藤茶總黃酮通過調(diào)控TGF-β1/p38MAPK通路對肝纖維化大鼠的作用及機(jī)制研究

李 雯，李木松，王利兵

（1.邯鄲市第三醫(yī)院藥劑科，河北 邯鄲 056000；2.保定市人民醫(yī)院肝五科，河北 保定 071000；3.唐山市工人醫(yī)院肝膽外科，河北 唐山 063000）

肝纖維化是各種肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)步驟，是影響慢性肝病預(yù)后的重要因素。隨著全世界慢性肝病患者的增加，肝纖維化的防治尤為重要，尋找有效抑制肝纖維化的藥物也日漸緊迫[1]。近年來，西藥治療肝纖維的局限性逐漸顯現(xiàn)，中藥研究逐漸被重視。中醫(yī)認(rèn)為[2]，肝纖維化病機(jī)為正虛血瘀，正虛為肝腎陰虛與脾腎陽虛，血瘀為瘀阻肝絡(luò)，因此辨證論治，解毒通絡(luò)是主要治療思路。藤茶總黃酮（TF）是從藤茶中提取的有效成分，藤茶是民間常用的治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、肝炎肝硬化等疾病的藥物。有研究表明[3]，藤茶總黃酮具有消炎抑菌、降血脂、止咳化痰、抗氧化和保肝護(hù)肝等功效，但藤茶總黃酮在體內(nèi)通路的作用機(jī)制尚不明確。研究表明[4]轉(zhuǎn)化生長因子β1/p38-促分裂原活化蛋白激酶（TGF-β1/p38MAPK）通路在形成肝纖維化過程中起到重要作用，因此本研究通過皮下注射四氯化碳（CCl4）構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，口服灌胃觀察藤茶總黃酮對大鼠肝纖維化的作用，通過TGF-β1/p38MAPK 通路闡述藤茶總黃酮修復(fù)肝纖維化的作用機(jī)制，為肝纖維化治療提供更多思路和可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級Wistar 大鼠，雄性65 只，6 周齡，體質(zhì)量190～230 g，12 h 照明，自由進(jìn)食飲水，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號SCXK（蘇）2016-0010。藤茶總黃酮含量47.52%（寶雞晨光生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：20190306），金龍魚花生油（保定沃爾瑪超市，生產(chǎn)批號：20151029），激動(dòng)劑（anisomycin）（德國Merck 公司，10 mg/支），四氯化碳（CCl4，廣東西隴化工，生產(chǎn)批號：20150511），I 型膠原蛋白（Col Ⅰ）試劑盒、III 型膠原蛋白（Col Ⅲ）試 劑 盒（美 國R&D 公 司），兔 抗 鼠TGF-β1、p38MAPK、α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、小鼠抗大鼠β-actin 抗體（美國Abcam 公司），一抗、2× SYBR Green 熒光染料（美國Roche 公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司），BCA蛋白定量試劑盒、ECL顯影液（美國Bio-rad公司），HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）全自動(dòng)生化分析儀（山東博科生物公司），RM2535 切片機(jī)（日本Leica 公司），CX40 顯微鏡（日本Olympus 公司），水平電泳儀、垂直電泳儀、CheniDoc Touch 成像分析系統(tǒng)、CFX Connect 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國Biorad 公司），Epoch 酶標(biāo)儀（德國Bioeck 公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 對照組（背部皮下注射花生油加灌胃生理鹽水）、模型組（背部皮下注射25% CCl4加灌胃生理鹽水）、藤茶總黃酮低劑量組（背部皮下注射25% CCl4加灌胃75 mg/kg 藤茶總黃酮）、藤茶總黃酮高劑量組（背部皮下注射25% CCl4加灌胃300 mg/kg 藤茶總黃酮）、激動(dòng)劑組（背部皮下注射25% CCl4加灌胃300 mg/kg 藤茶總黃酮加腹腔注射2 mg/kg anisomycin）。

1.2.2 模型[5]制備及給藥方法 模型組、藤茶總黃酮低劑量組、藤茶總黃酮高劑量組、激動(dòng)劑組大鼠皮下注射25% CCl4（CCl4與花生油1:3 混合）2 mL/kg，每3 d 注射1 次，連續(xù)10 周；對照組背部皮下注射花生油2 mL/kg，每3 天注射1 次，連續(xù)10 周；對照組和模型組第6 周開始生理鹽水灌胃6.3 mL/kg，每天1 次，至第10 周結(jié)束；藤茶總黃酮低劑量組、高劑量組分別于第6 周開始灌胃75、300 mg/kg 藤茶總黃酮，至第10 周結(jié)束；激動(dòng)劑組第6 周開始灌胃300 mg/kg 藤茶總黃酮后，腹腔注射anisomycin 2 mg/kg，至第10周結(jié)束。

1.2.3 標(biāo)本收集 第10 周最后一次給藥2 h 后眼底靜脈叢取血2 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心15 min，分離血清，置于-80 ℃保存，用于檢測各項(xiàng)血清指標(biāo)。各組大鼠頸椎脫臼處死后，分離肝組織，生理鹽水清洗后留取左葉，10%中性甲醛固定48 h，用于HE 染色。另取部分肝臟組織于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測 采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清中ALT、AST 含量，在損傷肝臟中，ALT、AST 水平會(huì)明顯增加，以此作為判斷肝功能損傷的相關(guān)指標(biāo)。

1.2.5 肝組織病理學(xué)染色 各組肝組織10%甲醛固定48 h 后，流水沖洗1 h，乙醇梯度脫水后，石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片，石蠟切片置于烘箱中60 ℃烤片2 h，脫水后蘇木精染色5 min，自來水沖洗15 min，伊紅復(fù)染2 min，無水乙醇脫水，二甲苯透明后重型樹膠封片，經(jīng)顯微鏡觀察各組肝組織纖維化改變。

1.2.6 肝組織中Col Ⅰ、Col Ⅲ檢測 取-80 ℃保存肝組織，按照1:9 質(zhì)量比加入PBS，勻漿取上清液，采用ELISA 法檢測肝臟中Col Ⅰ、Col Ⅲ，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，最后通過酶標(biāo)儀測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Col Ⅰ、Col Ⅲ含量。

1.2.7 肝組織TGF-β1、p38MAPK、α-SMA、MMP-9 mRNA 表達(dá)檢測取-80 ℃保存肝組織，通過Trizol法提取總RNA，測定RNA 含量后，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系：RNA 5 μL，dT18 1 μL，RNAase free 水 7 μL。熒光定量PCR 反應(yīng)按照試劑盒反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 13 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 10 μL。熒光定量反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，重復(fù)35 個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，通過2-△△CT法計(jì)算TGF-β1、p38MAPK、α-SMA、MMP-9 的相對表達(dá)量，上下游引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.8 TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9 蛋白表達(dá)檢測 取約100 mg 肝組織，加入1 mL 裂解液，研磨后勻漿，放入離心管，置于冰上，10 000 r/min 離心20 min，取上清采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白含量。取40 μL 蛋白樣品加入10 μL5×上樣緩沖液，95 ℃水浴5 min，凍存于-20 ℃，用于進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離。分離膠與濃縮膠配置完成后，120 V 60 min 完成電泳，半干轉(zhuǎn)印條件22 V 30 min，取出NC 膜，脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（1:1 000 稀釋）4 ℃搖床過夜孵育，加入二抗（1:2 000 稀釋），常溫?fù)u床孵育1 h，PBST 振蕩沖洗3 次，每次5 min，加入ECL 顯色液，放入化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光，將TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9 與β-actin 灰度值相比得出目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組血清ALT、AST 水平比較 與對照組比較，模型組血清ALT、AST 水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，藤茶總黃酮低劑量組、藤茶總黃酮高劑量組及激動(dòng)劑組血清ALT、AST 水平均降低，其中藤茶總黃酮高劑量組低于藤茶總黃酮低劑量組和激動(dòng)劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組血清ALT、AST 水平比較（，n =13）

表2 各組血清ALT、AST 水平比較（，n =13）

注：與對照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與低劑量組比較，▲P ＜0.05；與高劑量組比較，□P ＜0.05

2.2 各組肝組織病理學(xué)染色觀察 對照組大鼠肝細(xì)胞排列緊密飽滿，肝細(xì)胞大小正常，結(jié)構(gòu)清晰，未見異常。模型組肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙有明顯脂肪變性，肝組織纖維化嚴(yán)重，肝小葉有結(jié)締組織異常增生形成假小葉。藤茶總黃酮低劑量組肝細(xì)胞排列雜亂，肝小葉間有少量變性脂肪填充，匯管區(qū)少量增生組織。藤茶總黃酮高劑量組肝細(xì)胞排列稍亂，肝小葉間未見脂肪填充，肝小葉結(jié)構(gòu)未見浸潤性壞死，肝結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)未出現(xiàn)纖維化。激動(dòng)劑組肝小葉間膠原纖維增生，肝細(xì)胞間有散在的脂肪細(xì)胞浸潤，有膠原沉淀。見圖1。

圖1 肝組織病理學(xué)改變（HE×400）

2.3 各組肝組織中ColIColⅢ水平比較 與對照組比較，模型組Col Ⅰ、Col Ⅲ水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，藤茶總黃酮低劑量組、藤茶總黃酮高劑量組、激動(dòng)劑組Col Ⅰ、Col Ⅲ水平均降低，其中藤茶總黃酮高劑量組Col Ⅰ水平低于藤茶總黃酮低劑量組及激動(dòng)劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組肝組織中Col Ⅰ、Col Ⅲ水平比較（，n =13）

表3 各組肝組織中Col Ⅰ、Col Ⅲ水平比較（，n =13）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與低劑量組比較，▲P ＜0.05；與高劑量組比較，□P ＜0.05

2.4 各組肝組織中TGF-β1、p38MAPK、α-SMA、MMP-9 mRNA 表達(dá)比較 p38MAPK mRNA 相對表達(dá)量組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組TGF-β1、α-SMA、MMP-9 mRNA相對表達(dá)量上升（P＜0.05）；與模型組比較，藤茶總黃酮低劑量組、藤茶總黃酮高劑量組及激動(dòng)劑組TGF-β1、α-SMA mRNA 相對表達(dá)量降低（P＜0.05），MMP-9 mRNA 相對表達(dá)量升高（P＜0.05），其中藤茶總黃酮高劑量組TGF-β1、α-SMA 低于藤茶總黃酮低劑量組及激動(dòng)劑組，MMP-9 高于TF 低劑量組及激動(dòng)劑組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 TGF-β1、p38MAPK、α-SMA、MMP-9 mRNA 相對表達(dá)量比較（，n =13）

表4 TGF-β1、p38MAPK、α-SMA、MMP-9 mRNA 相對表達(dá)量比較（，n =13）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與低劑量組比較，▲P ＜0.05；與高劑量組比較，□P ＜0.05

2.5 各組肝組織中TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9 蛋白表達(dá)比較 p38MAPK 蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組比較，模型組TGF-β1、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，藤茶總黃酮低劑量組、藤茶總黃酮高劑量組及激動(dòng)機(jī)組TGF-β1、α-SMA、p-p38MAPK 蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05），MMP-9 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜ 0.05），其中藤茶總黃酮高劑量組TGF-β1、α-SMA、p-p38MAPK 比藤茶總黃酮低劑量組及激動(dòng)機(jī)組低，MMP-9 比藤茶總黃酮低劑量組及激動(dòng)機(jī)組高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；激動(dòng)劑組與藤茶總黃酮低劑量組比較，TGF-β1、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9 蛋白相對表達(dá)量均無明顯變化（P＞0.05），見圖2 和表5。

表5 TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9 蛋白相對表達(dá)量比較（n =13）

圖2 各組Western blot 蛋白條帶圖

3 討論

肝纖維化是肝星狀細(xì)胞被反復(fù)破壞后持續(xù)修復(fù)的病理過程，是肝硬化形成的關(guān)鍵步驟[6]。TGF-β1/p38MAPK 作為影響肝纖維化的重要通路，與細(xì)胞因子形成、炎性因子調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)激活等過程緊密相關(guān)[7]。藤茶總黃酮作為中華民族的傳統(tǒng)中草藥，已有數(shù)百年歷史，具有抗氧化、調(diào)節(jié)血糖、血壓和體外抗腫瘤活性等作用，中醫(yī)認(rèn)為，肝氣瘀滯是肝纖維化的發(fā)病機(jī)理，益氣養(yǎng)陰，活血化瘀是中藥的基本治法[8-9]。已有藥效研究[10-11]表明藤茶總黃酮可以梳理肝氣，改善肝臟受損組織，抵抗肝臟纖維化，但具體作用機(jī)制目前仍不明確。本研究通過探討TGF-β1/p38MAPK 通路闡述藤茶總黃酮修復(fù)肝纖維化的作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明藤茶總黃酮修復(fù)肝損傷機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)模型組細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積，肝組織結(jié)締嚴(yán)重，肝臟明顯纖維化，提示大鼠肝纖維化模型構(gòu)建成功。有研究報(bào)道[12-13]，CCl4經(jīng)肝臟代謝后生成三氯甲基攻擊細(xì)胞膜，從而破壞細(xì)胞膜完整性，損壞肝臟結(jié)構(gòu)，形成肝纖維化，因此CCl4是構(gòu)建大鼠肝纖維化模型的最佳選擇。病理學(xué)結(jié)果顯示，藤茶總黃酮低劑量組、高劑量組、激動(dòng)劑組肝纖維化程度明顯改善，其中高劑量組肝臟結(jié)構(gòu)較好，提示藤茶總黃酮可改善肝組織病理損傷程度。與對照組比較，模型組血清ALT、AST、ColI、ColⅢ水平均升高，與模型組比較，藤茶總黃酮低劑量組、高劑量組及激動(dòng)劑組血清ALT、AST、ColI、ColⅢ水平均降低，其中藤茶總黃酮高劑量組ALT、AST、ColI 水平低于低劑量組和激動(dòng)劑組，提示藤茶總黃酮可以降低血清ALT、AST、ColI、ColⅢ水平，改善肝臟功能。ALT、AST 主要分布于肝臟細(xì)胞質(zhì)及線粒體中，兩者血清中含量變化可以反映肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性[14]。ColI、ColⅢ主要分布于肝細(xì)胞外基質(zhì)，ColI、ColⅢ水平的變化反映肝纖維化嚴(yán)重程度。

研究[15]顯示TGF-β1 是一種強(qiáng)促膠原蛋白生成因子，可以激活p38MAPK 磷酸化，一方面促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的激活與增殖，抑制MMP-9 合成，減少細(xì)胞基質(zhì)降低；另一方面促進(jìn)α-SMA 高表達(dá)，導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞分化，促進(jìn)膠原蛋白合成，進(jìn)一步加重肝纖維化形成。抑制MMP 細(xì)胞外基質(zhì)降解，加速肝纖維化病程發(fā)展，TGF-β1 在肝組織中的表達(dá)與肝纖維化病理程度息息相關(guān)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組TGF-β1、α-SMA、MMP-9 mRNA、蛋白相對表達(dá)量上升，p-p38MAPK 蛋白相對表達(dá)量上升；與模型組比較，藤茶總黃酮低劑量組、高劑量組及激動(dòng)機(jī)組TGF-β1、α-SMA mRNA、蛋白相對表達(dá)量降低，p-p38MAPK 蛋白相對表達(dá)量降低，MMP-9mRNA 和蛋白相對表達(dá)量均升高，其中藤茶總黃酮高劑量組TGF-β1、α-SMA mRNA、蛋白相對表達(dá)量及p-p38MAPK 蛋白相對表達(dá)量均低于藤茶總黃酮低劑量組及激動(dòng)劑組，MMP-9mRNA 和蛋白相對表達(dá)量均高于藤茶總黃酮低劑量組及激動(dòng)劑組，提示藤茶總黃酮可以抑制TGF-β1/p38MAPK 通路表達(dá)，激活MMP-9 活性，促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)降解，降低α-SMA 表達(dá)，抑制p38MAPK 磷酸化，降低膠原蛋白形成，并且隨著劑量增加，進(jìn)一步下調(diào)TGF-β1/p38MAPK 通路表達(dá)，改善疾病進(jìn)程。

綜上所述，藤茶總黃酮可能通過調(diào)控TGF-β1/p38MAPK 通路，逆轉(zhuǎn)肝纖維化損傷，改善受損肝臟，為肝纖維化的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)，并為藤茶總黃酮在抗肝纖維化的綜合利用及全面開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。