自噬誘導(dǎo)、抑制的人三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中ATG2A和ATG9A表達(dá)觀察

楊鑫嬌，鄒迪，熊喆，張海珠，夏從龍，趙紅業(yè)

1 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理671000；2 云南省動(dòng)物基因編輯與體細(xì)胞克隆技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 云南省異種器官移植工程研究中心

乳腺癌是女性死亡的主要原因之一，2021年乳腺癌新診斷病例數(shù)占女性癌癥新診斷病例數(shù)的30%，由于腫瘤異質(zhì)性、治療耐藥、轉(zhuǎn)移和疾病復(fù)發(fā)，患者的治愈仍然面臨巨大挑戰(zhàn)［1-2］。乳腺癌根據(jù)腫瘤組織病理學(xué)檢查，可分為Luminal A 型、Luminal B型、HER-2 過表達(dá)型和三陰型［3］，其中三陰性乳腺癌占乳腺癌的10%～20%，其侵襲性強(qiáng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差，迄今治療僅限于非轉(zhuǎn)移性疾病的化療，并缺乏有效的治療方案［4］。自噬在乳腺癌活性方面發(fā)揮作用，并由自噬相關(guān)基因（ATG基因）調(diào)控，ATG基因是潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［5］。在營養(yǎng)缺乏時(shí)，自噬使細(xì)胞內(nèi)溶酶體大量降解，消除受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集體并加以回收利用，這對(duì)腫瘤細(xì)胞存活至關(guān)重要［6-7］。ATG2 是一種定位于自噬前體液泡周圍的點(diǎn)狀蛋白，分為A、B 兩型，其中ATG2A 可以促進(jìn)自噬體的延伸和閉合［8-11］。ATG9是自噬體形成核心機(jī)制中惟一的多次跨膜蛋白，在營養(yǎng)缺乏時(shí)，ATG9 以囊泡結(jié)合形式被運(yùn)輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬起始部位，為自噬體形成提供膜源［12-13］。巴弗洛霉素A1（Baf-A1）是一種自噬抑制劑，通過阻止自噬體和溶酶體的融合從而抑制自噬［9］。2019年4月25日—2020年12月13日，本研究觀察了自噬誘導(dǎo)、抑制人三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 中ATG2A、ATG9A 表達(dá)變化，為開發(fā)新的乳腺癌治療策略、相關(guān)靶向藥物和臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 人三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-231 購于上海中科院細(xì)胞庫。DMEM 培養(yǎng)基、Earle's平衡鹽溶液（EBSS）購于美國Gibco公司，Baf-A1 購于上海生工生物工程有限公司，雙抗（青霉素-鏈霉素）購于Biological industries，胎牛血清購于Ex?Cell Bio 公司，抗-自噬相關(guān)蛋白LC3B 兔抗、抗P62/SQSTM1 兔抗和抗β-actin 鼠抗均購于美國Sigma 公司，抗ATG2A 兔抗購于美國CST 公司，抗ATG9A 兔抗購于英國Abcam 公司，TRIzol 購于TransGen Bio?tench 公司，Prime-Script RT 試劑盒、SYBR 酶購于美國Takara公司，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、發(fā)光顯色液、蛋白提取試劑（RiPA Lysis Buffer）、蛋白Marker和Western blotting 一抗稀釋液均購于碧云天生物科技有限公司，血清蛋白購于北京索萊寶有限公司。

1.2 細(xì)胞自噬誘導(dǎo)、抑制處理及分組 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)于10 mL 含10%熱滅活胎牛血清、100 IU/mL 青霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h換液一次，待細(xì)胞長至培養(yǎng)皿80%左右進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞分別接種于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞密度長至70%左右，將細(xì)胞分為4 組，對(duì)照組加入DMEM 培養(yǎng)液正常培養(yǎng)，Baf-A1組在DMEM培養(yǎng)液中加100 nmol/L的Baf-A1進(jìn)行自噬阻斷，EBSS 組加入EBSS 培養(yǎng)液進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)，EBSS + Baf-A1 組在EBSS 培養(yǎng)液中加入100 nmol/L的Baf-A1，四組均處理4 h，備用。

1.3 各組細(xì)胞中ATG2A、ATG9A mRNA 檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量（Q-PCR）法。取各組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，cDNA 使用Prime-Script RT試劑盒合成，獲得的cDNA 作為SYBR Greenbased Q-PCR 的模板，采用定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)各組細(xì)胞中ATG2A、ATG9A mRNA。引物序列由深圳華大基因有限公司合成，以甘油-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，基 因 序 列 見 文 獻(xiàn)［23］。以2-ΔΔCt表 示 細(xì) 胞 中 目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組細(xì)胞中ATG2A、ATG9A、P62、微管蛋白1輕鏈3（LC3）蛋白檢測(cè)及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ測(cè)算采用Western Blotting 法。取各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次，收集細(xì)胞，加入等體積通用蛋白裂解液（內(nèi)含1μmol/L 的蛋白酶抑制劑），4 ℃裂解30 min；4 ℃條件下13 500 r/min離心15 min提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。蛋白變性后，取30μg總蛋白上樣，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量用8%、10%和15%凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，放入5%血清白蛋白（BSA）中，常溫封閉2 h，輕輕搖動(dòng)以阻斷非特異性結(jié)合，加入一抗LC3B（1︰2 000）、P62（1︰2 000）、ATG2A（1︰5 000）、ATG9A（1︰5 000）、βactin（1︰5 000），4 ℃孵育過夜，磷酸緩沖鹽溶液（PBST）洗膜3 次，每次10 min，加入配好的二抗（兔抗或鼠抗），室溫下?lián)u床孵育2 h，PBST 洗滌3 次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光ECL 孵育1 min 后成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，以β-actin 為內(nèi)參，使用Image Lab 軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的蛋白灰度值與β-actin 灰度值的比值，即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中ATG2A、ATG9A mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞中ATG2A、ATG9A mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較見表1。由表1 可知，與對(duì)照組、Baf-A1 組相比，EBSS 組、EBSS + Baf-A1 組細(xì)胞中ATG2A、ATG9A mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P均<0.05），且EBSS+Baf-A1 組細(xì)胞中ATG9A mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于EBSS組（P均<0.05）。

表1 各組細(xì)胞中ATG2A、ATG9A mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 各組細(xì)胞中ATG2A、ATG9A mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與Baf-A1組相比，#P<0.05；與EBSS組相比，&P<0.05。

組別EBSS+Baf-A1組EBSS組Baf-A1組對(duì)照組ATG2A mRNA 2.22±0.29*#2.36±0.11*#0.96±0.02 1.00±0.01 ATG9A mRNA 2.13±0.20*#&1.80±0.13*#1.20±0.12 1.00±0.07

2.2 各組細(xì)胞中ATG2A、ATG9A、P62 蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比較 各組細(xì)胞中ATG2A、ATG9A、P62 蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比較見表2。由表2可知，與對(duì)照組、Baf-A1組相比，EBSS組、EBSS+Baf-A1組細(xì)胞中ATG2A蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P均<0.05）；EBSS 組細(xì)胞中ATG9A 蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于其余三組（P均<0.05）；EBSS 組細(xì)胞中P62 蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于其余三組（P均<0.05），EBSS+Baf-A1組P62蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（P均<0.05）；EBSS 組細(xì)胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ均低于其余三組（P均<0.05），EBSS + Baf-A1 組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ均高于其余三組（P均<0.05）。

表2 各組細(xì)胞中ATG2A、ATG9A、P62蛋白相對(duì)表達(dá)量、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表達(dá)比值比較（±s）

表2 各組細(xì)胞中ATG2A、ATG9A、P62蛋白相對(duì)表達(dá)量、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表達(dá)比值比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與Baf-A1組相比，#P<0.05；與EBSS組相比，&P<0.05。

組別EBSS+Baf-A1組EBSS組Baf-A1組對(duì)照組ATG2A 1.59±0.19*#1.60±0.02*#0.91±0.26 1.00±0.00 ATG9A 1.43±0.10&2.40±0.69*#1.24±0.17 1.00±0.00 P62 0.87±0.04*&0.63±0.09*#0.90±0.07 1.00±0.00 LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ2.29±0.19*#&0.67±0.14*#1.19±0.01 1.00±0.00

3 討論

研究［14-15］顯示，LC3的蛋白水解切割是自噬體形成的必要步驟，LC3 有三種亞蛋白LC3A、LC3B 和LC3C，其中LC3B 參與自噬體成熟和自噬體與溶酶體的融合過程，作為自噬的分子標(biāo)志。LC3 蛋白在細(xì)胞內(nèi)有兩種存在形式，分別為胞漿可溶性的LC3-Ⅰ和脂質(zhì)化形式LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是惟一一種在吞噬體到溶酶體降解的整個(gè)過程中特異性定位于自噬結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的大小可評(píng)估自噬水平的高低［16-17］。在自噬過程中，LC3B-Ⅱ在溶酶體中降解是監(jiān)測(cè)自噬過程的標(biāo)記物，其中結(jié)合的LC3B-Ⅱ的增加可能是結(jié)合在自噬體上的LC3B-Ⅱ增加或溶酶體降解LC3B-Ⅱ減少，所以需要用Baf-A1 來監(jiān)測(cè)LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ的水平變化，輸送至溶酶體LC3B-Ⅱ的量反映了正在進(jìn)行的自噬流的量［18］。P62 是自噬流的重要指標(biāo)，通過直接結(jié)合自噬膜上的LC3B 并被自噬選擇性降解［19］。本研究結(jié)果顯示，饑餓可誘導(dǎo)自噬，饑餓時(shí)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和P62 蛋白表達(dá)水平下降，LC3B-Ⅱ和P62 蛋白通過溶酶體途徑降解，Baf-A1 對(duì)自噬體和溶酶體結(jié)合的抑制導(dǎo)致LC3B-Ⅱ積累和P62 蛋白表達(dá)水平恢復(fù)至對(duì)照組水平，這種積累代表著在饑餓期間通過自噬降解的LC3B-Ⅱ和P62 的量。本研究結(jié)果與以下研究發(fā)現(xiàn)相符：短時(shí)間饑餓后，LC3-Ⅰ的量減少，LC3-Ⅱ的量增加，當(dāng)細(xì)胞遭受更長時(shí)間的饑餓，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ都會(huì)消失［20］；饑餓期間P62表達(dá)顯著減少，加入自噬抑制劑Baf-A1 后P62 積累［21，16］。同時(shí)LC3B-Ⅱ的增加與P62 的降低并不具有一致性，要想正確評(píng)價(jià)自噬流受阻或自噬系統(tǒng)受損應(yīng)當(dāng)檢測(cè)LC3B 的轉(zhuǎn)化，也要檢測(cè)可溶性和不可溶性P62 的變化［22］。由此表明，EBSS 可成功誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞發(fā)生自噬。

ATG2A 定位于吞噬泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的交界處，參與自噬膜形成，促進(jìn)自噬體的延伸與閉合［9，23］。本研究結(jié)果中，在MDA-MB-231 細(xì)胞中ATG2A 促進(jìn)自噬，這與YUSUKE 等［11，24］的研究結(jié)果一致，在HeLa 細(xì)胞中，ATG2A 是惟一上調(diào)的ATG 基因，且ATG2A 的缺乏將HeLa 細(xì)胞和白血病細(xì)胞從細(xì)胞保護(hù)性自噬轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲觥Ｔ诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中，ATG2A 的缺失會(huì)導(dǎo)致自噬流量的阻斷并積累未成熟自噬體膜，這些膜通過細(xì)胞內(nèi)死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物促進(jìn)Caspase-8 激活以響應(yīng)營養(yǎng)缺乏，通過抑制自噬體的形成來選擇性地阻斷自噬通量，將細(xì)胞保護(hù)性自噬轉(zhuǎn)化為細(xì)胞凋亡［11］。研究［25］表明，高水平的ATG2A 與肝癌患者的生存期差有關(guān)，而ATG2A 沉默顯著抑制肝癌細(xì)胞的惡性程度，ATG2A 作為肝癌的一個(gè)潛在的新型治療靶點(diǎn)。自噬通過提供腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞增殖和代謝所需能量來促進(jìn)腫瘤生長，高自噬通量與患者預(yù)后差、轉(zhuǎn)移增強(qiáng)和化療耐藥有關(guān)。因此，通過靶向ATG2A 對(duì)自噬體膜形成的作用，抑制自噬體膜閉合可能是一種新的癌癥治療靶點(diǎn)。

ATG9 是ATG 核心蛋白中惟一的跨膜蛋白，對(duì)自噬體膜的形成和延伸具有重要作用［26］。ATG9 分為A、B兩型，其中ATG9A 一般存在于高爾基體膜和內(nèi)體中，在饑餓期間，被運(yùn)輸?shù)阶允审w形成位點(diǎn)［27］。本研究發(fā)現(xiàn)在饑餓誘導(dǎo)的MDA-MB-231 細(xì)胞自噬中，ATG9A mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上升。分析其原因，有以下兩個(gè)方面：第一是PI3P 促進(jìn)ATG9A 運(yùn)載并定位膜到自噬小體［28］，本實(shí)驗(yàn)中饑餓誘導(dǎo)后自噬水平升高，因此ATG9A 表達(dá)上升；第二是饑餓或雷帕霉素處理期間ATG9 囊泡合成增加可能有助于自噬活性的上調(diào)［29］，與本研究結(jié)果一致。因此，ATG9A 在自噬小體形成階段起著重要的作用，因此在本研究中ATG9A 可作為自噬檢測(cè)的重要影響因子，同時(shí)也作為三陰性乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，EBSS 成功誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞發(fā)生自噬，饑餓誘導(dǎo)的MDA-MB-231 細(xì)胞自噬過程中ATG2A、ATG9A 基因表達(dá)升高，可作為三陰性乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。本研究對(duì)ATG2A 和ATG9A 在EBSS 處理MDA-MB-231 細(xì)胞自噬過程中的作用進(jìn)行了初步的探討，但是兩個(gè)基因在該細(xì)胞中自噬的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。我們將進(jìn)一步探索其蛋白后修飾對(duì)自噬的調(diào)控作用，以及借用siRNA 干擾技術(shù)分別敲降以上兩個(gè)基因的表達(dá)水平，探索其在不同乳腺癌細(xì)胞的具體分子機(jī)制，進(jìn)一步找出三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的分子靶點(diǎn)。自噬可以支持細(xì)胞在各種應(yīng)激如饑餓或缺氧的反應(yīng)中存活，同時(shí)自噬也有作為抗癌靶點(diǎn)的潛力。靶向自噬相關(guān)蛋白和自噬可以為靶向易受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響的腫瘤細(xì)胞提供一種新的協(xié)同機(jī)制［30］。