細(xì)菌Cpx信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的功能及調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

吳麗雯，曾潔，薛云新，趙西林

綜 述

細(xì)菌Cpx信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的功能及調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

吳麗雯，曾潔，薛云新，趙西林

廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361102

Cpx (conjugative pilus expression)雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是革蘭陰性細(xì)菌中一種復(fù)雜的包膜應(yīng)激系統(tǒng)，能感應(yīng)從不同信號傳輸點(diǎn)傳入的多種包膜信號。位于胞質(zhì)中的反應(yīng)調(diào)節(jié)子CpxR磷酸化后能夠調(diào)節(jié)眾多編碼內(nèi)外膜上相關(guān)蛋白基因的表達(dá)。Cpx系統(tǒng)的激活還能調(diào)節(jié)細(xì)菌對抗生素和酸等壓力的抵抗性。本文介紹了Cpx系統(tǒng)的組成，重點(diǎn)對Cpx系統(tǒng)的信號感應(yīng)及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為Cpx系統(tǒng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)節(jié)細(xì)菌重要生理過程的研究提供參考依據(jù)。

Cpx雙組分系統(tǒng)；包膜應(yīng)激反應(yīng)；抗生素耐藥；酸應(yīng)激

細(xì)菌在感染或定植過程中會遇到各種不利環(huán)境，例如腸道病原菌在腸道內(nèi)需要承受各種壓力，包括pH值、營養(yǎng)成分的變化以及其他細(xì)菌產(chǎn)物和有毒化合物的存在等。革蘭陰性細(xì)菌的包膜是一個(gè)三層的隔室，由內(nèi)膜(internal membrane, IM)、外膜(outer membrane, OM)和周質(zhì)空間內(nèi)的肽聚糖層(peptido-glycan, PG)組成[1]。它是細(xì)菌細(xì)胞與環(huán)境之間的邊界，維持著細(xì)胞的形狀和完整性，也是營養(yǎng)物質(zhì)和有害產(chǎn)物的運(yùn)輸場所。許多壓力環(huán)境和抗菌劑會使細(xì)菌包膜發(fā)生損傷或缺陷，而細(xì)菌則通過包膜應(yīng)激反應(yīng)(envelope stress responses, ESRs)來感知、響應(yīng)這些信號從而適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的變化，維持包膜的功能和完整性。在革蘭陰性細(xì)菌中已定義了五種ESRs，包括Cpx (conjugative pilus expression)、σE(sigma factor)、Bae (bacterial adaptive response)、Rcs (regulator of capsule synthesis)和Psp (phage shock protein)系統(tǒng)[2]。當(dāng)它們受到多種包膜壓力誘導(dǎo)后，可以通過調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄來減輕包膜損害。其中Cpx是一個(gè)典型的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，能夠響應(yīng)各種可以引起細(xì)菌內(nèi)膜及周質(zhì)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的包膜壓力[3]。

20世紀(jì)80年代初，基因首次被McEwen等[4]發(fā)現(xiàn)。數(shù)年后，序列分析將CpxA鑒定為雙組分系統(tǒng)中的傳感蛋白[5]，同時(shí)上游的基因也被發(fā)現(xiàn)[6]。在此之后對Cpx系統(tǒng)的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)Cpx系統(tǒng)的激活可減輕包膜蛋白的錯(cuò)誤折疊[7]，確立了其作為新型包膜應(yīng)激反應(yīng)的觀點(diǎn)。90年代至今的研究陸續(xù)表明，Cpx系統(tǒng)能被數(shù)十種刺激誘導(dǎo)，包括錯(cuò)誤折疊蛋白[8]、堿性pH[9]、金屬[10,11]等。此外，一些作用于細(xì)胞膜的抗生素和抗菌肽在損害包膜后也可能會激活Cpx系統(tǒng)[12,13]。由于這些刺激大多數(shù)都會導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，因此推測出一個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模型，即錯(cuò)誤折疊的包膜蛋白激活了Cpx系統(tǒng)，使得CpxR磷酸化后調(diào)控一些周質(zhì)伴侶和蛋白酶的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而使這些錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)得到重新折疊或降解，最終減輕包膜的壓力。近年來許多研究將注意力集中在Cpx反應(yīng)調(diào)控內(nèi)膜相關(guān)基因的表達(dá)上[14]，這些研究也為Cpx的一些調(diào)節(jié)表型提供了可能的解釋，例如抗生素耐藥性等。為了加深人們對這一重要調(diào)控系統(tǒng)的理解，本文將對Cpx系統(tǒng)的信號感應(yīng)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 Cpx系統(tǒng)的組成

Cpx系統(tǒng)是由位于細(xì)胞質(zhì)中的反應(yīng)調(diào)節(jié)器 (response regulator, RR) CpxR和細(xì)胞內(nèi)膜上的傳感器組氨酸激酶 (histidine kinase, HK) CpxA組成的雙組分系統(tǒng)。位于細(xì)胞周質(zhì)中的CpxP是一種輔助調(diào)節(jié)蛋白，既可作為該系統(tǒng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑，又可作為應(yīng)激反應(yīng)的效應(yīng)子，因此也屬于Cpx系統(tǒng)的一員[15](圖1，A和B)。

感應(yīng)激酶CpxA是Cpx雙組分系統(tǒng)中的關(guān)鍵成分。CpxA通常由兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(two transmem-brane domains, TMDs)、一個(gè)周質(zhì)感受域(periplasmic sensory domain, PSD)和一個(gè)胞質(zhì)傳輸域(transmitter domain)組成，同時(shí)具有激酶活性和磷酸酶活性[16,17]。CpxR是位于胞質(zhì)中的反應(yīng)調(diào)節(jié)子，包含一個(gè)天冬氨酸(D51)為磷酸化位點(diǎn)的N末端接收域(N-terminal receiver domain, REC)以及一個(gè)C末端效應(yīng)域(C-terminal effector domain, trans_reg_C)，該區(qū)域作為靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子介導(dǎo)反應(yīng)輸出[18]。在其磷酸化狀態(tài)下，以5?-GTAAA(n5)GTAAA-3?作為其共有識別序列與DNA結(jié)合[19]。CpxR的失活可通過CpxA的磷酸酶活性或Ser/Thr磷酸酶PrpA實(shí)現(xiàn)[16,20]。Cpx系統(tǒng)的第三種成分是周質(zhì)輔助蛋白CpxP蛋白[21]，CpxP是Cpx系統(tǒng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑[22]。

2 Cpx系統(tǒng)的信號感應(yīng)

與許多雙組分系統(tǒng)一樣，Cpx特定包膜應(yīng)激信號的分子性質(zhì)仍然是一個(gè)懸而未決的問題。當(dāng)前Cpx信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中最有趣的話題之一是多重信號可以影響該通路，并在信號級聯(lián)的不同檢測點(diǎn)被感知。越來越多的研究表明，在Cpx系統(tǒng)中，至少有四種蛋白參與信號感知：外膜脂蛋白NlpE、周質(zhì)蛋白CpxP、內(nèi)膜HK CpxA和細(xì)胞質(zhì)RR CpxR (圖1C)。

2.1 Cpx系統(tǒng)的信號激活機(jī)制

1995年Silhavy等[8]首次發(fā)現(xiàn)，脂蛋白NlpE的過量表達(dá)是影響大腸桿菌(Escherichia )野生型中完整Cpx信號級聯(lián)的激活信號。至今已經(jīng)識別出許多激活Cpx響應(yīng)的信號，包括外環(huán)境變化如堿性pH[9]、中等酸性pH[23]、高滲透壓[24]、疏水表面的附著[25]，外源毒性物質(zhì)如哺乳動物肽聚糖識別蛋白[13]、乙醇[26]、正丁醇[27]、吲哚[28,29]、銅[11]、氨基糖苷和β-內(nèi)酰胺類抗生素[12,30]，內(nèi)源信號如錯(cuò)誤折疊的菌毛蛋白過表達(dá)[31,32]、膜磷脂比率改變[33]、外排泵組件的缺失[34]、生長及過量碳源[35]、低cAMP水平[36]等。盡管這些刺激信號的數(shù)量龐大且性質(zhì)廣泛，很難對其分子性質(zhì)下結(jié)論，但人們一直認(rèn)為錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)是包膜應(yīng)激信號的重要部分，因?yàn)橐炎C實(shí)大腸桿菌中一些受Cpx調(diào)控最強(qiáng)的基因編碼了周質(zhì)伴侶和蛋白水解因子[37]，并且許多得到深入研究的激活條件都涉及在周質(zhì)中直接或間接產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)。最近一些研究結(jié)果提示，Cpx信號通路可能會感應(yīng)內(nèi)膜上出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊蛋白時(shí)產(chǎn)生的內(nèi)源性有毒分子，可能與先前確定的某些誘導(dǎo)Cpx途徑的刺激信號有關(guān)[34,38]，但該假說目前還有待證實(shí)。

圖1 Cpx系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程及其下游所調(diào)控的生命活動

A：CpxA及CpxP的結(jié)構(gòu)及相互作用；B：CpxR的結(jié)構(gòu)；C：Cpx系統(tǒng)感應(yīng)壓力信號；D：CpxR調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.2 Cpx系統(tǒng)的信號傳遞機(jī)制

盡管上述刺激大多數(shù)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，但Cpx系統(tǒng)對特定信號的感知具有不同的機(jī)制。目前已經(jīng)確定的CpxA輔助調(diào)節(jié)因子CpxP和NlpE都通過與CpxA的感知域(直接或間接)之間的交互來起作用，因此CpxA顯然是包膜應(yīng)激信號的樞紐。但是近年來，細(xì)胞質(zhì)信號能夠獨(dú)立于CpxA來改變Cpx信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的證據(jù)也相繼出現(xiàn)。

2.2.1 NlpE激活Cpx系統(tǒng)

當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞粘附到疏水表面時(shí)，外膜脂蛋白NlpE能夠作為輔助蛋白向CpxA傳遞信號，激活Cpx系統(tǒng)[25]。X射線晶體學(xué)顯示NlpE蛋白是一個(gè)雙桶狀結(jié)構(gòu)，N端錨定在OM中，并且膜結(jié)合對NlpE的信號傳遞功能至關(guān)重要。基于此有人提出OM脂蛋白NlpE與IM上的CpxA相互作用的兩種可能性[39]：一種是，在表面粘附過程中，N端結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化可以使C末端結(jié)構(gòu)域穿過周質(zhì)與IM接觸；另一種是，當(dāng)周質(zhì)蛋白折疊機(jī)制超負(fù)荷時(shí)，NlpE無法正確折疊，從而阻礙了負(fù)責(zé)胞內(nèi)脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的Lol (localization of lipoprotein)運(yùn)輸系統(tǒng)的識別，導(dǎo)致NlpE到達(dá)IM處，激活Cpx反應(yīng)。最新研究數(shù)據(jù)顯示[40]，當(dāng)NlpE在IM上錯(cuò)誤定位時(shí)，NlpE的C端結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑px的激活是必不可少的，但只有NlpE的N末端域能與CpxA交互作用。此外，OM錨定的N末端結(jié)構(gòu)域似乎不可能跨越周質(zhì)與CpxA形成復(fù)合物?，F(xiàn)階段不能排除NlpE和CpxA復(fù)合物中存在其他成分，需要進(jìn)一步研究闡明NlpE的N端域如何與CpxA交互作用。除了表面粘附之外，NlpE也許可以檢測到多種包膜成分，包括脂質(zhì)、脂多糖或肽聚糖等[39]。長鏈脂肪酸代謝影響大腸桿菌中二硫鍵的形成，并且此過程中產(chǎn)生的包膜信號(氧化還原狀態(tài))能夠激活Cpx系統(tǒng)[41]，這可能是通過影響能夠感知氧化還原狀態(tài)的NlpE中二硫鍵的形成來誘導(dǎo)的[40]。此外，Cpx系統(tǒng)能夠通過NlpE感應(yīng)銅離子水平[11]，并且NlpE N末端的CXXC基序可能能夠螯合銅離子[39]。

2.2.2 CpxP抑制Cpx系統(tǒng)

CpxP還有一個(gè)功能就是參與信號傳遞。在包膜壓力條件下，CpxP被大量誘導(dǎo)，并且其作為CpxA負(fù)調(diào)節(jié)劑的活性消失[42]。目前的研究表明，諸如堿性pH和高鹽濃度等條件會導(dǎo)致Cpx系統(tǒng)活化，且有部分依賴于CpxP[24,43]。堿性pH可能引起CpxP構(gòu)象發(fā)生輕微改變，使其無法精確地契合在CpxA的感受域內(nèi)。高鹽濃度則很可能是通過干擾CpxP正電內(nèi)表面和CpxA負(fù)電感受域之間的極性作用來實(shí)現(xiàn)的。

德國柏林洪堡大學(xué)Sabine Hunke課題組提出，CpxP凹面正電荷表面可能與CpxA負(fù)電荷感受域相互作用，而錯(cuò)誤折疊的Pap-菌毛亞基暴露的疏水區(qū)可能通過與CpxP凸面的疏水區(qū)相互作用而使其遠(yuǎn)離CpxA，CpxP離開CpxA后與錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，成為DegP蛋白酶的底物[24]。但在對副溶血性弧菌()的研究中未能鑒定出CpxA感應(yīng)域與CpxP蛋白之間的相互作用[44]，因此，兩者相互作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。CpxP可能與周質(zhì)伴侶蛋白Spy[45]具有類似分子伴侶活性，但是還不清楚哪些配體可能與CpxP二聚體的相反電荷面結(jié)合。也可能存在另外的配體可以結(jié)合到CpxA和CpxP表面上形成三元信號復(fù)合物，或者CpxP能感知其他尚未被識別的信號。此外，CpxP晶體結(jié)構(gòu)中有鋅的存在，也表明CpxP可能與金屬結(jié)合[43]。因此CpxP在金屬感應(yīng)和蛋白質(zhì)折疊中的作用是未來研究的重要方向。

2.2.3 CpxA的信號感應(yīng)機(jī)制

組氨酸激酶CpxA是一個(gè)重要的信號樞紐。NlpE和CpxP都需要CpxA的周質(zhì)感受域來發(fā)揮誘導(dǎo)和抑制作用[16,22]。CpxA可能能夠直接感應(yīng)到一些錯(cuò)誤折疊的包膜蛋白，但其性質(zhì)尚未識別。大腸桿菌折疊缺陷麥芽糖結(jié)合蛋白MalE219突變在體外測定中能增加CpxA至CpxR的磷酸轉(zhuǎn)移[46]，這支持了CpxA直接感知錯(cuò)誤折疊蛋白的假說。CpxA周質(zhì)感受域可能感知到的信號還包括磷脂酰乙醇胺的消耗[33]、吲哚[28,29]、乙醇[26]、正丁醇[27]等影響細(xì)胞膜物理性質(zhì)的相關(guān)因素[47]。磷脂酰乙醇胺的消耗通過直接影響或改變細(xì)胞包膜成分間接激活CpxA[48]。但在大多數(shù)情況下，CpxA依賴的信號感應(yīng)可能涉及其他目前未知的輔助蛋白。最新的研究表明，在腸出血性大腸桿菌()中CpxA是神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺的受體，5-羥色胺能夠誘導(dǎo)CpxA去磷酸化，使Cpx系統(tǒng)失活[49]。目前，副溶血性弧菌CpxA周質(zhì)感受域(VpCpxA-peri)的晶體結(jié)構(gòu)已解析[44]，并研究了其Per-ARNT-SIM(PAS)域與CpxP的相互作用。加拿大Tracy L. Raivio課題組也解析了大腸桿菌CpxA感受域的結(jié)構(gòu)，遺傳分析表明CpxA感受域的突變幾乎都能導(dǎo)致該通路的激活，這說明CpxA活性主要通過抑制性信號調(diào)控，并且認(rèn)為重要的抑制信號傳遞在內(nèi)膜附近發(fā)生[50]。但目前除了CpxP以外，CpxA的抑制劑性質(zhì)仍然不確定。

2.2.4 CpxR的信號感應(yīng)機(jī)制

由于CpxR位于胞質(zhì)，與中央代謝產(chǎn)物相關(guān)的變化可以不通過CpxA直接影響CpxR靶標(biāo)的表達(dá)。cAMP水平降低[36]和葡萄糖或丙酮酸過量[35]分別誘導(dǎo)了和的表達(dá)。一項(xiàng)對CpxR信號整合途徑的研究表明[35]，在穩(wěn)定期培養(yǎng)基pH不被堿化的條件下，過量碳源可以使CpxR不依賴于CpxA而激活轉(zhuǎn)錄，這是通過Pta-AckA途徑發(fā)生的。但該研究結(jié)果不支持這種激活現(xiàn)象是由Pta-AckA途徑的直接產(chǎn)物(乙酸鹽、ATP和乙酰輔酶A)誘導(dǎo)的，并且認(rèn)為除了中間產(chǎn)物乙酰磷酸外，該途徑中可能存在其他的間接產(chǎn)物參與了CpxR的直接激活，這或許與一些非同源HK有關(guān)。隨后的研究證實(shí)了CpxR依賴于乙酰磷酸的磷酸化活性對于體外轉(zhuǎn)錄是必需的，并且證明RNA聚合酶(RNA polymerase, RNAP)的乙?；梢哉{(diào)節(jié)該轉(zhuǎn)錄過程[51]。此外，生長信號也可能依賴于CpxA和Pta-AckA兩條通路誘導(dǎo)CpxR激活[35]。盡管這些機(jī)制尚未完全闡明，但很明顯無需CpxA的參與，CpxR就能夠感應(yīng)與生長和中樞代謝有關(guān)的信號。

3 Cpx系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制

眾所周知，包膜應(yīng)激信號是通過細(xì)菌雙組分系統(tǒng)典型的磷酸轉(zhuǎn)移途徑傳遞的。在壓力下，組氨酸激酶CpxA磷酸化其自身保守的His殘基以響應(yīng)環(huán)境中的信號。隨后，HK的磷酸化基團(tuán)被轉(zhuǎn)移到RR反應(yīng)調(diào)節(jié)子CpxR特定的Asp殘基上。激活的RR通常通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)來影響細(xì)胞生理的變化。目前認(rèn)為CpxR的磷酸化水平主要取決于CpxA 的磷酸激酶和磷酸酶的活性比值[21]，這對于響應(yīng)外部刺激的特定遺傳反應(yīng)和其持續(xù)時(shí)間都至關(guān)重要(圖1D)。

3.1 Cpx系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3.1.1 Cpx調(diào)控基因的功能分類

最初鑒定出的Cpx調(diào)控靶基因與包膜蛋白折疊和降解(例如DegP、DsbA和PpiA)相關(guān)[19]。后續(xù)研究逐漸證實(shí)Cpx包膜應(yīng)激反應(yīng)具有更廣泛的功能，可以調(diào)控多種細(xì)胞功能分子的表達(dá)，例如蛋白質(zhì)易位基因()、毒力基因()、氨基酸生物合成基因(和)、磷脂培養(yǎng)基因()、DNA代謝基因()、鐵儲存和積累基因(和)等[52,53]。為了區(qū)分其靶基因功能，Price等[37]首先分析了大腸桿菌中Cpx系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性，表明受調(diào)控最強(qiáng)的為編碼包膜蛋白折疊相關(guān)蛋白的基因，中度調(diào)控的基因功能涉及生物膜形成。隨后更多的研究者在大腸桿菌[14]、杜克嗜血桿菌()[54]和霍亂弧菌()[55]中分別使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法對Cpx調(diào)控子進(jìn)行了詳細(xì)研究。目前鑒定出的Cpx調(diào)節(jié)子成員主要分為幾個(gè)功能類別，包括包膜蛋白復(fù)合物、內(nèi)膜相關(guān)蛋白、肽聚糖相關(guān)蛋白和其他細(xì)胞調(diào)節(jié)劑[14,56]。許多研究已將Cpx系統(tǒng)與各種復(fù)雜的細(xì)胞過程相連，如生物膜形成[57]和細(xì)菌致病機(jī)制[49,58]。

3.1.2 Cpx系統(tǒng)與其他包膜應(yīng)激系統(tǒng)的聯(lián)系

作為包膜應(yīng)激反應(yīng)的一員，Cpx系統(tǒng)與其他應(yīng)激調(diào)節(jié)途徑之間也存在聯(lián)系。目前的研究顯示，Cpx應(yīng)答與其他至少三個(gè)包膜應(yīng)激反應(yīng)直接相關(guān)。包括抑制編碼σE的操縱子的轉(zhuǎn)錄[37,53]；上調(diào)外排泵相關(guān)基因和以及BaeSR應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)子的表達(dá)[59]；通過正向調(diào)控內(nèi)膜定位的蛋白MzrA來提高其同源信號通路EnvZ/OmpR高滲透壓響應(yīng)系統(tǒng)的活性[60]。Cpx通路不僅通過調(diào)節(jié)其他調(diào)控通路的信號蛋白來建立連接，其活性也受到其他應(yīng)激反應(yīng)的影響。這些調(diào)控途徑之間相互聯(lián)系從而形成一個(gè)廣泛網(wǎng)絡(luò)。

3.2 Cpx系統(tǒng)激活后的壓力調(diào)控

Cpx系統(tǒng)在調(diào)節(jié)整體內(nèi)膜相關(guān)過程中的作用以及與其他細(xì)胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)系使其能夠影響多種復(fù)雜的細(xì)菌行為。Cpx反應(yīng)對病原菌致病能力的影響仍是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，除了對毒力的調(diào)控外，Cpx系統(tǒng)也能夠幫助細(xì)菌應(yīng)對感染過程中會接觸到的許多有毒物質(zhì)或一些不利環(huán)境，提高病原菌的抗脅迫能力。對Cpx依賴的壓力適應(yīng)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，將幫助人們更好地了解包膜應(yīng)激系統(tǒng)的調(diào)節(jié)子功能，發(fā)現(xiàn)更完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

3.2.1 Cpx系統(tǒng)對抗生素耐藥的調(diào)控

細(xì)菌接觸到臨床上使用的抗生素后會發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，往往可能誘導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生。包膜應(yīng)激系統(tǒng)與抵抗抗生素的能力有關(guān)。Cpx反應(yīng)對氨基糖苷類藥物耐藥性的影響早在幾十年前就被研究者觀察到[61,62]，隨后與β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥性的關(guān)聯(lián)也得到證實(shí)[12,63]，但目前的大部分研究并不支持Cpx在所有抗生素耐藥性中的廣泛作用。隨著研究的深入，在多種細(xì)菌中都觀察到Cpx反應(yīng)與多種抗生素的耐藥性相關(guān)(表1)。

Cpx介導(dǎo)的多種基因調(diào)控可能通過增加多藥耐藥外排泵、維持外膜完整性、降低呼吸作用等方式賦予細(xì)菌耐藥性。首先，Cpx反應(yīng)已被證明可以直接影響外排泵的表達(dá)來調(diào)節(jié)有毒分子進(jìn)入細(xì)胞。大腸桿菌中Cpx激活通過增加及MDR外排泵和的表達(dá)，對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性[66,76]。在鼠傷寒沙門氏菌中也證實(shí)，CpxR可以被Pta-Acka途徑生成的乙酰磷酸激活，通過調(diào)節(jié)AcrAD-TolC 和AcrAB-TolC外排泵的表達(dá)影響對β-內(nèi)酰胺和氨基糖苷類藥物的抗性[70]。霍亂弧菌和肺炎克雷伯菌等病原微生物的抗生素耐藥性也與Cpx激活調(diào)節(jié)MDR外排泵表達(dá)有關(guān)[63,69,74]。這表明，Cpx反應(yīng)對MDR外排泵的調(diào)控以及由此產(chǎn)生的抗生素的耐藥性，在遠(yuǎn)親γ-變形菌屬中是保守的。

外膜通透性的改變可能會影響某些藥物到達(dá)其靶點(diǎn)的能力。Cpx位點(diǎn)的突變會改變外膜結(jié)構(gòu)，并且調(diào)控OmpF和OmpC孔蛋白的產(chǎn)生[14,77]?？椎鞍椎南抡{(diào)可減少滲透，降低對多種抗生素的敏感性。Cpx激活后還可以通過增加細(xì)胞壁酰胺酶AmiA和AmiC的表達(dá)來恢復(fù)外膜完整性，使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[78]。最近在產(chǎn)氣克雷伯菌的研究中發(fā)現(xiàn)，CpxA Y144N突變激活Cpx反應(yīng)，導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶基因過表達(dá)，從而引起對β-內(nèi)酰胺類藥物的抗性。這可能與Cpx調(diào)節(jié)細(xì)胞壁修飾酶Slt的表達(dá)來調(diào)節(jié)適應(yīng)性反應(yīng)有關(guān)[12]。但Cpx反應(yīng)如何改變外膜完整性以增加對有毒化合物的抗性機(jī)制尚不清楚。

一種觀點(diǎn)認(rèn)為，所有殺菌抗生素和其他有毒分子均通過涉及呼吸活動爆發(fā)的機(jī)制發(fā)揮其毒性作用，這種機(jī)制最終導(dǎo)致有害的活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生，從而殺死細(xì)胞[79,80]。并且認(rèn)為在抗生素存在的情況下，Cpx反應(yīng)是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的原因[81]。隨后有多個(gè)小組的研究反對了這一模型，其結(jié)果證明了Cpx系統(tǒng)的激活不會導(dǎo)致對抗生素的應(yīng)答而使得細(xì)胞死亡，反而會導(dǎo)致耐藥性增加[14,64]。隨后有研究發(fā)現(xiàn)敲除大腸桿菌Cpx系統(tǒng)后，在不同抗生素的處理下一些過氧化物酶相關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào)，羥基自由基生成減少，細(xì)菌存活率提高，提示Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)菌抗生素耐藥與ROS相關(guān)，但該研究中并未明確耐藥與Cpx系統(tǒng)活性的關(guān)系[82]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中Cpx反應(yīng)的激活導(dǎo)致編碼琥珀酸和NADH脫氫酶(、、)以及編碼電子傳遞鏈的細(xì)胞色素氧化酶()基因轉(zhuǎn)錄水平降低。這些變化可能導(dǎo)致呼吸減少，也可以解釋當(dāng)Cpx反應(yīng)被激活時(shí)觀察到的一些抗生素耐藥性，因?yàn)檫@些基因的突變都賦予了對氨基糖苷和羥基脲的耐藥性[14]。最近的研究表明，在鼠傷寒沙門氏菌中，ROS的降低只能解釋某一些Cpx系統(tǒng)的激活型突變體(如JS92-104)對氨基糖苷類的耐藥性，在其他一些激活條件下無法觀察到相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄改變[70]。因此，在不同的Cpx激活條件下，是否存在一個(gè)與耐藥性有關(guān)的共同因子，還有待探究。

表1 不同細(xì)菌中Cpx系統(tǒng)介導(dǎo)的抗生素耐藥性

Cpx系統(tǒng)除了影響呼吸缺陷和外排泵表達(dá)外，對內(nèi)膜蛋白水解的調(diào)節(jié)也可能引起氨基糖苷類耐藥。Cpx系統(tǒng)激活可能通過增加膜蛋白酶以及蛋白質(zhì)折疊因子基因(、、、等)的表達(dá)來降解翻譯錯(cuò)誤的膜蛋白，減少對細(xì)胞質(zhì)膜的損傷，從而產(chǎn)生氨基糖苷耐藥性[70]。

3.2.2 Cpx系統(tǒng)對酸應(yīng)激的調(diào)控

一些腸道細(xì)菌在消化道定植過程中必須對抗酸性環(huán)境。大腸桿菌已經(jīng)進(jìn)化出不同的酸脅迫反應(yīng)系統(tǒng)，包括對極端酸脅迫的耐酸反應(yīng)(acid resistance, AR1～5)系統(tǒng)和對輕中度酸脅迫的耐酸反應(yīng)(acid tolerance response, ATR)系統(tǒng)。早在1998年就有研究提出，Cpx系統(tǒng)能夠被堿性pH誘導(dǎo)[21]，但酸性環(huán)境與Cpx的關(guān)系還不清晰。直到近幾年的蛋白質(zhì)組學(xué)研究才提出，極端酸應(yīng)激可能是Cpx系統(tǒng)新的負(fù)調(diào)控靶標(biāo)[56]。該研究發(fā)現(xiàn)在Cpx激活后，8種與酸脅迫反應(yīng)相關(guān)的蛋白豐度降低(CydA、CydB、CadA、GadA、GadC、HdeA、HdeB和HdeD)。證明了Cpx對AR2系統(tǒng)的抑制，導(dǎo)致在極端酸脅迫(pH 2.0)下生存能力下降。與之不同的是，最近發(fā)表的研究證明了在指數(shù)生長期，中等酸性的pH值也是CpxA的激活信號，并提出Cpx是一種新的ATR系統(tǒng)[23]。pH值的降低使CpxA磷酸化，通過激活CpxR提高不飽和脂肪酸UFAs合成基因的轉(zhuǎn)錄，使大腸桿菌在pH 4.2下正常生長。這是因?yàn)楦淖兗?xì)菌膜脂肪酸組成有助于降低膜質(zhì)子通透性和改善內(nèi)部pH穩(wěn)態(tài)，提高細(xì)菌對酸性環(huán)境的適應(yīng)能力。這與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果并不矛盾，因?yàn)锳R2系統(tǒng)負(fù)責(zé)pH 3.0以下的保護(hù)，Cpx介導(dǎo)的對pH 3.0以上指數(shù)期AR2的抑制可以保證該系統(tǒng)不會被不適當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)，以避免代謝負(fù)擔(dān)。此外，Cpx增加細(xì)胞壁的穩(wěn)定性可能有助于保護(hù)大腸桿菌細(xì)胞免受酸脅迫[56,78,83]。CpxA也被證明可以與非同源反應(yīng)調(diào)控因子OmpR進(jìn)行串?dāng)_[84]，而OmpR本身也參與了大腸桿菌的酸脅迫反應(yīng)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)提出大腸桿菌Cpx系統(tǒng)參與酸應(yīng)激調(diào)控的模型：在指數(shù)生長的大腸桿菌中，Cpx系統(tǒng)被中等酸性pH激活，上調(diào)UFAs生物合成基因和，以及細(xì)胞壁修飾基因、、、和的轉(zhuǎn)錄，并抑制AR2系統(tǒng)基因。

4 結(jié)語與展望

目前清楚的是，Cpx包膜應(yīng)激系統(tǒng)可以通過CpxA依賴與非依賴形式，從多個(gè)檢測點(diǎn)感應(yīng)到多種類型的信號。磷酸化后的CpxR調(diào)控多種功能的靶基因表達(dá)，涉及編碼包膜蛋白復(fù)合物、內(nèi)膜蛋白、肽聚糖代謝酶的基因和一些轉(zhuǎn)錄因子等，同時(shí)與其他包膜應(yīng)激系統(tǒng)相互聯(lián)系，形成復(fù)雜、廣泛的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。最重要的是，Cpx反應(yīng)調(diào)節(jié)了許多病原體的毒力、抗生素抗性和酸應(yīng)激等表型。盡管我們對Cpx信號整合過程和調(diào)控基因功能的了解越來越多，但仍有許多問題有待解決：CpxA感應(yīng)到的信號分子性質(zhì)是什么？CpxA與已知或未知的輔助蛋白之間的作用機(jī)制是什么？是否存在其他直接激活CpxR的信號通路？Cpx調(diào)控子中還未知的蛋白功能是什么，參與調(diào)節(jié)了何種表型？是否存在一類受Cpx影響的共同因子，與所有抗生素抗性或酸應(yīng)激有關(guān)？目前先進(jìn)的技術(shù)有望幫助我們解決這些問題，進(jìn)一步加深對Cpx反應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)菌重要生命活動(包括致病、抵抗有毒物質(zhì)和不利環(huán)境等)的理解。這可能幫助促進(jìn)一些疫苗的開發(fā)[85]以及解決抗生素耐藥問題，如作為抗菌治療的藥物靶標(biāo)；該系統(tǒng)在生物生產(chǎn)中也具有潛在的應(yīng)用前景，如利用酸耐受的重組大腸桿菌進(jìn)行有機(jī)酸的生產(chǎn)?？偠灾U明Cpx系統(tǒng)信號整合和調(diào)控機(jī)制具有很大意義。

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Progress on the function and regulatory mechanisms of bacterial Cpx signal transduction system

Liwen Wu, Jie Zeng, Yunxin Xue, Xilin Zhao

The Cpx (conjugative pilus expression) two-component signal transduction system is a complex envelope stress response system in Gram-negative bacteria, which can sense a variety of extracellular stimuli that enter the signaling pathway at different points. The phosphorylation of the CpxR, the cytoplasmic cognate response regulator of the Cpx system, can lead to changes in the expression of genes encoding proteins involved in inner and outer membrane functions. Activation of the Cpx system contributes to bacterial resistance/tolerance to certain antibiotics and acidic stress. In this review, we summarize the composition, and the mechanisms of signal detection, and the transcriptional regulation of the Cpx system, with a goal to provide guidance for the study of the regulatory network of the Cpx system and its important regulatory roles in bacterial physiology.

Cpx two-component system; envelope stress responses; antibiotic resistance; acid stress

2021-06-10;

2021-07-14

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號：81971905)和福建省海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展補(bǔ)助資金項(xiàng)目(編號：FJHJF-L-2019-4)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81971905), and Marine Economy Development Subsidy Foundation of Fujian Province of China (No. FJHJF-L-2019-4)]

吳麗雯，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：公共衛(wèi)生。E-mail: wlw6621@126.com

趙西林，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：病原微生物與抗感染治療。E-mail: zhaox5@xmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.21-208

2021/7/22 15:48:29

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210722.1138.001.html

(責(zé)任編委: 謝建平)