LTBP2 可介導(dǎo)糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙 研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥在糖尿病認(rèn)知功能障礙中尤為關(guān)鍵，抑制海馬區(qū)炎癥反應(yīng)對其治療有益［12］。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）家族的生長因子除了對細(xì)胞生長具有免疫調(diào)節(jié)作用，還在炎癥及應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用［13］。TGF-β 是由細(xì)胞分泌的潛在復(fù)合物，含有TGF-β 及其前肽LAP（潛在相關(guān)肽）。在大多數(shù)細(xì)胞中，LAP與潛在TGF-β結(jié)合蛋白（LTBP）共價(jià)連接。LTBPs 是TGF-βs 高效分泌和正確折疊所必需的，LTBPs分泌的大量潛在復(fù)合物通過LTBPs的N端與細(xì)胞外基質(zhì)共價(jià)結(jié)合。LTBPs家族具有典型的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域，目前已鑒定出4 種不同的LTBPs和2種纖維蛋白，這其中包括LTBP2。有研究發(fā)現(xiàn)，LTBP2 通過與 LTBP1 競爭纖維蛋白-1 的結(jié)合位點(diǎn)，間接引起TGF-β 的激活，與多種疾病介導(dǎo)的炎癥、氧化應(yīng)激密切相關(guān)，且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。沉默LTBP2基因可以通過減輕心肌氧化應(yīng)激損傷，抑制擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌纖維化與心肌重塑，進(jìn)而減輕心肌纖維化［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下，大鼠海馬區(qū)LTBP2 蛋白和LTBP2 mRNA 表達(dá)明顯增加，并伴隨海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率增高，大鼠學(xué)習(xí)能力降低，說明LTBP2 可能會(huì)引起糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶降低。本研究對糖尿病大鼠海馬注射si-LTBP2來沉默LTBP2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)凋亡率明顯降低，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力得到明顯改善，提示LTBP2 介導(dǎo)了糖尿病認(rèn)知功能障礙，但具體機(jī)制不清。

3.3 LTBP2通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙 TLR4/NF-κB 信號(hào)通路與多種炎癥因子的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，該通路介導(dǎo)了腦缺血時(shí)神經(jīng)元的損傷［14］。TLR4 可通過選擇性識(shí)別內(nèi)源性損傷相關(guān)的分子最終激活NF-κB，導(dǎo)致腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β 等炎性因子釋放，誘發(fā)炎癥［15］。抑制TLR4/NF-κB 途徑可減弱脂多糖誘導(dǎo)的海馬炎癥反應(yīng)［14］。TLR4/NF-κB信號(hào)通路還可參與異丙酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷［16］。因此，本研究對糖尿病大鼠海馬注射si-LTBP2來抑制LTBP2 蛋白的表達(dá)。Western blot 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制 LTBP2 的表達(dá)后，TLR4 和 NF-κB 蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，這提示LTBP2 介導(dǎo)的糖尿病認(rèn)知功能障礙與TLR4/NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。

綜上所述，糖尿病狀態(tài)下會(huì)引起LTBP2 表達(dá)上調(diào)和海馬神經(jīng)元凋亡，最終引起大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。沉默LTBP2表達(dá)后可改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙，這可能與抑制TLR4/NFκB 信號(hào)通路有關(guān)。本研究尚存在不足之處，如未對正常大鼠進(jìn)行海馬LTBP2基因敲除來驗(yàn)證LTBP2與學(xué)習(xí)記憶能力的關(guān)系；沉默LTBP2 后，雖然取得了一定的治療效果，但與CON 組還有一定的差距；LTBP2 最終是通過影響TGF-β的表達(dá)、分泌或活性發(fā)揮作用的，但本研究未對大鼠海馬組織中TGF-β 的表達(dá)水平或活性進(jìn)行檢測；腦立體定位注射為混雜因素，而本研究未設(shè)置假手術(shù)組，對組間比較會(huì)有一定影響。