梓醇對(duì)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病變的影響及作用機(jī)制

吳 震 杜 秋

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南京 210022

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥[1]。中醫(yī)學(xué)中DR 屬于“消渴目病”范疇，是氣陰兩虛之癥，陰虛日久則瘀血阻絡(luò)致目視物縹緲，治則以益氣養(yǎng)陰為法[2-3]。中藥地黃味甘性寒，清熱滋陰。梓醇是從地黃塊根中提取的一種環(huán)烯醚萜苷類化合物[4]，具有降血糖、抗炎、抗腫瘤和抗氧化應(yīng)激等功效[5-7]。本研究旨在探討梓醇對(duì)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病變的作用，并進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性8 周齡KK-Ay和C57BL/6J 小鼠購(gòu)于北京華阜康公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（55±5）%、12 h 日夜交替照明的SPF 級(jí)環(huán)境中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

梓醇（貨號(hào)：Z-005-190523，成都瑞芬思）；氨基胍（貨號(hào)：079K1734V，美國(guó)Sigma）；白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycolylation end product，AGE）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（批號(hào)：202004，上海酶聯(lián)）；血管內(nèi)皮鈣黏著蛋白（VE-cadherin）和AGE 受體（advanced glycolylation end product receptor，RAGE）抗體（貨號(hào)：ab33168、ab3611，英國(guó)Abcam）；磷酸化核因子-κB p65（phosphorylated nuclear factor-κB p65，P-NF-κB p65）抗體（貨號(hào)：#8242s、#3039s，美國(guó)CST）；血糖儀（Contour TS，德國(guó)拜耳）；酶標(biāo)儀（Synergy HT，美國(guó)Bio Tek）。

1.3 研究方法

1.3.1 分組及給藥 高脂高糖飼料喂養(yǎng)KK-Ay 小鼠4 周后，將其按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、氨基胍組和梓醇低、高劑量組，另取基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠為空白組，每組各7 只。氨基胍組灌胃氨基胍100 mg/（kg·d），梓醇低、高劑量組分別灌胃梓醇50、100 mg/（kg·d），空白組和模型組灌胃生理鹽水100 mg/（kg·d）。分別于干預(yù)前、干預(yù)4 周后、干預(yù)8 周后檢測(cè)五組血糖水平。干預(yù)8 周后，摘眼球取血，并分離出視網(wǎng)膜組織，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3.2 血清IL-1β、TNF-α、VEGF、AGE 水平檢測(cè) 按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說明書步驟操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

1.3.3 視網(wǎng)膜HE 染色 多聚甲醛固定視網(wǎng)膜，乙醇分級(jí)脫水，石蠟包埋后切片。經(jīng)HE 染色，于顯微鏡下隨機(jī)視野拍照。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC）采用Image J 軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4 視網(wǎng)膜VE-cadherin、RAGE、P-NF-κB p65蛋白檢測(cè) 視網(wǎng)膜組織總蛋白于凝膠中電泳分離后，轉(zhuǎn)至印跡膜上，封閉后加入一抗（1∶1000 稀釋）4℃過夜。次日洗膜后，加入二抗（1∶5000 稀釋）孵育后顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各時(shí)間點(diǎn)血糖水平比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組干預(yù)前、干預(yù)4 周后、干預(yù)8 周后血糖水平比較

整體分析發(fā)現(xiàn)：五組干預(yù)前、干預(yù)4 周后、干預(yù)8 周后血糖水平組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：模型組干預(yù)8 周后血糖水平高于干預(yù)前，梓醇低劑量組干預(yù)8 周后血糖水平均低于干預(yù)前，梓醇高劑量組干預(yù)4 周后及干預(yù)8 周后血糖水平均低于干預(yù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。組間比較：模型組干預(yù)前、干預(yù)4 周后、干預(yù)8 周后血糖水平均高于同一時(shí)間點(diǎn)的空白組，梓醇低劑量組干預(yù)8 周后血糖水平低于同一時(shí)間點(diǎn)的模型組，梓醇高劑量組干預(yù)4 周后、干預(yù)8 周后血糖水平均低于同一時(shí)間點(diǎn)的模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 五組干預(yù)前、干預(yù)4 周后、干預(yù)8 周后血糖水平比較（±s）

表1 五組干預(yù)前、干預(yù)4 周后、干預(yù)8 周后血糖水平比較（±s）

注：與本組干預(yù)前比較，aP ＜0.05；與本組干預(yù)4 周后比較，bP ＜0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)空白組比較，cP ＜0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)模型組比較，dP ＜0.05

2.2 五組視網(wǎng)膜病理改變及RGC 數(shù)量比較

空白組視網(wǎng)膜表面光滑平整，結(jié)構(gòu)清晰完整；模型組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)疏松、厚度變薄，視網(wǎng)膜細(xì)胞排列無序；梓醇低劑量組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)疏松、厚度較??；梓醇高劑量組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞排列及視網(wǎng)膜厚度較模型組有所改善，見圖1。干預(yù)8 周后，模型組RGC 數(shù)量少于空白組；梓醇高劑量組RGC 數(shù)量多于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖2。

圖1 五組視網(wǎng)膜病理改變（HE 染色，400×）

圖2 五組視覺膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較（n=7）

2.3 五組血清IL-1β、TNF-α、VEGF、AGE 比較

干預(yù)8 周后，模型組IL-1β、TNF-α、VEGF、AGE 水平均高于空白組，梓醇低、高劑量組IL-1β、TNF-α、VEGF、AGE 水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖3。

圖3 五組血清IL-1β、TNF-ɑ、VEGF、AGE 比較（n=7）

2.4 五組視網(wǎng)膜VE-cadherin、RAGE、P-NF-κB p65蛋白表達(dá)比較

干預(yù)8 周后，模型組VE-cadherin表達(dá)低于空白組，RAGE、P-NF-κB p65 蛋白表達(dá)高于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。干預(yù)8 周后，梓醇低、高劑量組VE-cadherin表達(dá)高于模型組，RAGE、PNF-κB p65 蛋白表達(dá)低于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）。見圖4。

圖4 五組視網(wǎng)膜VE-cadherin、RAGE、P-NF-κB p65 蛋白表達(dá)比較（n=7）

3 討論

DR 是導(dǎo)致糖尿病患者失明的最常見原因。目前，DR 主要通過玻璃體切割術(shù)、激光來治療，但手術(shù)和激光可能會(huì)導(dǎo)致周邊視力喪失或惡化，甚至產(chǎn)生糖尿病性黃斑水腫[8-11]。因此，亟需尋找有效的藥物來治療DR。自發(fā)性糖尿病KK-Ay 小鼠用于DR 研究已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道[12-15]，其具有個(gè)體差異性小、更接近人類發(fā)病的特點(diǎn)。

研究顯示[16]，地黃可有效防治DR，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究其特征性活性成分梓醇對(duì)DR的影響。視網(wǎng)膜缺血缺氧、血管通透性增加和新生血管形成是DR的主要特征[17-18]。血-視網(wǎng)膜屏障通透性的增加通常歸因于慢性高血糖的刺激，以及AGE、氧自由基和生長(zhǎng)因子的積累[19]。長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下，AGE 在體內(nèi)大量蓄積，與RAGE 結(jié)合后激活NF-κB[20-22]。NF-κB是損傷相關(guān)的一種多效調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)下游多種炎癥因子的表達(dá)，其中IL-1β 激活小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)DR的神經(jīng)炎性反應(yīng)[23]。TNF-α 會(huì)刺激視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管狹窄、閉塞及新生血管的形成[24-26]。

此外，NF-κB 可引起視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡，刺激VEGF生成，其通過減少黏著蛋白的分布來改變視網(wǎng)膜血管的通透性[27-29]。本研究顯示，梓醇低、高劑量組血糖、IL-1β、TNF-α和VEGF 水平均低于模型組，并上調(diào)視網(wǎng)膜VEcadherin 蛋白表達(dá)高于模型組，視網(wǎng)膜組織的病理學(xué)損傷也有一定改善，提示梓醇是治療DR的潛在分子。進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示，梓醇低、高劑量組血清AGE 低于模型組，RAGE、P-NF-κB p65 蛋白表達(dá)低于模型組，提示梓醇可能是通過抑制AGE/RAGE/NF-κB 信號(hào)通路來調(diào)控炎癥因子水平，恢復(fù)視網(wǎng)膜黏著蛋白，從而改善視網(wǎng)膜血管通透性，發(fā)揮防治DR的作用。但本研究?jī)H探討了梓醇對(duì)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病變的作用，后續(xù)需通過體外視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)一步研究梓醇的作用及機(jī)制，為探索抗DR的新藥提供更充分的理論依據(jù)。