基于非標(biāo)記核酸適配體熒光法檢測灌溉水中汞離子的研究

王 楠，陳佳祎，陸安祥，欒云霞，盧靜華

（1.錦州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 錦州121001；2.北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（北京），農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097）

隨著新型現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，農(nóng)田生態(tài)環(huán)境和保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)升級中的地位愈加重要，也對有毒危害因子的檢測提出了更高的要求。高靈敏度、高通量且操作簡單、成本低廉的快速檢測方法更符合基層快速篩查的需求。重金屬對農(nóng)田環(huán)境的污染可通過農(nóng)產(chǎn)品對人類健康造成嚴(yán)重危害，尤以汞、鎘、鉛、鉻等毒性為最大［1］。這些重金屬及其化合物多數(shù)有致畸、致癌作用，并且均為蓄積性毒物，具有生物不可降解性，歸宿于水體、底泥、生物群或大氣。在有毒金屬元素中，汞的毒性排在首位，即使在濃度很低的情況下，也會(huì)對人類和動(dòng)植物產(chǎn)生相當(dāng)大的毒害作用。對農(nóng)田土壤、空氣、水體等環(huán)境介質(zhì)以及農(nóng)產(chǎn)品中的汞進(jìn)行日常監(jiān)測已成為各國的常規(guī)項(xiàng)目，因此，研究快速、低成本、靈敏度高且特異性好的汞離子檢測方法顯得極為重要［2－3］。汞的檢測常采用原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、色譜法等，但傳統(tǒng)方法所需儀器價(jià)格昂貴，對操作人員、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、前處理均有較高的要求，不適合在基層現(xiàn)場實(shí)時(shí)在線檢測?；诿庖邔W(xué)原理的快速檢測方法是目前現(xiàn)場檢測的主流，但因抗體制備過程及其自身的特點(diǎn)，該法對于毒性強(qiáng)、免疫原性差、免疫位點(diǎn)不明的小分子污染物，存在雜交瘤細(xì)胞篩選難度大、抗體親和力低、假陽性高等問題。近年來基于功能核酸對汞的檢測有了新的突破，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展了比色法、電化學(xué)、共振瑞利散射、電致發(fā)光等快速檢測技術(shù)，成為汞環(huán)境分析中的研究熱點(diǎn)［4－8］。核酸適配體（Aptamer）是一段能夠與靶分子高親和力、高特異性結(jié)合的單鏈寡核苷酸，具有檢測靈敏度高、成本低、易合成修飾等優(yōu)點(diǎn)，在基礎(chǔ)研究、分子診斷以及農(nóng)產(chǎn)品及農(nóng)田環(huán)境污染物監(jiān)測等諸多領(lǐng)域中均展示出廣闊的應(yīng)用前景，為農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)田環(huán)境中化學(xué)殘留物、生物毒素、重金屬等小分子污染物的檢測提供了一種新型、高效、快速的檢測元件，具有很大的應(yīng)用潛力［9－15］。已有研究表明，Hg2+可被適配體DNA鏈中的胸腺嘧啶（T－T）選擇性捕獲，錯(cuò)配形成T－Hg2+－T發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且親和力強(qiáng)于適配體DNA與其互補(bǔ)鏈的結(jié)合力［16］?；诖嗽恚恍晒夂碗娀瘜W(xué)適配體傳感器已經(jīng)被成功開發(fā)用于Hg2+檢測［4－7］。隨著材料與光學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光法檢測發(fā)展迅速，快速中小型熒光分光光度計(jì)是目前最常用的一種高靈敏度檢測儀器，非常適合現(xiàn)場實(shí)時(shí)快速監(jiān)測。熒光法具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確度高、適合實(shí)時(shí)監(jiān)測等特點(diǎn)，且適配體易被熒光染料修飾，是目前普遍采用的光學(xué)檢測方法。但目前采用的將熒光染料標(biāo)記到核酸適配體上的方法，可能影響DNA的高級結(jié)構(gòu)構(gòu)象及其與目標(biāo)物的結(jié)合。因此，利用非標(biāo)記適配體的熒光檢測技術(shù)具有更好的發(fā)展?jié)摿?，在環(huán)境分析、農(nóng)產(chǎn)品安全、體外診斷等痕量分析領(lǐng)域具有更大的應(yīng)用空間。本研究擬以非標(biāo)記的汞特異性核酸適配體為識別元件，結(jié)合高效的熒光染料檢測溶液體系中不同濃度的汞離子，通過探索熒光信號的變化規(guī)律及各組分的配比，確定最佳的檢測體系。同時(shí)對方法的精密度、準(zhǔn)確性和特異性進(jìn)行研究，并應(yīng)用于灌溉水樣品的檢測，以期為在線實(shí)時(shí)監(jiān)測灌溉水中汞的污染水平提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

LS－55熒光光譜儀，美國PE公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機(jī)器，Sigma公司產(chǎn)品；Millipore純水機(jī)，美國Bedford公司產(chǎn)品。

1.2 試劑

重金屬汞的適配體寡聚核苷酸序列和互補(bǔ)序列均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，HPLC純 化。Hg2+適 配 體 序 列：5'-TTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTT-3'，互 補(bǔ) 序 列：5'-AACAAACAAG GGGAAGAAAGAA-3'，用 含1 mmol/L MgCl2（pH 8.5）的10 mmol/L的PBS（pH 7.4）溶 液 進(jìn) 行 稀釋，-20℃保存。腺苷的特異性適配體序列：5'-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTA-3'，其互補(bǔ)序列：5'-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3'。汞標(biāo)準(zhǔn)溶液以及用于特異性檢測的砷、鉛、鎘、鉻和鉀元素標(biāo)準(zhǔn)溶液購自鋼研納克標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，PicoGreen熒光染料、Tris－HCl購自Sigma公司，其它試劑均購于上?；瘜W(xué)試劑公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.3 檢測原理

基于適配體DNA對汞離子的特異性結(jié)合，并利用熒光染料PicoGreen對雙鏈DNA pg級的靈敏度和嵌入雙鏈后引發(fā)熒光強(qiáng)度急劇增加（1 000倍）的特性進(jìn)行高靈敏度特異性檢測。如圖1所示，當(dāng)溶液中存在汞離子時(shí)，適配體的構(gòu)象發(fā)生變化，單鏈DNA“stem-loop”區(qū)域形成特定的立體結(jié)構(gòu)，高特異性、高親和力地與汞離子結(jié)合。隨后，加入適配體DNA互補(bǔ)鏈cDNA和PicoGreen，互補(bǔ)鏈將與溶液中未結(jié)合目標(biāo)物的游離適配體結(jié)合，形成雙鏈DNA。由于PicoGreen不結(jié)合單鏈核苷酸，僅識別并結(jié)合雙鏈DNA的螺旋溝，并發(fā)射出熒光信號［17］，因此，可通過對熒光強(qiáng)度的分析來測定目標(biāo)物汞的濃度，且汞離子的濃度與熒光強(qiáng)度成反比。

圖1 基于PicoGreen/適配體檢測汞離子的原理Fig.1 Schematic of the PicoGreen/aptamer-based method for detection of Hg2+

1.4 熒光檢測

取50 μL濃度為1 μmol/L的Hg2+適配體DNA，加入100 μL不同質(zhì)量濃度（0、0.002、0.02、0.2、2、20、200 μg/mL）的Hg2+，混勻孵化20 min后，加入50 μL濃度為1 μmol/L的適配體DNA互補(bǔ)鏈，此時(shí)Hg2+的最終質(zhì)量濃度分別為0、0.001、0.010、0.100、1、10、100 μg/mL，再加入PicoGreen。連續(xù)測定λex/λem=480 nm/530 nm處的熒光強(qiáng)度值IF（不含Hg2+的空白對照溶液熒光值為IF0），每分鐘檢測1次，持續(xù)檢測25 min。

1.5 特異性檢測

按照“1.4”檢測體系和孵育時(shí)間，以As3+、Pb2+、Cd2+、Cr2+、K+作為干擾物，在相同條件下檢測適配體對Hg2+和其他金屬離子的選擇特異性和靈敏度，金屬離子質(zhì)量濃度梯度為0、0.002、0.02、0.2、2、20、200 μg/mL。以無目標(biāo)物和干擾物，只有適配體DNA的溶液為空白對照，通過熒光強(qiáng)度變化分析Hg2+適配體與其他干擾離子的結(jié)合情況，判斷方法的特異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件的確定

為了獲得更好的熒光信號，需對PicoGreen和適配體DNA（1 μmol/L）相互作用的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。如圖2所示，低質(zhì)量濃度的Hg2+（0.002 μg/mL）在反應(yīng)5 min時(shí)的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，之后隨著PicoGreen的熒光衰退，熒光強(qiáng)度逐漸降低；更高質(zhì)量濃度的Hg2+（200 μg/mL）在反應(yīng)進(jìn)行5 min后，熒光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定。這說明前5 min適配體/Hg2+復(fù)合物與適配體/互補(bǔ)鏈DNA雙鏈之間存在競爭，Hg2+濃度越高越具競爭優(yōu)勢，且適配體/Hg2+復(fù)合物的結(jié)合親和力強(qiáng)于適配體/互補(bǔ)鏈DNA雙鏈。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇5 min作為適宜的反應(yīng)時(shí)間。

圖2 不同汞離子濃度下熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況Fig.2 Changes of fluorescence intensity with time under different mercury ion concentrations

2.2 方法檢出限

隨汞離子濃度的升高，530 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸降低，汞離子濃度的對數(shù)（lgcHg，x）和熒光比值IF/IF0（y）之間呈良好的線性關(guān)系：y=1.157 2－0.162 6x，r2=0.988。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差斜率法［18］，獲得本方法的檢出限為0.38 ng/mL，線性范圍為0.001～100 μg/mL，滿足世界衛(wèi)生組織對飲用水中汞離子的限量標(biāo)準(zhǔn)（1 ng/mL）要求［19］。

2.3 特異性分析

為了驗(yàn)證本方法對汞離子檢測的特異性，以同濃度的As3+、Pb2+、Cd2+、Cr2+、K+為干擾物，在相同條件下檢測適配體對Hg2+和其他金屬離子的選擇特異性，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，加入0.02～200 μg/mL的Hg2+作為目標(biāo)物時(shí)，檢測體系的熒光變化率顯著高于其他金屬離子，而以As3+、Pb2+、Cd2+、Cr2+、K+離子作為目標(biāo)物的溶液熒光強(qiáng)度變化很小。

圖3 不同金屬離子的相對熒光強(qiáng)度變化Fig.3 Changes in the relative fluorescence intensity with various metalions

另外，為了證明Hg2+適配體的特異性和其他寡核苷酸對檢測體系的影響，選用與汞離子適配體相似，同樣具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的腺苷適配體及其互補(bǔ)鏈作為識別元件，對不同質(zhì)量濃度（0、0.002、0.02、0.2、2、20、200 μg/mL）汞離子進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)汞離子的加入并未顯著降低溶液的熒光值，進(jìn)一步證明了本方法的特異性（圖4）。上述結(jié)果表明本方法使用的適配體序列具有較好的選擇性，基于此建立的Hg2+的檢測方法具有較好的特異性。

圖4 利用腺苷適配體對Hg2+進(jìn)行檢測的熒光結(jié)果Fig.4 Fluorescence detection results of Hg2+by aptamer of adenosine

2.4 灌溉水樣品檢測

以北京市郊區(qū)農(nóng)業(yè)灌溉水作為水樣，經(jīng)原子熒光法未檢出總汞。將Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到該水樣中，獲得不同Hg2+質(zhì)量濃度（50、100、500 ng/mL）的灌溉水樣，按照本方法所建體系進(jìn)行測定，獲得加標(biāo)灌溉水樣中Hg2+回收結(jié)果（表1），其回收率為95.2%～97.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～4.0%。雖然灌溉水基質(zhì)中存在不同類型的干擾物，但采用本體系檢測Hg2+的加標(biāo)回收結(jié)果良好。結(jié)果表明，本方法適用于農(nóng)田灌溉水中汞的檢測，在水質(zhì)的實(shí)時(shí)在線檢測方面具有良好的應(yīng)用前景。

表1 灌溉水樣中添加Hg2+回收結(jié)果（n=3）Table 1 Recovery results of adding Hg2+in irrigation water samples（n=3）

2.5 方法對比

本研究建立的基于汞特異性適配體熒光法檢測Hg2+的方法無需對DNA分子和熒光染料進(jìn)行設(shè)計(jì)和修飾，可將合成好的單鏈寡聚核苷酸直接與熒光染料以及適配體互補(bǔ)鏈混合形成檢測體系，對溶液中的Hg2+進(jìn)行監(jiān)測。與ICP－MS和原子熒光等方法相比，該方法線性范圍寬，不使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化劑和還原劑，具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、用時(shí)短（可在5 min內(nèi)完成）的優(yōu)勢（表2），在現(xiàn)場實(shí)時(shí)監(jiān)測方面有良好的應(yīng)用前景。

表2 與已報(bào)道方法的比較Table 2 Comparison between this method and the reported methods

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于汞特異性核酸適配體檢測農(nóng)田灌溉水中汞離子的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測方法，應(yīng)用核酸染料PicoGreen可以嵌入雙鏈DNA的特性，未對適配體進(jìn)行任何修飾，保證了適配體的空間構(gòu)象及其與目標(biāo)物結(jié)合的特異性，通過檢測溶液的熒光強(qiáng)度即可監(jiān)測汞離子濃度。該方法線性范圍為0.001～100 μg/mL，檢出限達(dá)到0.38 ng/mL，對汞離子具有很好的特異性，在實(shí)際樣品檢測中表現(xiàn)出較好的線性和基質(zhì)適應(yīng)性，具有簡單、快速、靈敏的特點(diǎn)，在現(xiàn)場快速檢測和高通量實(shí)時(shí)監(jiān)測中具有很好的應(yīng)用前景。