細胞自噬基因Atg6在渦蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生中的功能研究

馬克學，李睿，郭芳瑩，宋鴿鴿，吳萌，陳廣文，劉德增

研究報告

細胞自噬基因在渦蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生中的功能研究

馬克學，李睿，郭芳瑩，宋鴿鴿，吳萌，陳廣文，劉德增

河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng) 453007

細胞自噬基因在細胞自噬過程中發(fā)揮重要作用，其功能缺陷影響神經(jīng)發(fā)生。渦蟲是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)再生的良好模型，其頭部切除后1周就能再生出一個新的頭部。因此，研究基因在渦蟲CNS再生中的作用對探究自噬調(diào)控神經(jīng)發(fā)生具有重要意義。本研究首次報道了日本三角渦蟲()基因()的分子特征，并利用RNAi技術(shù)研究了其在渦蟲CNS再生中作用。結(jié)果顯示：cDNA全長1366 bp，編碼423個氨基酸。DjATG6含有ATG6/Beclin 1蛋白家族的Coil-Coil結(jié)構(gòu)域和β折疊α螺旋自噬功能結(jié)構(gòu)域。渦蟲沿咽前咽后切割后，表達量顯著增加，其轉(zhuǎn)錄本主要在新再生的腦神經(jīng)節(jié)表達。RNAi-引起渦蟲頭部再生遲緩、腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)偏小，并下調(diào)神經(jīng)相關(guān)基因的表達。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，RNAi-不影響渦蟲干細胞的增殖，但下調(diào)細胞遷移相關(guān)基因和的表達，且干擾和的表達影響渦蟲頭再生。因此，本研究結(jié)果表明，在渦蟲CNS再生的組織重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，干擾影響渦蟲CNS再生可能與細胞遷移有關(guān)，其詳細的分子機制尚需進行深入研究。

渦蟲；細胞自噬；；再生；RNA干擾

細胞自噬是一種依賴溶酶體的蛋白質(zhì)降解途徑，廣泛參與細胞增殖、分化、遷移和細胞命運決定等重要的生物學過程[1,2]。神經(jīng)發(fā)生涉及細胞形態(tài)和功能的轉(zhuǎn)變，細胞自噬參與其中[3,4]。研究表明，Beclin 1 (哺乳動物ATG6的同源蛋白)在小鼠()側(cè)腦室室下區(qū)表達，Beclin 1+/–小鼠神經(jīng)球體面積縮小[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，Beclin 1下調(diào)表達與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[6]。上述研究說明，/在神經(jīng)發(fā)生和中樞神經(jīng)(central nervous system, CNS)穩(wěn)態(tài)維持過程中發(fā)揮重要作用。渦蟲(Platyhelminthes, Turbellaria)是體內(nèi)研究神經(jīng)發(fā)生的理想實驗動物，它能在一周內(nèi)再生出一個全新的腦結(jié)構(gòu)[7]。渦蟲的神經(jīng)再生吸引無數(shù)學者關(guān)注，雖然研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些調(diào)控渦蟲CNS再生的關(guān)鍵基因[8～10]，但其神經(jīng)發(fā)生的分子機制仍不十分清楚。渦蟲CNS再生是細胞增殖、分化、遷移和細胞死亡等諸多細胞生物學過程整合的復雜機制。雖然早有研究人員提出細胞自噬參與其中[11]，但并沒有相關(guān)研究報道。為了研究細胞自噬調(diào)控神經(jīng)發(fā)生的分子機制，本研究鑒定了日本三角渦蟲()同源基因，并用整體原位雜交和RNAi技術(shù)研究其在渦蟲CNS再生過程中作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

日本三角渦蟲來自本實驗室無性繁殖，實驗前至少饑餓7 d。再生實驗的渦蟲從咽前和咽后切成3段(頭部片段、軀干片段和尾部片段)，20℃避光培養(yǎng)。

1.2 日本三角渦蟲Atg6 cDNA克隆和生物信息學分析

隨機挑選5～6條渦蟲，在液氮中研磨成粉末，加入 1 mL Trizol試劑后按操作說明進行總RNA提取，然后取2 μg總RNA用于cDNA合成(PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit，日本TaKaRa公司)。根據(jù)從日本三角渦蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選出來的EST序列設計3′-RACE和5′-RACE特異性引物(附表1)，按照Clontech RACE cDNA試劑盒擴增cDNA片段。純化的PCR片段連接pMD19-T后篩選陽性克隆進行測序分析。根據(jù)測序結(jié)果拼接出全長cDNA序列，并利用DNAstar 軟件預測開放閱讀框(ORF)并推導出編碼的氨基酸序列。核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 網(wǎng)站進行，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析采用Pfam (https://pfam.xfam.org/)在線軟件，亞細胞定位預測利用在線軟件 (http:// www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)進行。

1.3 qRT-PCR分析

挑選軀干片段的再生渦蟲按上述方法進行總RNA提取和cDNA合成。實時熒光定量PCR在ABI 7500系統(tǒng)中進行，反應體系為20 μL：10 μL 2 × TB Green Premix ExII (ROX plus，日本TaKaRa公司)，上下游引物各 0.8 μL (10 μmol/L)，cDNA模板 1 μL，滅菌超純水 7.4 μL。PCR參數(shù)如下：95℃預變性5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。以為內(nèi)參基因，以2–ΔΔCT法[12]計算mRNA 相對表達量，實驗重復3次。本研究檢測的干細胞相關(guān)基因(、、、)和神經(jīng)相關(guān)基因(、、、、)的引物序列見附表1。采用SPASS 10.0軟件進行單因子方差分析，<0.05 表示顯著性差異。

1.4 整體原位雜交

原位雜交探針的合成采用 digoxigenin-labeling kit (SP6/T7, 美國Roche公司)，擴增模板所用的引物序列見附表1。整體原位雜交(whole mounthybridization, WISH)根據(jù)文獻[13]操作并稍微修改。主要步驟如下：渦蟲用2%HCl處死后立即用4%甲醛固定，然后經(jīng)過6%H2O2漂白，蛋白酶K處理，然后加入400 ng/mL探針，56℃雜交>16 h。雜交信號用BCIP/NBT顯色，用Leica DFC300FX顯微鏡拍照后用Adobe Photoshop處理。

1.5 dsRNA干擾實驗

雙鏈RNA (double-stranded RNA，dsRNA) 合成使用MEGAscript RNAi Kit (Ambion 1626)，擴增模板所用的引物序列見附表1。RNAi-采用注射法，純化后的dsRNA按照文獻[14, 15]中的操作方法注射渦蟲，渦蟲隔天注射一次，每次4×46 nL，共注射5次。注射結(jié)束后24 h切割渦蟲，觀察再生表型，用Leica DFC300FX顯微鏡拍照再生渦蟲，保存圖片并用系統(tǒng)附帶的測量工具測量再生胚基長度。測量數(shù)據(jù)采用SPASS 10.0軟件進行統(tǒng)計學處理。干擾組和對照組總RNA提取和qRT-PCR檢測方法見1.2和1.3部分，檢測相關(guān)基因的表達量所用引物見附表1。陰性對照為GFP dsRNA，陽性對照為dsRNA。RNAi實驗至少重復3次。

基質(zhì)金屬蛋白水解酶(matrix metalloproteinases, MMPs)調(diào)控細胞外基質(zhì)動態(tài)變化，參與細胞遷移和細胞分化。已有研究表明，干擾和的表達影響渦蟲干細胞遷移[16]。為進一步驗證這個實驗結(jié)果，本研究采用Rouhana等[17]提供的方法合成和dsRNA (所用引物見附表1)并進行干擾實驗。將合成的10 mg dsRNA與30 μL牛肝勻漿混合后喂食25條左右長度為3～4 mm渦蟲，間隔3 d喂食一次，共喂食8次。喂食結(jié)束后次日切割渦蟲觀察再生表型，用Leica DFC300FX顯微鏡拍照再生蟲子并測量再生胚基長度。實驗結(jié)果采用SPASS 10.0軟件進行統(tǒng)計學處理。

1.6 免疫熒光

整體免疫熒光按照文獻[18]中的方法進行操作。磷酸化組蛋白H3(H3P)抗體(Millipore 06-870，1:200 diluted in PBST)用于檢測有絲分裂細胞，anti- SYNORF1 (3C11)抗體(DSH, 1:20 diluted in PBST)用于顯示渦蟲CNS。二抗goat anti-rabbit Alexa Fluor 594和 goat anti-mouse Alexa Fluor 488 1:400倍稀釋用于檢測陽性信號，Stereo ?uorescence microscope (Axio Zoom. V16，德國蔡司公司)拍照并保存圖片。統(tǒng)計H3P+陽性細胞的數(shù)量采用Image J 軟件進行，按照細胞數(shù)量/面積進行分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)經(jīng)SPASS 10.0軟件進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本三角渦蟲Atg6基因的鑒定和生物信息學分析

本研究采用RACE技術(shù)解析了日本三角渦蟲細胞自噬基因(命名為)的全長cDNA序列(GenBank登錄號：MG209579)。cDNA全長1366 bp，5′-末端有26 bp非翻譯區(qū)，3′-末端有68 bp非翻譯區(qū)并含有polyA尾巴，在polyA尾巴上游9 bp處可見AATAAA的加尾信號(圖1)。經(jīng)DNAstar 軟件分析，該基因開放閱讀框(ORF)長度1272 bp，編碼423個氨基酸，分子量49 kDa。Pfam在線軟件分析顯示，DjATG6蛋白含有ATG6蛋白家族Coil-Coil結(jié)構(gòu)域(圖1，下劃線顯示位于104～229位氨基酸殘基)和自噬功能結(jié)構(gòu)域(圖1，雙下劃線顯示位于231～407位氨基酸殘基)。亞細胞定位分析顯示該蛋白定位于細胞質(zhì)中的囊泡(圖略)。Blast檢索顯示，DjATG6與已經(jīng)報道的無脊椎動物和脊椎動物ATG6蛋白有很高的相似度(圖略)，說明DjATG6屬于ATG6蛋白家族成員。

2.2 DjAtg6在渦蟲再生過程中時空表達

渦蟲的腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)簡單，由1對腦神經(jīng)節(jié)構(gòu)成，呈倒“U”型(圖2B)。為了研究在渦蟲腦神經(jīng)再生中的功能，本研究首先利用qRT-PCR方法檢測了在渦蟲再生過程中的表達變化，結(jié)果顯示切割后再生3 d的表達量顯著增加，再生5～7 d表達量維持在較高水平(圖2A)。進一步用WISH技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)錄本的分布模式，結(jié)果顯示渦蟲再生1 d的陽性雜交信號開始在胚基前端出現(xiàn)(圖2D)。渦蟲再生3 d，雜交信號非常清晰的顯示出1對腦神經(jīng)節(jié)(圖2D)，與渦蟲CNS marker基因的表達模式非常相似(圖2C)。渦蟲再生5～7 d，特異性雜交信號清晰的顯示出渦蟲呈倒“U”型腦神經(jīng)節(jié)(圖2D)。渦蟲再生10～15 d，特異性雜交信號減弱但腦神經(jīng)節(jié)仍隱約可見(圖2D)。結(jié)果表明，可能參與渦蟲腦再生組織結(jié)構(gòu)的重新構(gòu)建。

圖1 日本三角渦蟲Atg6基因核苷酸序列和編碼區(qū)氨基酸序列

方框分別顯示起始密碼子、終止密碼子和polyA加尾信號。下劃線顯示ATG6蛋白家族的標簽序列Coil-Coil結(jié)構(gòu)域，雙下劃線顯示自噬功能結(jié)構(gòu)域。

2.3 RNAi-DjAtg6對渦蟲再生的影響

為研究在渦蟲再生中的作用，采用RNAi技術(shù)抑制該基因的表達。結(jié)果顯示，RNAi-導致大多數(shù)渦蟲再生遲緩(圖3B，56/78)，形成一個較小的頭部，且眼點不明顯。本研究測量了對照組和RNAi組再生胚基的長度，結(jié)果表明對照組胚基長度是0.547±0.062 mm，而RNAi-實驗組胚基長度是0.332±0.051 mm。與對照組相比，實驗組新再生的胚基長度縮短了約40% (圖3C)。本研究采用qRT-PCR檢測了內(nèi)源性的表達，結(jié)果顯示RNAi組表達量降低了約80% (圖3D)，且干擾的陽性對照組渦蟲能夠再生出雙頭渦蟲表型(圖 3B，22/22)。上述結(jié)果說明，本研究的干擾方法可靠，RNAi有效抑制了的表達。

圖2 DjAtg6的時空表達模式

A：qRT-PCR 檢測在渦蟲再生過程中的表達變化。以再生0 h的渦蟲為對照，收集軀干片段再生渦蟲提取RNA進行檢測，實驗重復3 次，**0.01。B：anti-SYRNORF1 抗體顯示渦蟲腦結(jié)構(gòu)：1對腦神經(jīng)節(jié)組成。C：渦蟲CNS marker基因探針顯示1對腦神經(jīng)節(jié)(再生3 d)。D：整體和再生渦蟲中表達模式。箭頭顯示1對腦神經(jīng)節(jié)，標尺：1 mm。

2.4 RNAi-DjAtg6對渦蟲CNS再生和神經(jīng)相關(guān)基因表達的影響

為進一步研究RNAi-對渦蟲CNS再生的影響，本研究采用anti-SYNORF1(3C11)抗體顯示渦蟲腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)[18]。結(jié)果如圖4A所示，干擾組腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)顯著小于對照組，腦神經(jīng)節(jié)較短且不明顯。此外，本研究進一步采用qRT-PCR檢測了幾個與神經(jīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(圖4B)?；蚓幋a的轉(zhuǎn)錄因子對動物CNS發(fā)育非常重要[19]，干擾后其表達量下降了約30%，是對照水平的0.66倍。已有研究證明，、和編碼的轉(zhuǎn)錄因子對渦蟲腦神經(jīng)再生非常重要[10]，干擾后它們的表達量分別是對照水平的0.51倍、0.47倍和0.33倍。編碼的轉(zhuǎn)錄因子在渦蟲腦神經(jīng)節(jié)表達[10]，干擾后其表達量是對照水平的0.58倍?？梢?，干擾降低了渦蟲腦神經(jīng)相關(guān)基因的表達。

2.5 RNAi-DjAtg6對渦蟲干細胞相關(guān)基因表達的影響

渦蟲再生是以干細胞的增殖和分化為基礎。為了驗證干擾引起小頭表型是否與干細胞的增殖活性降低有關(guān)，本研究首先檢測了細胞有絲分裂指數(shù)的變化。H3P+陽性細胞是反映細胞有絲分裂數(shù)量的常用指標[20]。免疫熒光顯示，H3P+陽性細胞的數(shù)量對照組是220±35/mm2，而實驗組是235±24/mm2(圖5，A和B)，兩則相比沒有顯著性差異。本研究進一步采用qRT-PCR技術(shù)檢測了渦蟲干細胞相關(guān)基因的表達變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，干擾組渦蟲干細胞markers基因(、、、)的表達量沒有明顯降低(圖5C)。為了驗證干擾是否影響了干細胞遷移，本研究檢測了兩個與細胞遷移相關(guān)的基因[16]，結(jié)果顯示和基因的表達量分別降低了約40%和30%，是對照水平的0.55倍和0.68倍。上述研究結(jié)果說明，干擾不影響干細胞的增殖活性，但可能影響干細胞的遷移和分化。

圖3 RNAi-DjAtg6對渦蟲再生的影響

A：RNAi干擾方案和再生觀察時間點示意圖。B：渦蟲再生(5 d)表型。56/78表示78條渦蟲中有56條表現(xiàn)出再生遲緩表型。箭頭指示眼點位置，黑色斷續(xù)線顯示新舊組織分界線。以RNAi-GFP為陰性對照，RNAi-為陽性對照。標尺：0.5 mm。C：干擾組和陰性對照組胚基再生長度的比較。*0.05。D：qRT-PCR檢測干擾后內(nèi)源性相對表達量。GFP dsRNA 為對照，實驗重復3次，**0.01。

圖4 RNAi-DjAtg6對CNS再生和神經(jīng)相關(guān)基因表達的影響

A：anti-SYNORF1免疫熒光顯示渦蟲腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)。標尺: 200 μm。B：qRT-PCR檢測神經(jīng)相關(guān)基因的相對表達量。實驗重復3次，*0.05，**0.01。

圖5 RNAi-DjAtg6對有絲分裂指數(shù)和干細胞相關(guān)基因表達的影響

A：H3P+免疫熒光顯示對照組和干擾組有絲分裂細胞。再生5 d渦蟲，標尺：200 μm。B：定量統(tǒng)計對照組和干擾組H3P+陽性細胞數(shù)量，沒有顯著性差異。=6。C：qRT-PCR檢測干細胞相關(guān)基因的相對表達量。實驗重復3次，*0.05，**0.01。

2.6 RNAi-mmp1和RNAi-mmp2對渦蟲再生的影響

已有研究表明，RNAi-和RNAi-影響渦蟲再生[16]。為了驗證這一結(jié)果，本研究采用喂食dsRNA方法對渦蟲和進行干擾實驗。結(jié)果表明：RNAi-后約36%的軀干片段(7/19)頭再生遲緩，約57%的尾部片段(11/19)頭再生異常(圖6A)；RNAi-后約45%的軀干片段(10/22)頭再生遲緩，約59%的尾部片段(13/22)頭再生異常(圖6B)。進一步測量了對照組和干擾組再生胚基的長度，結(jié)果表明對照組胚基長度是0.584±0.047 mm，RNAi-組胚基長度是0.318±0.082 mm，RNAi-組胚基長度是0.366±0.064 mm。與對照組相比，RNAi-組和RNAi-組新再生的胚基長度分別縮短了約50%和40%。本研究結(jié)果進一步證明，RNAi-和RNAi-影響渦蟲再生。

3 討論

人和其他脊椎動物CNS再生能力很弱，受到創(chuàng)傷后很難修復。渦蟲是少數(shù)CNS能夠完全再生的動物。因此，渦蟲CNS再生受到眾多學者關(guān)注并發(fā)現(xiàn)了大量影響渦蟲CNS再生的基因[10]。渦蟲CNS再生涉及到干細胞的增殖、分化、遷移等諸多細胞生物學過程。干細胞向神經(jīng)前體細胞到神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)變涉及到細胞質(zhì)動態(tài)的變化和不斷重塑，而細胞自噬介導的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)必定參與其中，但細胞自噬調(diào)控渦蟲CNS再生相關(guān)的研究尚未見報道。本研究首先克隆了日本三角渦蟲同源基因cDNA序列，該序列編碼的蛋白質(zhì)含有ATG6/Beclin 1蛋白家族的Coil-Coil結(jié)構(gòu)域和自噬功能結(jié)構(gòu)域[21]。其他研究表明，細胞自噬蛋白Beclin 1 (ATG6同源蛋白)參與調(diào)控神經(jīng)發(fā)生[5]。因此，本文重點研究了自噬基因在渦蟲CNS再生中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，該基因在正常渦蟲個體表達較弱，切割渦蟲后其表達量隨再生過程逐漸增加，且其轉(zhuǎn)錄本在新再生的CNS表達。由此推測，上調(diào)表達促進了渦蟲CNS再生。干擾引起渦蟲頭部再生遲緩、腦神經(jīng)節(jié)偏小，且干擾引起神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達下降。本研究結(jié)果揭示DjATG6是渦蟲CNS再生的重要調(diào)控因子。但是，干擾并不影響渦蟲干細胞的增殖和分裂，但影響與細胞遷移相關(guān)基因和的表達。本研究進一步證明，RNAi-和RNAi-影響渦蟲頭再生，且已有研究證明RNAi-和RNAi-影響渦蟲干細胞遷移[16]。諸多研究表明，MMP通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的變化從而影響動物中樞神經(jīng)發(fā)育[22,23]。值得關(guān)注的是，細胞自噬相關(guān)蛋白NBR1通過調(diào)節(jié)粘著斑的裝配影響細胞遷移[24]。其他研究發(fā)現(xiàn)，過表達Beclin 1能夠激活自噬，恢復敲降let-7引起的神經(jīng)元細胞遷移障礙[25]。綜合上述研究結(jié)果，本研究推測干擾引起渦蟲CNS再生遲緩可能影響了細胞遷移，但具體的分子機制有待深入研究?？傊?，以渦蟲為模型研究細胞自噬調(diào)控CNS再生的分子機制對理解高等動物神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)創(chuàng)傷修復具有重要的意義。

圖6 RNAi-mmp1和RNAi-mmp2對渦蟲頭部再生的影響

A：RNAi-對渦蟲軀干片段和尾部片段頭部再生的影響。B：RNAi-對渦蟲軀干片段和尾部片段頭部再生的影響。C：干擾組和對照組胚基再生長度的比較。黑色斷續(xù)線顯示新舊組織分界線，標尺：500 μm，**0.01。

附加材料詳見文章電子版www.chinagene.cn。

感謝中國科學院上海營養(yǎng)與健康研究所荊清教授和清華大學吳畏教授在渦蟲研究技術(shù)方面給予的幫助。

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附表1 本研究所用引物信息

Supplementary Table 1 Primers used in this study

Functional analysis of autophagy-related genein planarian central nervous system regeneration

Kexue Ma, Rui Li, Fangying Guo, Gege Song, Meng Wu, Guangwen Chen, Dezeng Liu

Autophagy-related gene 6 () plays an essential role in autophagy, and loss of its function impairs neurogenesis. Planarian is a good model for the study of the central nervous system (CNS) regeneration. It can regenerate a new headin 1 week following decapitation. Therefore, functional analysis ofin planarian CNS regeneration is very important for understanding of autophagy in the regulation of neurogenesis. In this work, we reported the molecular characteristics ofin() for the first time and examined its function by RNAi. The full-length cDNA ofis 1366 bp encoding 423 amino acids. The deduced amino sequence ofcontains the coil-coil domain and--repeated autophagy-specific domain shared by ATG6/Beclin 1 family. Following amputation before and after the pharynx,transcripts increased and were mainly distributed in the newly regenerated brain structure. RNAi-delayed planarian head regeneration with a small size of brain, and decreased the expression levels of neural-related genes. In addition, our results revealed that RNAi-did not affect the stem cell proliferation, but down-regulated the cell migration-related genesand. Furthermore, RNAi-and RNAi-delayed planarian head regeneration. Therefore, our results suggest thatis important for planarian CNS regeneration. The abnormal CNS regeneration caused by RNAi-may be related to cell migration, but the detailed mechanism needs to be further investigated.

planarian; autophagy;; regeneration; RNA interference

2021-03-30;

2021-06-21

國家自然科學基金項目(編號：31572267，31471965)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31572267,31471965)]

馬克學，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：渦蟲再生和抗逆性的分子機制。E-mail: makexue@sina.com

陳廣文，博士，教授，博士生導師，研究方向：渦蟲再生和資源保護。E-mail: Chengw0183@sina.com

10.16288/j.yczz.21-118

2021/7/22 11:30:46

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210721.1145.002.html

(責任編委: 林古法)