小兒宣肺止咳顆粒對(duì)大鼠的長(zhǎng)期毒性反應(yīng)*

郟自明，任平遠(yuǎn)，葛朝，鄭艷華，樊軍，黎炎梅

[1.湖北省疾病預(yù)防控制中心、應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430075；2.健民集團(tuán)葉開(kāi)泰國(guó)藥(隨州)有限公司，隨州 441300]

小兒宣肺止咳顆粒由麻黃、防風(fēng)、西南黃芩、桔梗、芥子、苦杏仁、葶藶子、馬蘭、黃芪、山藥、山楂、甘草等12味中藥組成，臨床功效為宣肺解表、清熱化痰，主要用于治療小兒外感咳嗽、痰熱壅肺所致的咳嗽痰多、痰黃 黏稠、咳嗽不爽等癥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明麻黃、防風(fēng)、西南黃芩、桔梗有解熱鎮(zhèn)痛的作用；麻黃、甘草、防風(fēng)、西南黃芩、桔梗、馬蘭能有效抗菌、抗病毒；苦杏仁、山楂有明顯的抑菌作用；麻黃、苦杏仁、甘草、桔梗、白芥子、葶藶子、山楂有鎮(zhèn)咳祛痰的功效；甘草、防風(fēng)、黃芪、西南黃芩、山楂能調(diào)節(jié)免疫功能[2]，在體外培養(yǎng)細(xì)胞及小鼠體內(nèi)對(duì)流感病毒株和柯薩奇B6病毒株均有抗病毒作用[3]。根據(jù)臨床觀察結(jié)果該藥具有宣肺止咳、清熱化痰的功效，可以用于治療小兒支氣管肺炎，可為臨床用藥提供新的選擇[4]。本產(chǎn)品已在臨床應(yīng)用，批準(zhǔn)文號(hào)為(97)衛(wèi)藥準(zhǔn)字Z-029號(hào)，按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局對(duì)該產(chǎn)品中藥保護(hù)品種審批意見(jiàn)需完善藥理、毒理等基礎(chǔ)研究，因臨床用藥周期以3 d為1個(gè)療程，所以本實(shí)驗(yàn)按照《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》(國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局2017年9月1日頒布)和《藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》(國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局2014年5月頒布)設(shè)計(jì)大鼠重復(fù)經(jīng)口給予小兒宣肺止咳顆粒1個(gè)月毒性實(shí)驗(yàn)，觀察大鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng)，并通過(guò)4周的恢復(fù)期觀察，評(píng)估其所產(chǎn)生不良反應(yīng)的性質(zhì)和程度，尋找毒性靶器官和長(zhǎng)期用藥后可能出現(xiàn)的延遲性毒副反應(yīng)，以期確定無(wú)毒性反應(yīng)劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。

1 材料與方法

1.1藥物、溶媒與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小兒宣肺止咳顆粒由健民集團(tuán)葉開(kāi)泰國(guó)藥(隨州)有限公司提供，批號(hào)：160354，溶媒為純化水。選取5～6周齡SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各60只，雌性體質(zhì)量80.8 ～110.5 g，雄性體質(zhì)量87.1～112.0 g，大鼠體質(zhì)量均未超出平均體質(zhì)量的20%，購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：42000600017879，實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2012-0065。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證明號(hào)：00185628。

1.2主要儀器 SYSMEX2000全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀、CA-510全自動(dòng)血凝分析儀(均為日本SYSMEX公司)；AU680型全自動(dòng)生化分析儀(貝克曼庫(kù)爾特有限公司)；迪瑞H-800全自動(dòng)尿液分析儀(長(zhǎng)春迪瑞醫(yī)療科技有限公司)；Practum612-1CN動(dòng)物天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，感量：10 mg]；PL1501-S組織天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，感量：0.01 mg]；Excelsior ES全自動(dòng)脫水儀、HistoStar全自動(dòng)包埋儀、HM340E輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、Varistain Gemini全自動(dòng)染色機(jī)、ClearVue全自動(dòng)蓋片機(jī)(均為美國(guó)Thermo公司)；DM2500光學(xué)顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 小兒宣肺止咳顆粒兒童每天最大臨床用量為36.0 g，1 kg小兒宣肺止咳顆粒浸膏相當(dāng)于2.595 kg成品顆粒，換算成浸膏每日用量為13.87 g。根據(jù)由體表面積公式lgS=0.876 2+0.698 lgW計(jì)算大鼠等效劑量(浸膏)為1.47 g·kg-1。根據(jù)廠家提供的資料及本中心前期做的大鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該供試品毒性較低，按照《藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》要求大劑量應(yīng)出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)或達(dá)到最大給藥量，本實(shí)驗(yàn)大劑量采用最大給藥量法，小劑量采用高于大鼠等效劑量的原則進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)。小兒宣肺止咳顆粒浸膏的最大密度為1.35 g·mL-1，大鼠按15 mL·kg-1灌胃計(jì)算得大劑量為20.25 g·kg-1·d-1(相當(dāng)于臨床劑量的72倍)，小劑量大于大鼠等效劑量為3.00 g ·kg-1·d-1(相當(dāng)于臨床劑量的11倍)，再設(shè)一中劑量為7.80 g ·kg-1·d-1(相當(dāng)于臨床劑量的28倍)。

大鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分組設(shè)計(jì)[5]分為4組，即正常對(duì)照組和小兒宣肺止咳顆粒小、中、大劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)小、中、大劑量組)。每組大鼠30只，雌雄各15只。每天按15 mL·kg-1灌胃給藥1次，連續(xù)給藥1個(gè)月，正常對(duì)照組給予等體積的純化水，每周按體質(zhì)量調(diào)整一次給藥量。給藥1個(gè)月后各組取20只大鼠(雌雄各半)進(jìn)行末期檢查，停藥后各組余10只大鼠(雌雄各半)進(jìn)行4周的恢復(fù)期觀察。每日觀察1次大鼠的一般癥狀，包括外觀體征、毛色、行為活動(dòng)、尿液、糞便性狀；每周檢測(cè)1次大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量；血液學(xué)、血液生化學(xué)、尿液學(xué)、臟器系數(shù)和病理組織學(xué)檢查分別在給藥末期和恢復(fù)期觀察結(jié)束后進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1對(duì)大鼠一般狀況的影響 本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)生非計(jì)劃大鼠死亡，給藥期和恢復(fù)期各組大鼠的外觀體征、行為活動(dòng)、毛色、呼吸及對(duì)外界反應(yīng)均未見(jiàn)明顯異常。

2.2對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響 雌鼠：大劑量組大鼠體質(zhì)量在給藥第8天低于對(duì)照組(P<0.01)，給藥第15，22，29天和恢復(fù)期與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；小、中劑量組在給藥期和恢復(fù)期大鼠體質(zhì)量與正常對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4組雌性大鼠在不同時(shí)間的體質(zhì)量變化

雄鼠：大劑量組大鼠體質(zhì)量在給藥第8，15，22，29天均低于正常對(duì)照組(P<0.01)，恢復(fù)期第36天大鼠體質(zhì)量低于正常對(duì)照組(P<0.05)，恢復(fù)期第43，50，57天大鼠體質(zhì)量與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中劑量組大鼠體質(zhì)量在給藥第8，15天均低于正常對(duì)照組(P<0.01)，給藥第22，29天和恢復(fù)期與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；小劑量組大鼠體質(zhì)量在給藥第8，15，22天均低于正常對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)，給藥第29天和恢復(fù)期正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 4組雄性大鼠在不同時(shí)間的體質(zhì)量變化

2.3對(duì)大鼠攝食量的影響 雌鼠：大劑量組攝食量給藥第1天低于正常對(duì)照組(P<0.01)，給藥第29攝食量低于正常對(duì)照組(P<0.05)，給藥第8，15，22天和恢復(fù)期攝食量與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；小劑量組在給藥期和恢復(fù)期攝食量與正常對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 4組雌性大鼠在不同時(shí)間的攝食量變化

雄鼠：大劑量組攝食量在給藥第1，8，22，29天均低于正常對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)，給藥第15天和恢復(fù)期攝食量與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中劑量組在給藥期和恢復(fù)期攝食量與正常對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；小劑量組攝食量在給藥第8天低于正常對(duì)照組(P<0.05)，給藥第1，15，22，29天和恢復(fù)期攝食量與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4。

表4 4組雄性大鼠在不同時(shí)間的攝食量變化

2.4對(duì)眼科檢查的影響 4組大鼠眼科檢查雙眼瞳孔反射均正常、眼底檢查均無(wú)可見(jiàn)損傷。

2.5對(duì)血液學(xué)指標(biāo)的影響 給藥末期雌鼠中、大劑量組白細(xì)胞(WBC)均高于正常對(duì)照組，嗜酸性粒細(xì)胞比率(EOS%)低于正常對(duì)照組(P<0.01)，紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)高于正常對(duì)照組(P<0.05)；中劑量組大鼠淋巴細(xì)胞百分率(LYMP%)高于正常對(duì)照組(P<0.05)；小、中、大劑量組大鼠EOS%低于正常對(duì)照組(P<0.01)；恢復(fù)期中、大劑量組大鼠凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)低于正常對(duì)照組(P<0.05)；其他指標(biāo)與正常對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥末期雄鼠大劑量組EOS%低于正常對(duì)照組(P<0.05)；恢復(fù)期中劑量組大鼠WBC、MCHC、血紅蛋白(Hb)低于正常對(duì)照組(P<0.05)。其他指標(biāo)[紅細(xì)胞(RBC)、紅細(xì)胞比容(HCT)、血小板(PLT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)、中性粒細(xì)胞(NEUT)、單核細(xì)胞(MONO)、嗜堿性粒細(xì)胞(BASO)、網(wǎng)織紅細(xì)胞(RET)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)]與正常對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表5，6。

表5 4組雌性大鼠血液學(xué)指標(biāo)的變化

表6 4組雄性大鼠血液學(xué)指標(biāo)的變化

2.6對(duì)血液生化學(xué)指標(biāo)的影響 給藥末期雌鼠大劑量組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(T-BiL)、尿素氮(BUN)均高于正常對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，血糖(GLU)、鈉離子(Na+)、氯離子(Cl-)均低于正常對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)；中劑量組白蛋白(ALB)高于正常對(duì)照組(P<0.05)。其他指標(biāo)與正常對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥末期雄鼠大劑量組ALT、BUN、T-BiL、堿性磷酸酶(ALP)高于正常對(duì)照組(P<0.01)，GLU、Na+、Cl-低于正常對(duì)照組(P<0.01)；中劑量組大鼠ALP、BUN高于正常對(duì)照組(P<0.01)，Cl-低于正常對(duì)照組(P<0.05)。其他指標(biāo)[天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(CREA)、總膽固酮(CHOL)、三酰甘油(TG)、肌酸激酶(CK)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)、鉀離子(K+)]與正常對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表7，8。

表7 4組雌性大鼠血液生化指標(biāo)的變化

表8 4組雄性大鼠血液生化指標(biāo)的變化

2.7對(duì)臟器系數(shù)的影響 給藥末期和恢復(fù)期小、中、大劑量組大鼠臟器系數(shù)與正常對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表9，10。

表9 4組雌性大鼠臟器系數(shù)的變化

表10 4組雄性大鼠臟器系數(shù)的變化

2.8對(duì)臟器病理組織學(xué)的影響 給藥末期大劑量組6只大鼠肝臟內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；大劑量組2只大鼠肝臟內(nèi)少量肝細(xì)胞灶性壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。中、小劑量組及恢復(fù)期正常對(duì)照組各僅1只大鼠肝臟內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，應(yīng)屬于大鼠自發(fā)病理改變，但大劑量組肝臟的病理改變發(fā)生數(shù)較正常對(duì)照組有所增加，表明該病理改變可能與供試品有關(guān)。停藥4周，該病理改變消失。見(jiàn)圖1。

圖1 4組大鼠的肝臟病理組織學(xué)變化(HE，×200)

2.9尿液分析 給藥末期大劑量組大鼠潛血、尿蛋白陽(yáng)性率均低于正常對(duì)照組(P<0.01)；中劑量組潛血陽(yáng)性率低于正常對(duì)照組(P<0.01)；小、中、大劑量組pH值均低于正常對(duì)照組(P<0.01)；小、中、大劑量組大鼠尿膽原、尿膽紅素、酮體、白細(xì)胞、尿糖、密度等指標(biāo)與正常對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表11。

表11 4組大鼠尿液學(xué)指標(biāo)的變化

3 討論

小兒宣肺止咳顆粒由12味中藥組成，按照工藝提取濃縮至浸膏后加入適量的蔗糖粉和糊精混勻制成顆粒。糊精和蔗糖粉均收錄在藥用輔料手冊(cè)(原著第4版)[6]，糊精在顆粒制劑中起到黏合劑的作用，蔗糖粉可以增加甜味和黏度，作為輔料應(yīng)用的劑量下用于口服制劑處方中，基本無(wú)毒、無(wú)刺激性。小兒宣肺止咳顆粒中浸膏的含量占38.5%，而輔料占61.5%，為了充分觀察受試物在大鼠體內(nèi)最大暴露量的毒性反應(yīng)情況，所以本實(shí)驗(yàn)采用去除糊精和蔗糖粉等輔料的浸膏作為受試物。

大鼠連續(xù)灌胃給予小兒宣肺止咳顆粒1個(gè)月，大劑量組雄性大鼠體質(zhì)量在給藥期至恢復(fù)期1周均低于正常對(duì)照組，大劑量組大鼠至恢復(fù)期結(jié)束體質(zhì)量逐步恢復(fù)正常；中劑量給藥后2周和小劑量給藥后3周大鼠體質(zhì)量低于正常對(duì)照組，之后中、小劑量大鼠體質(zhì)量逐步恢復(fù)正常；雌性大鼠僅大劑量組給藥后1周體質(zhì)量低于正常對(duì)照組；由此表明本品對(duì)大鼠體質(zhì)量有一定的抑制作用，尤以大劑量對(duì)體質(zhì)量的影響較大，并且對(duì)雄性大鼠的影響較雌性大鼠明顯，恢復(fù)4周后大鼠體質(zhì)量可以恢復(fù)。大劑量組雄性大鼠攝食量在給藥期低于正常對(duì)照組，恢復(fù)期恢復(fù)正常；小劑量組大鼠僅在給藥后第2周攝食量低于正常對(duì)照組，雌性大鼠中、大劑量組僅給藥后第1周和第29天大鼠攝食量低于正常對(duì)照組，未呈現(xiàn)規(guī)律性的劑量關(guān)系；由此表明本品大劑量對(duì)雄性大鼠攝食量有一定的抑制作用，停藥后恢復(fù)。通過(guò)對(duì)本品大劑量對(duì)雄性大鼠體質(zhì)量和攝食量的抑制作用分析，其原因可能與雄性大鼠因供試品灌胃濃度和體積較大有關(guān)。

大鼠血清生化指標(biāo)的結(jié)果顯示，大劑量組大鼠的ALT、T-BiL、ALP高于正常對(duì)照組，GLU低于正常對(duì)照組，以上血清生化指標(biāo)均為反映肝功能的指標(biāo)，同時(shí)病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)大劑量會(huì)引起部分大鼠肝臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和個(gè)別大鼠少量肝細(xì)胞壞死，恢復(fù)期結(jié)束時(shí)以上指標(biāo)均恢復(fù)正常；中劑量組僅雄性大鼠ALP、雌性大鼠ALB高于正常對(duì)照組，但其他反映肝功能的指標(biāo)未見(jiàn)異常，病理組織學(xué)觀察未發(fā)現(xiàn)中劑量組大鼠肝臟出現(xiàn)病理改變，并且這些數(shù)據(jù)處于文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[7-9]正常參考值的范圍內(nèi)，所以該兩項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上雖有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但無(wú)生物學(xué)意義；本研究表明小兒宣肺止咳顆粒大劑量可引起肝臟輕度損傷，停藥4周后可恢復(fù)正常。中、大劑量組大鼠的BUN高于正常對(duì)照組，Na+、Cl-低于正常對(duì)照組，但這些數(shù)據(jù)處于本中心大鼠歷史背景數(shù)據(jù)正常血液學(xué)參考值和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[7-9]正常血液學(xué)參考值的范圍內(nèi)，結(jié)合病理組織學(xué)觀察未發(fā)現(xiàn)大鼠腎臟出現(xiàn)病理改變，在本實(shí)驗(yàn)中可判定以上數(shù)據(jù)雖有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，應(yīng)無(wú)生物學(xué)意義。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知大鼠血清γ-GT測(cè)定值水平較低，陳威等[10]報(bào)道γ-GT是一種胚胎蛋白，在成年大鼠活性很低，只有在化學(xué)致癌劑誘發(fā)肝癌的早期階段其活性才會(huì)異常升高，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)中大鼠血清的γ-GT活性水平很低，和文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

給藥末期中、大劑量組大鼠WBC高于正常對(duì)照組，EOS(%)低于正常對(duì)照組；恢復(fù)期中劑量組大鼠WBC低于正常對(duì)照組，中、大劑量組大鼠PT低于正常對(duì)照組，以上數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，也無(wú)一定劑量反應(yīng)關(guān)系，并且這些數(shù)據(jù)均處于文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[6-8]正常參考值的范圍內(nèi)，提示在本實(shí)驗(yàn)中可判定以上數(shù)據(jù)雖有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但無(wú)生物學(xué)意義。

給藥末期潛血、尿蛋白陽(yáng)性率與正常對(duì)照組比較有顯著差異，由于該兩項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性率低于低于正常對(duì)照組，雖然有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但無(wú)生物學(xué)意義。給藥末期小、中、大劑量組大鼠尿液pH值低于正常對(duì)照組，停藥4周后恢復(fù)正常，文獻(xiàn)資料[11]顯示大鼠尿液pH正常值參考范圍7.38～8.50，楊趁霞[12]報(bào)道影響尿液pH值的因素多是食物酸堿性和所服藥物酸堿性所造成，委托方提供的小兒宣肺止咳顆粒檢測(cè)報(bào)告顯示樣品pH值為4.44，由此分析小、中、大劑量組大鼠尿液pH值下降的原因可能為供試品呈酸性所致，結(jié)合尿液其他指標(biāo)可判定無(wú)生物學(xué)意義。

綜上所述，大鼠連續(xù)灌胃給予小兒宣肺止咳顆粒1個(gè)月， 7.80 g·kg-1·d-1為安全劑量，根據(jù)體表面積等效劑量換算為臨床劑量的28倍；對(duì)大鼠體質(zhì)量有一定的抑制作用，尤以大劑量對(duì)體質(zhì)量的影響較大，并且對(duì)雄性大鼠的影響較雌性大鼠明顯；大劑量對(duì)雄性大鼠攝食量有一定的抑制作用，大劑量可引起肝臟輕度損傷，停藥4周后藥物的毒性反應(yīng)可逆，亦未見(jiàn)藥物引起的其他延遲性毒性反應(yīng)。