蒸汽爆破超聲波復(fù)合提取靈芝多糖及抗氧化活性

張博華，張明，范祺，王崇隊(duì)，楊立風(fēng)，馬超

中華全國供銷合作總社濟(jì)南果品研究院（濟(jì)南 250014）

靈芝（Ganoderma lucidum）屬于擔(dān)子菌綱，多孔菌科，靈芝屬真菌，在中國及亞洲國家是一種十分受歡迎的藥用真菌[1]。靈芝含有多種生物活性組分如靈芝多糖、三萜、甾醇類、多種蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、礦質(zhì)元素等[2]。靈芝多糖（GLP）是靈芝的主要生物活性組分，具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗氧化等多種藥理作用[3]。近來越來越多的靈芝多糖產(chǎn)品作為功能食品出現(xiàn)在市場上。人體代謝過程中會(huì)產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)，可導(dǎo)致癌癥、冠心病、動(dòng)脈硬化等疾病，所以清除活性氧類物質(zhì)對(duì)人體非常重要。靈芝多糖在清除活性氧方面可展現(xiàn)良好的抗氧化活性，是一種天然抗氧化原料[4]。

隨著健康意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)靈芝的需求不斷增加，但野生靈芝資源稀少，靈芝主要通過人工種植獲得。人工種植的靈芝大量用于靈芝孢子粉的培育，對(duì)靈芝子實(shí)體應(yīng)用的研究也越來越多[5]。

蒸汽爆破技術(shù)（簡稱汽爆技術(shù)）是指在高壓密閉環(huán)境中，用過熱蒸汽將物料加熱到180～235 ℃，維持壓強(qiáng)數(shù)秒或數(shù)分鐘后瞬間泄壓，隨著壓強(qiáng)驟降、水分汽化，氣體迅速膨脹，固體物料受機(jī)械力作用結(jié)構(gòu)受到破壞，物料產(chǎn)生爆破效應(yīng)的一種物理處理方法[6-8]。靈芝成熟后成木栓質(zhì)，表面有蠟質(zhì)，有大量纖維束組成，蒸汽爆破技術(shù)主要應(yīng)用于纖維含量較高的物料，可以提高靈芝子實(shí)體中多糖的溶出率，以及增香的效果[9]。試驗(yàn)主要為確定最優(yōu)汽爆處理靈芝子實(shí)體提取的工藝、汽爆對(duì)靈芝子實(shí)體纖維的影響、汽爆對(duì)靈芝多糖的抗氧化活性的影響。對(duì)靈芝多糖選取提取超聲時(shí)間、汽爆保壓時(shí)間、汽爆壓強(qiáng)3個(gè)單因素樣品進(jìn)行蒸汽爆破，測定不同條件下靈芝子實(shí)體的粗多糖的得率，并據(jù)此進(jìn)行正交試驗(yàn)確定靈芝子實(shí)體粗多糖的最佳改性工藝，從而提高靈芝子實(shí)體粗多糖提取率。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 原料

靈芝子實(shí)體（山東冠縣廣義靈芝養(yǎng)殖專業(yè)合作社）。

1.1.2 試劑

無水乙醇、水楊酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、H2O2、三氯乙酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DPPH（麥克林試劑有限公司）。

1.1.3 儀器

QBS-80型蒸汽爆破設(shè)備（鶴壁政道啟寶實(shí)業(yè)有限公司）；SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器（蘇杰瑞爾電器有限公司）；RXH-B-1熱風(fēng)循環(huán)烘箱（江陰市宏達(dá)粉體設(shè)備有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩60目浙江上虞市金鼎標(biāo)準(zhǔn)篩具廠；TGL-10B高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RH-600A高速粉碎機(jī)（永康市榮浩工貿(mào)有限公司）；MB23水分測定儀（奧豪斯儀器（上海）有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝子實(shí)體粗多糖的測定

靈芝子實(shí)體粗多糖的測定參照NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》所述方法進(jìn)行測定

1.2.2 蒸汽爆破靈芝子實(shí)體單因素試驗(yàn)

取靈芝子實(shí)體切片100 g，隔夜復(fù)水調(diào)整物料含水率至30%，汽爆后物料置于60 ℃條件下干燥至物料水分10%以內(nèi)，用高速粉碎機(jī)對(duì)干燥殘?jiān)M(jìn)行打粉，粉體過60目篩，即為測試樣品。以未經(jīng)蒸汽爆破處理的靈芝子實(shí)體粉為空白對(duì)照。依次比較不同蒸汽爆破壓強(qiáng)（0.3，0.6，0.9，1.2，1.5和1.8 MPa），不同蒸汽保壓時(shí)間（30，60，90，120，150和180 s），不同提取時(shí)間（10，20，30，40，50和60 min）對(duì)靈芝子實(shí)體提取率的影響。

1.2.3 掃描電鏡（SEM）分析

將處理后的靈芝子實(shí)體樣品于60 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量，然后采用濺射鍍膜法進(jìn)行表面鍍金，對(duì)其進(jìn)行電鏡掃描觀察拍照，得到不同倍數(shù)的掃描電鏡圖片。

1.2.4 抗氧化活性的測定

將提取的靈芝子實(shí)體多糖分別制備成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mg/mL的樣品溶液。同樣質(zhì)量濃度配制VC溶液備用。進(jìn)行DPPH自由基清除活性和還原能力的測定。

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性測定[10]

取2 mL樣品溶液和2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液放入試管中，充分混合后避光靜置30 min，在517 nm處測定其吸光度A1。同法測定2 mL樣品溶液和2 mL無水乙醇混勻后的吸光度A2和2 mL DPPH溶液加入2 mL蒸餾水的吸光度A0，同時(shí)用VC標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照。

1.2.4.2 羥自由基清除能力測定[11]

測定方法參照曾軍[11]的方法，量取1.8 mmol/L的FeSO42 mL放入試管中，加入1.8 mmol/L水楊酸1.5 mL，加入不同濃度樣品溶液1 mL，加入0.03% H2O20.1 mL并啟動(dòng)整個(gè)反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)30 min后，2000 r/min離心10 min，以蒸餾水代替樣品溶液做空白參比，在510 nm測定吸光值。

1.2.4.3 還原力測定[12]

取0.5 mL不同濃度的可溶性靈芝粗多糖樣品溶液，加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6、0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液62.5 mL+0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液37.5 mL）和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃溫度水浴保溫20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液、5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%氯化鐵溶液，混合均勻，靜置10 min，以無水乙醇代可溶性靈芝粗多糖提取液按上述處理作空白對(duì)照，于700 nm波長處測定吸光度。

1.3 蒸汽爆破靈芝子實(shí)體多糖提取正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇蒸汽爆破壓強(qiáng)、蒸汽爆破時(shí)間、提取超聲時(shí)間3個(gè)因素，采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化汽爆條件。

表1 蒸汽爆破提取靈芝子實(shí)體粗多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用Microcal Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖，采用SPSS進(jìn)行分析。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取超聲時(shí)間對(duì)靈芝子實(shí)體粗多糖得率的影響

由圖1可以看出，隨著提取超聲時(shí)間延長，靈芝子實(shí)體中粗多糖得率呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢，提取超聲時(shí)間20 min時(shí)，靈芝粗多糖得率達(dá)到最高值為12.8%。這是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間延長，增大超聲波的空化效應(yīng)，有利于可溶性靈芝粗多糖的溶出，因此靈芝子實(shí)體粗多糖的溶出率在增加。超聲時(shí)間超過20 min時(shí)，靈芝子實(shí)體粗多糖提取率略有下降，這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間增加，會(huì)破壞靈芝子實(shí)體中多糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率下降[13]。因此，超聲時(shí)間選擇在20 min為宜。

圖1 提取超聲時(shí)間對(duì)靈芝子實(shí)體粗多糖得率的影響

2.1.2 汽爆保壓時(shí)間對(duì)靈芝子實(shí)體粗多糖得率的影響

蒸汽爆破設(shè)備的2個(gè)參數(shù)蒸汽壓強(qiáng)和維壓時(shí)間決定蒸汽爆破的反應(yīng)強(qiáng)度，影響蒸汽爆破處理物料的結(jié)果，進(jìn)而關(guān)系到靈芝粗多糖的得率（圖2～圖3）。由圖2可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著蒸汽爆破時(shí)間增加，靈芝粗多糖得率不斷增加，蒸汽爆破維壓時(shí)間90 s時(shí)，靈芝粗多糖得率達(dá)最大值，為10.36%。隨后穩(wěn)壓時(shí)間延長，靈芝粗多糖得率減小。這可能是因?yàn)橛捎谡羝七^程中，水蒸氣隨著時(shí)間的延長滲透到物料中越多，突然減壓時(shí)水蒸氣的膨脹力充分作用于物料中[14]。但蒸汽爆破時(shí)間不是越高越好，隨著蒸汽爆破時(shí)間的延長使物料中的大分子碳水化合物降解生成甲酸、乙酸等酸類、糠醛、芳香類化合物、脂肪酸類化合物和呋喃化合物，所以靈芝粗多糖得率降低[15]。

圖2 汽爆保壓時(shí)間對(duì)靈芝子實(shí)體粗多糖得率的影響

2.1.3 蒸汽爆破壓強(qiáng)對(duì)靈芝子實(shí)體粗多糖得率的影響

從圖3可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著蒸汽爆破壓強(qiáng)的增加，靈芝粗多糖得率呈先升后降趨勢，蒸汽爆破壓強(qiáng)1.2 MPa時(shí)，靈芝粗多糖得率達(dá)最大值12.18%，隨后靈芝粗多糖得率減少。這可能是由于蒸汽壓強(qiáng)越大，越能有效打通靈芝子實(shí)體內(nèi)部物質(zhì)溶出的孔隙，可加速多糖溶出，蒸汽爆破促使物料內(nèi)部多孔網(wǎng)絡(luò)的產(chǎn)生和放大，改變多孔性質(zhì)從而改善萃取過程；另一個(gè)原因可能是蒸汽爆破會(huì)使靈芝子實(shí)體中半纖維素降解，釋放出降解產(chǎn)物水溶性多糖，導(dǎo)致靈芝多糖得率提高，易軍鵬等[16]的研究證實(shí)該結(jié)論。隨著蒸汽壓強(qiáng)變大，使得靈芝粗多糖得率降低。但蒸汽爆破壓強(qiáng)繼續(xù)增加時(shí)，靈芝多糖得率會(huì)下降，推測是由于巨大的機(jī)械剪切力使靈芝子實(shí)體中的糖苷鍵進(jìn)一步斷裂，多糖降解成為寡糖或單糖等[17]。

圖3 蒸汽爆破壓強(qiáng)對(duì)靈芝子實(shí)體粗多糖得率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

根據(jù)表2的結(jié)果，經(jīng)極差分析可知，試驗(yàn)因素對(duì)靈芝粗多糖得率影響的主次順序?yàn)镃＞B＞A，即汽爆壓強(qiáng)＞汽爆時(shí)間＞提取超聲時(shí)間。由k值大小可知，優(yōu)化組合為A1B3C3，即提取超聲時(shí)間20 min，汽爆時(shí)間100 s，汽爆壓強(qiáng)1.3 MPa。經(jīng)驗(yàn)證，在此條件下，靈芝粗多糖的得率為14.21%，是汽爆處理前的靈芝粗多糖得率的1.865倍。

表2 蒸汽爆破正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 蒸汽爆破壓強(qiáng)對(duì)靈芝子實(shí)體微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖4為不同蒸汽爆破壓強(qiáng)對(duì)靈芝子實(shí)體微觀結(jié)構(gòu)的影響。由圖4可知，同對(duì)照相比，經(jīng)蒸汽爆破處理后，靈芝子實(shí)體纖維束發(fā)生剪切和形變，且纖維表面由原來的光滑平整結(jié)構(gòu)逐漸變?yōu)榇植趲в锌障兜牟灰?guī)則立體結(jié)構(gòu)，靈芝子實(shí)體細(xì)胞壁也有一定的破壞。靈芝子實(shí)體纖維束變得疏松，易發(fā)生斷裂和破碎現(xiàn)象，內(nèi)部物質(zhì)更容易溶出。靈芝多糖分子本身表面有很多活性基團(tuán)，具有抗氧化和降血糖的作用等。蒸汽爆破處理后形成的疏松纖維束，使靈芝子實(shí)體中的功能成分更容易溶出和釋放，同時(shí)增加溶劑與物料的接觸面積，從而增加提取效率[18]。

圖4 蒸汽爆破對(duì)靈芝子實(shí)體微觀結(jié)構(gòu)的影響

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，遇甲醇溶液顯紫色，自由基清除劑能夠與DPPH的單電子被配對(duì)，在最大吸收波長處顏色變淺，吸光度也會(huì)隨之變小，DPPH自由基清除率越高表明其抗氧化能力越大[19]。由圖5可知，靈芝子實(shí)體粗多糖清除DPPH的能力較強(qiáng)，質(zhì)量濃度0.6 mg/mL時(shí)兩者的清除率均高于90%，基本完成清除。質(zhì)量濃度低于0.6 mg/mL時(shí)經(jīng)過汽爆處理的靈芝子實(shí)體多糖的DPPH清除能力要優(yōu)于未經(jīng)汽爆處理過的樣品，未汽爆樣品IC50為0.36 mg/mL，經(jīng)過汽爆處理的樣品IC50為0.48 mg/mL，比未經(jīng)過汽爆樣品提高16%，原因可能由于在蒸汽爆破處理的過程中，靈芝子實(shí)體的完整結(jié)構(gòu)受到破壞，一部分被包裹的多糖被釋放出來，增加多糖的種類和得率，使功能因子成分更好的溶出，從而提高DPPH的清除率[20]。

圖5 可溶性靈芝粗多糖對(duì)DPPH自由基清除率比較

2.4.2 羥自由基清除率

由圖6可知，靈芝多糖羥自由基清除能力都隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。對(duì)汽爆處理后和未處理的靈芝多糖清除自由基能力的比較，可以看到汽爆處理后，靈芝多糖的羥自由基清除能力明顯增強(qiáng)，清除率相比于未處理組顯著增加，未經(jīng)過處理的靈芝多糖羥自由基清除率IC50為0.457 mg/mL，經(jīng)過汽爆處理的靈芝多糖IC50為0.60 mg/mL，比汽爆處理前提高31%，原因是蒸汽爆破使一部分被包裹的多糖釋放出來，增加了多糖的得率和種類，從而提升靈芝多糖的抗氧化活性，但均低于相同濃度的VC。

圖6 可溶性靈芝粗多糖對(duì)羥自由基清除率比較

2.4.3 還原力測定

由圖7可知，無論經(jīng)過汽爆與否，靈芝子實(shí)體多糖均具有一定的還原能力，并隨著多糖質(zhì)量濃度增加而逐漸增大。且在一定濃度范圍內(nèi)，未經(jīng)汽爆的樣品還原能力要優(yōu)于蒸汽爆破處理過的樣品，原因可能是在蒸汽爆破過程中，部分多糖在高溫高壓作用下，由于糖苷鍵的斷裂，一部分多糖被轉(zhuǎn)化，可能導(dǎo)致還原能力下降[21]。

圖7 可溶性靈芝粗多糖總還原能力對(duì)比

3 結(jié)論

在利用蒸汽爆破處理靈芝子實(shí)體粗多糖試驗(yàn)過程中，隨著多糖提取超聲時(shí)間的延長、汽爆維壓時(shí)間的延長、汽爆壓強(qiáng)的增加，靈芝子實(shí)體粗多糖的得率和DPPH清除率、羥自由基清除率在一定程度上都有所提高，在還原力的測定中，經(jīng)過蒸汽爆破的靈芝子實(shí)體還原力低于未經(jīng)汽爆處理的樣品。這是因?yàn)檎羝祁A(yù)處理可以打開多糖溶出的通路，使多糖溶出加快，或者高溫高壓對(duì)化學(xué)鍵的破壞，使多糖的種類和得率發(fā)生變化。蒸汽爆破預(yù)處理使得靈芝子實(shí)體總體的粗多糖溶出率得到提升，這使得蒸汽爆破技術(shù)預(yù)處理靈芝子實(shí)體便于制成固體飲片，為產(chǎn)品提供新思路和理論依據(jù)，也為靈芝子實(shí)體利用提供方法。