酶聯(lián)免疫法檢測牛乳中A1β-酪蛋白研究

艾正文

乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院（上海 200436）

牛乳中的蛋白質(zhì)主要分為乳清蛋白和酪蛋白，其中酪蛋白約占牛乳中蛋白質(zhì)的80%[1]。牛乳中的酪蛋白主要由as1-酪蛋白、as2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白組成。根據(jù)文獻(xiàn)資料顯示，發(fā)現(xiàn)的β-酪蛋白變異體達(dá)十幾種，較為常見的變異體為A1、A2、B和C。其中，又以A1和A2這2種變異體最為常見，其他變異體出現(xiàn)的概率很低。A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的區(qū)別在于第67號位的氨基酸種類不同[2-3]。有研究表明，A1型β酪蛋白經(jīng)消化后會產(chǎn)生一種含有7個氨基酸的短肽，即β-酪啡肽（BCM-7）[4-5]，而這種短肽可能會引起某些諸如過敏[6]、糖尿病[7]、消化吸收[8]等非傳染性疾病，而A2型β-酪蛋白則不會產(chǎn)生這種β-酪啡肽。通過基因測序手段可以實現(xiàn)A2基因型奶牛的有效篩選。近年來隨著A2牛奶及A2奶粉等乳制品的興起，A2乳制品的相關(guān)研究日漸增多。關(guān)于A1和A2蛋白檢測方法的研究越來越多，綜合研究發(fā)現(xiàn)乳制品中β-酪蛋白的檢測方法主要有液相法[9]、高分辨質(zhì)譜法[10]、毛細(xì)管電泳法[11-12]及免疫學(xué)方法[13-14]等，但是這些方法在便利性、準(zhǔn)確性及成本等方面存在一定程度不足。正是標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法的缺失，如何快速檢測乳制品中A1蛋白成為需要重點解決的問題。

酶聯(lián)免疫法由于其方便和靈敏等優(yōu)點，特別是在工業(yè)生產(chǎn)過程中由于其能夠在相對較短的時間內(nèi)得到檢測結(jié)果，因此被廣泛應(yīng)用到實際生產(chǎn)中。試驗對一種牛乳中A1β-酪蛋白含量的酶聯(lián)免疫檢測方法進(jìn)行驗證，以探討該方法在實際應(yīng)用的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通巴氏殺菌乳（O_PMilk，含有A1 & A2β-酪蛋白）；A2β-酪蛋白生牛乳（A2_RMilk，取自A2牧場）；A2β-酪蛋白鮮牛奶（A2_PMilk，采用質(zhì)譜方法驗證）；鹽酸（化學(xué)純，國藥集團(tuán)）；氫氧化鈉（化學(xué)純，國藥集團(tuán)）；牛乳A1β-酪蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒（biosensis）；去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

搖板機(jī)L079-100（Thermo）；移液器（Eppendorf）；酶標(biāo)儀SpectraMax M5（Molecular Devices）；Milli-Q超純水儀（美國密理博公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液的配制

將100 mL TBS（10X）加入900 mL去離子水中，充分混合并定容，用0.45 μm孔徑濾膜過濾得到TBS緩沖液（1X）。

取1 mL Tween-20溶液加入TBS緩沖液（1X）中，充分混合后得到TBST溶液，用于配制抗體稀釋液緩沖液和洗板溶液。

將100 mL TBST加入試劑盒中BSA瓶中充分混合，但不要過度混合，制備抗體和樣品Ab稀釋緩沖液。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品儲備液加入990 μL稀釋緩沖液，制成400 ng/mL A1標(biāo)準(zhǔn)品。逐漸稀釋配制成質(zhì)量濃度200，100，50，25和12.5 ng/mL的A1標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)溶液置于4 ℃條件下保存，于3 h內(nèi)使用。

樣品的制備：將待測的普通巴氏殺菌乳樣品在0.5 mol/L NaOH中按照1∶100稀釋，用Ab稀釋緩沖液再稀釋至最終稀釋倍數(shù)1∶100000。同時，將待測的A2牛奶樣品稀釋至最終稀釋倍數(shù)1∶1000。稀釋的樣品在4 ℃條件下保存，并于3 h內(nèi)完成測試。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照biosensis A1β-酪蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書操作方法，將試劑盒中A1β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制成一定的濃度梯度，在450 nm條件下進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度為縱坐標(biāo)，構(gòu)建四參數(shù)曲線，得到線性回歸方程。

1.3.3 方法重復(fù)性

在相同試驗條件下，取10 μL相同批次的N_PMilk樣品，根據(jù)步驟1.3.1中所述的樣品制備方法稀釋至1∶100000，進(jìn)行7次平行試驗，計算7次試驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，相對偏差小于10%說明重復(fù)性較好[15]。

1.3.4 試劑盒交叉反應(yīng)驗證

分別取10批次O_PMilk、 5批次A2_RMilk及5批次A2_PMilk，使用試劑盒方法進(jìn)行檢測，以確定A1β-酪蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒對A2β-酪蛋白是否有交叉反應(yīng)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行計算和統(tǒng)計。四參數(shù)曲線采用ELISA Calc軟件進(jìn)行擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照試劑盒使用說明配制12.5～400 ng/mL質(zhì)量濃度梯度的A1β-酪蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)品并檢測其A450值，得到的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1和圖1。由圖1所示，y=（0.92396-0.09188）/[1+（x/95.25601）-0.84058]+ 0.09188，r2=0.99148。A1β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線r2值超過0.99，曲線表現(xiàn)出良好擬合性。

表1 A1β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

圖1 A1β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法重復(fù)性驗證

用A1β-酪蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒對O_PMilk樣品中A1β-酪蛋白含量進(jìn)行測定，設(shè)置7次平行試驗。對7次測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行相對偏差計算，以檢測該方法的重復(fù)性是否良好，試驗結(jié)果見表2。在相同檢測條件下，A1β-酪蛋白酶聯(lián)免疫法檢測A1蛋白具有良好重復(fù)性，7次重復(fù)檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.97%（n=7）。SRSD小于10%，表明該方法重復(fù)性較好。

表2 樣品重復(fù)性檢測結(jié)果

2.3 交叉反應(yīng)驗證

為驗證A1β-酪蛋白酶聯(lián)免疫法對牛乳中A2β-酪蛋白是否有交叉反應(yīng)，分別對多批次O_PMilk、A2_RMilk及A2_PMilk樣品中A1蛋白進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如表3所示。

表3 不同牛奶樣品中A1β-酪蛋白檢測結(jié)果

10批次的普通巴氏殺菌乳中由于同時含有A1和A2β-酪蛋白，因此10批次O_PMilk樣品中均可以檢測到不同濃度的A1β-酪蛋白存在，而5批次A2_RMilk和A2_PMilk樣品中均未檢測到A1β-酪蛋白。同時，A2_PMilk樣品經(jīng)過高分辨質(zhì)譜方法檢測證明也無A1蛋白存在，說明這與檢測結(jié)果十分吻合。因此，試驗結(jié)果表明A1β-酪蛋白酶聯(lián)免疫法對牛奶中A1β-酪蛋白具有良好的特異性，與A2β-酪蛋白無明顯的交叉反應(yīng)。

3 結(jié)論

A1β-酪蛋白沒有標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，報道的研究方法在便利性和經(jīng)濟(jì)成本等方面存在劣勢。研究表明，A1β-酪蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒法對A1β-酪蛋白的檢測具有良好線性，線性范圍為6.25～400 ng/mL，重復(fù)性試驗結(jié)果表明相對偏差為4.97%，重復(fù)性良好。同時，試劑盒方法對A1β-酪蛋白具有良好的特異性。但是，由于無法獲得商業(yè)的A1β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，因此無法對A1β-酪蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒方法進(jìn)行定量限和回收率的驗證。同時，由于試劑盒保存期限較短，整個檢測等待時間較長，并且對運輸和測試環(huán)境比較敏感，因此該方法仍有待進(jìn)一步完善。該方法可作為一種檢測手段，用于牛奶中A1β-酪蛋白的定性研究。