UHPLC－MS/MS法分析氯化乙酰甲膽堿霧化氣溶膠濃度

朱狄峰，趙劍嵐，洪雅雯，錢仁云，陳 超，平 麗

（浙江大學(xué) 藥學(xué)院 藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，浙江 杭州310058）

吸入用氯化乙酰甲膽堿是一種供霧化的吸入用粉末制劑，屬于乙酰甲膽堿類藥物，其主要成分為氯化乙酰甲膽堿。氯化乙酰甲膽堿屬于M膽堿受體激動(dòng)劑，對(duì)心血管系統(tǒng)作用較強(qiáng)，也可收縮支氣管平滑?。?－3］。臨床上常用作支氣管激發(fā)試驗(yàn)（MIC）檢測(cè)氣道高反應(yīng)性的診斷試劑［4－5］。歐洲呼吸學(xué)會(huì)（ERS）在2017年更新了支氣管激發(fā)試驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)［6］，該標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)診斷試劑劑量而非濃度的重要性。但是，ERS在隨后的研究發(fā)現(xiàn)，僅考慮劑量會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)存在許多問題和不確定性。作為特殊的給藥制劑，吸入給藥制劑是通過霧化后的氣溶膠進(jìn)入呼吸道深處的肺部發(fā)揮局部或全身作用，因此，ERS建議關(guān)注診斷試劑實(shí)際霧化吸入的藥物濃度［7］。

目前，僅國外報(bào)道了氯化乙酰甲膽堿的多種檢測(cè)方法，包括比色法［8］、離子對(duì)液相色譜法［9］和毛細(xì)管電泳法［10－11］，但檢測(cè)濃度范圍均在50 μg/mL以上，不適用于低濃度的檢測(cè)，而霧化氣溶膠狀態(tài)下的濃度檢測(cè)方法尚無相關(guān)報(bào)道。乙酰甲膽堿類藥物的霧化氣溶膠濃度檢測(cè)存在挑戰(zhàn)，致使ERS指南推薦用沙丁胺醇水溶液代替該類藥物的檢測(cè)，以沙丁胺醇?xì)馊苣z量外推乙酰甲膽堿氣溶膠的藥物濃度［7］。然而，此種替代方法帶來的弊端是顯而易見的，實(shí)際乙酰甲膽堿氣溶膠量仍未可知。超高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜法（UHPLC－MS/MS）是痕量物質(zhì)檢測(cè)的常用方法［12－13］。本研究通過改良吸入暴露裝置，采用UHPLC－MS/MS法對(duì)吸入制劑給藥過程中霧化氣溶膠中的氯化乙酰甲膽堿進(jìn)行檢測(cè)，可用于吸入用氯化乙酰甲膽堿氣溶膠的質(zhì)量控制，也為藥物安全性評(píng)價(jià)和藥代藥效相關(guān)性（PK/PD）研究的供試品分析提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（ACQUITY UPLC I－CLASS+/Xevo TQ system，美國Waters公司）；JAC 4020超聲波清洗器（韓國KODO技術(shù)研究有限公司）；XS205十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；5810R離心機(jī)、Research plus移液器（德國Eppendorf公司）；Purelab Option S7超純水系統(tǒng)（英國ELGA LabWater公司）；PARI BOY N型壓縮霧化吸入機(jī)（德國百瑞公司）；YAN30012氣溶膠定量霧化注射針（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）。

吸入用氯化乙酰甲膽堿（商品名：Provocholine，日本三和化工株式會(huì)社，規(guī)格：每支100 mg）；氯化乙酰甲膽堿對(duì)照品（東京化學(xué)工業(yè)有限公司，含量為100.6%，批號(hào)：HKLTH）；內(nèi)標(biāo)：酒石酸氫膽堿對(duì)照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量≥98%，批號(hào)：1108803）。氯化鈉注射液（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號(hào)：C1808102）。乙腈（色譜純，德國Merck KGaA公司）；甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液的制備

精密稱定氯化乙酰甲膽堿對(duì)照品適量，用乙腈配制成100 μg/mL的儲(chǔ)備液；相同方法配制2.5 μg/mL的內(nèi)標(biāo)酒石酸氫膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取氯化乙酰甲膽堿儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度分別為10、20、50、80、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（內(nèi)標(biāo)均為25 ng/mL），即得。

取吸入用氯化乙酰甲膽堿1支，加入氯化鈉注射液4.0 mL，振搖溶解配制成質(zhì)量濃度為25 mg/mL的供試品溶液。

1.3 提取溶劑的制備

精密稱定酒石酸氫膽堿對(duì)照品適量，用乙腈稀釋成25 ng/mL的酒石酸氫膽堿溶液作為提取溶劑。

1.4 霧化氣溶膠樣品溶液的制備

取吸入用氯化乙酰甲膽堿供試品溶液，倒入壓縮霧化吸入機(jī)藥皿中，將出氣口連接至自制吸入暴露裝置上口（圖1），壓縮霧化吸入機(jī)的霧化速率為0.25 mL/min，霧化時(shí)間為3 min。經(jīng)霧化機(jī)霧化后溶液會(huì)迅速形成氣溶膠。在室溫下霧化1 min后，從吸入暴露裝置上、中、下3個(gè)位置的中間導(dǎo)管口緩慢抽取含藥物的氣溶膠至50 mL注射器（內(nèi)含3 mL提取溶劑）中，抽取后迅速用小膠塞封閉注射器，靜置5 min，振搖2 min，重復(fù)靜置振搖1次，移至離心管進(jìn)行離心（離心力為8 000 g，離心時(shí)間為10 min），上清液作為供試品霧化氣溶膠樣品溶液。

圖1 吸入暴露裝置示意圖Fig.1 The schematic of inhalation exposure device

1.5 儀器條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫為40℃；以0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.3 mL/min；分析時(shí)間為5 min；進(jìn)樣量為5 μL。梯度程序?yàn)椋?.0～2.0 min，30%～50% B；2.0～3.1 min，50%～90% B；3.1～4.0 min，90% B；4.0～4.1 min，90%～30%B；4.1～5.0 min，30%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；毛細(xì)管電壓為2.00 kV；碰撞氣流速為0.15 mL/min；離子源溫度為150℃；脫溶劑和加熱塊溫度為500℃；脫溶劑氣體流速為800 L/h。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式進(jìn)行監(jiān)測(cè)，總分析運(yùn)行時(shí)間為5 min。錐孔電壓、碰撞能量、前體和產(chǎn)物離子等參數(shù)見表1。

表1 氯化乙酰甲膽堿及酒石酸氫膽堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters of methacholine chloride and choline bitartrate

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化

考察了水－乙腈、水－甲醇、0.1%甲酸水－乙腈、0.1%甲酸水－甲醇作為流動(dòng)相對(duì)氯化乙酰甲膽堿和內(nèi)標(biāo)酒石酸氫膽堿的影響，結(jié)果顯示，以0.1%甲酸水－乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果較好，故選用該溶液作為流動(dòng)相?？疾炝薃CQUITY BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Agilent Extend－C18柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）和Agilent Eclipse XDB－C18柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）等不同色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)采用柱長過短、粒徑過大的色譜柱時(shí)待測(cè)藥物的保留時(shí)間較短，峰面積重復(fù)性較差，不利于藥物的洗脫分離。而采用ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）的保留時(shí)間和分離效果相對(duì)合適，因此選擇該柱為色譜分離柱。

氯化乙酰甲膽堿和酒石酸氫膽堿均為季銨堿類化合物，可離子化產(chǎn)生陽離子，因此選擇ESI正離子模式進(jìn)行分析。通過分別注入500 ng/mL的氯化乙酰甲膽堿和內(nèi)標(biāo)溶液至質(zhì)譜儀，使用儀器Intellistart自動(dòng)調(diào)諧功能在MRM模式下對(duì)兩個(gè)化合物進(jìn)行碎片離子分析，發(fā)現(xiàn)氯化乙酰甲膽堿和酒石酸氫膽堿具有2個(gè)特征子離子，其m/z分別為101.1、60.1和60.0、45.2，比較最終的響應(yīng)值和穩(wěn)定性，確定氯化乙酰甲膽堿和酒石酸氫膽堿的定量子離子分別為m/z101.1和m/z60.0，并獲得相應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量。在“1.5”條件下，氯化乙酰甲膽堿和內(nèi)標(biāo)與其他干擾物質(zhì)的分離度良好。圖2為優(yōu)化后樣本檢測(cè)的MRM色譜圖。

圖2 霧化氣溶膠樣品溶液的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of aerosol sample

2.2 提取方法的選擇

分別比較了水、甲醇、50%甲醇水、50%乙腈水、乙腈作為供試品霧化后提取溶劑的效果，結(jié)果顯示，水、甲醇、50%甲醇水、50%乙腈水作提取溶劑時(shí)，氯化乙酰甲膽堿的峰形出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。乙腈作為提取溶劑時(shí)氯化乙酰甲膽堿的出峰較好，提取回收率超過95%，因此選擇乙腈為提取溶劑（圖3）。同時(shí)考察了不同注射器體積（10、20、50 mL）的影響，發(fā)現(xiàn)注射器體積為10 mL和20 mL時(shí)供試品霧化氣溶膠樣品溶液的濃度低于或接近定量下限，最終采用50 mL注射器。還對(duì)比了提取溶液體積（1、2、3、4、5 mL）的影響，結(jié)果顯示提取溶液體積為1 mL和2 mL時(shí)的提取回收率均低于90%，提取溶液體積為4 mL和5 mL時(shí)溶液的濃度相對(duì)較低，重復(fù)性低于3 mL時(shí)，因此最終采用3 mL作為提取溶液體積。

圖3 乙腈為提取溶劑時(shí)氯化乙酰甲膽堿的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of methacholine chloride with acetonitrile as the extraction solvent

2.3 霧化吸入條件的優(yōu)化

目前，吸入制劑霧化濃度主要采用重量法檢測(cè)，通過不同濾膜吸附后質(zhì)量的變化值進(jìn)行計(jì)算［14－18］，該方法適用于粉末類制劑。而溶液類制劑會(huì)隨著濾膜吸附逐漸達(dá)到飽和，導(dǎo)致吸附效率遞減，檢測(cè)的濃度不能反映實(shí)際的霧化濃度。本研究自制了簡易吸入暴露裝置（見圖1），可直接抽取霧化氣溶膠進(jìn)行檢測(cè)。其上部為進(jìn)氣口，下部有調(diào)節(jié)出氣孔，自上而下每隔15 cm有導(dǎo)管連接至外部。

霧化吸入過程中，吸入暴露裝置結(jié)構(gòu)、霧化速率和霧化時(shí)間是關(guān)鍵因素?？紤]到裝置主要用于吸入毒性研究，為確保單組動(dòng)物給藥可在一次吸入試驗(yàn)完成，結(jié)合每個(gè)孔的合理間距，將其設(shè)計(jì)為高60 cm，直徑40 cm的密閉鋼質(zhì)圓筒。同時(shí)，對(duì)進(jìn)氣口和出氣口進(jìn)行調(diào)試后確定孔徑大小為3 cm。吸入用氯化乙酰甲膽堿在臨床上的使用時(shí)間一般低于3 min，25 mg/mL供試品溶液使用的累積吸入劑量一般約為0.3 mg［19］。因此，霧化時(shí)間設(shè)計(jì)為3 min。根據(jù)最終的動(dòng)物預(yù)期藥物吸入量進(jìn)行優(yōu)化后，確定霧化速率為0.25 mL/min，該速率下動(dòng)物累積預(yù)期藥物吸入量可達(dá)到0.3 mg。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性取空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液和供試品霧化氣溶膠樣品溶液（中間位置樣本），吸取5 μL進(jìn)樣分析，其中樣品溶液的MRM色譜圖見圖2。氯化乙酰甲膽堿和內(nèi)標(biāo)酒石酸氫膽堿的保留時(shí)間分別為1.28、1.11 min，經(jīng)計(jì)算得到兩成分的拖尾因子均不大于2.0，與各自相鄰峰的分離度均大于3.0。表明兩成分的分離度良好，無雜質(zhì)干擾。

2.4.2 線性關(guān)系與定量下限精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μL（質(zhì)量濃度為10、20、50、80、100 ng/mL，內(nèi)標(biāo)均為25 ng/mL）進(jìn)樣分析，得到色譜峰面積。以氯化乙酰甲膽堿的質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)，氯化乙酰甲膽堿和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得回歸方程。并以信噪比大于10時(shí)的最低線性濃度確定為定量下限（LOQ）。結(jié)果表明，氯化乙酰甲膽堿在10～100 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.070 0X+0.030 1，r＞0.999，定量下限為10 ng/mL。

2.4.3 儀器精密度取20、50、80 ng/mL的氯化乙酰甲膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液（內(nèi)標(biāo)均為25 ng/mL）連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算儀器精密度，其色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.2%、1.0%和1.2%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)取已知濃度的供試品霧化氣溶膠樣品溶液（中間位置樣本）各3份，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率為98.1%～100%，平均回收率為99.2%，平均RSD為0.80%（見表2）。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 2 Results of recovery tests（n=3）

2.4.5 提取回收率取氯化乙酰甲膽堿儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)溶液適量，用乙腈稀釋得到低、中、高質(zhì)量濃度的樣品（氯化乙酰甲膽堿為20、50、80 ng/mL，內(nèi)標(biāo)為25 ng/mL），進(jìn)樣分析得到色譜峰。用氣溶膠定量霧化注射針吸取10 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液（氯化乙酰甲膽堿為6、15、24 μg/mL），霧化注入至50 mL注射器（內(nèi)含3 mL提取溶劑）中，其他按霧化氣溶膠樣品處理，進(jìn)樣分析得到色譜峰。計(jì)算兩者峰面積的比值得到提取回收率和RSD。結(jié)果表明，霧化氣溶膠的平均提取回收率為95.7%，RSD為1.8%。

2.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取質(zhì)量濃度均為20、50、80 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液，以及該質(zhì)量濃度下的供試品溶液經(jīng)霧化1 min后得到的供試品霧化氣溶膠樣品溶液，分別放置0、4、8、12 h后進(jìn)樣測(cè)定，考察氯化乙酰甲膽堿的穩(wěn)定性。最終計(jì)算得到氯化乙酰甲膽堿濃度的RSD均低于1.5%，表明標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液和供試品霧化氣溶膠樣品溶液均在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 供試品霧化氣溶膠樣品的含量測(cè)定

供試品在吸入裝置中經(jīng)霧化1 min后，測(cè)得其上、中、下位置的氯化乙酰甲膽堿氣溶膠樣品平均濃度分別為609.2、604.9、610.2 mg/m3，RSD為1.2%，上、中、下位置的氣溶膠濃度基本達(dá)到了均一穩(wěn)定，氣溶膠的平均藥物濃度為608.1 mg/m3，表明可以用于吸入性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。在用于大鼠吸入研究實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)大鼠肺功能的通氣量正常參數(shù)值216.02 mL/min（76～517 mL/min）［20－21］，計(jì)算得到大鼠在吸入暴露裝置經(jīng)霧化3 min后的累積吸入量約為0.39 mg（0.14～0.94 mg），該吸入量符合預(yù)期目的。

3 結(jié)論

本文通過比較不同的檢測(cè)條件和提取方法對(duì)霧化氣溶膠中氯化乙酰甲膽堿定量的影響，確定以0.1%甲酸水－乙腈為流動(dòng)相，乙腈為提取溶劑，建立了定量檢測(cè)霧化氣溶膠中氯化乙酰甲膽堿的UHPLC－MS/MS方法。該法快速靈敏，精密度、穩(wěn)定性和回收率均符合要求。通過設(shè)計(jì)簡易吸入霧化裝置，并優(yōu)化霧化速率、霧化時(shí)間，將UHPLC－MS/MS方法成功應(yīng)用于測(cè)定霧化裝置中的氯化乙酰甲膽堿氣溶膠濃度，發(fā)現(xiàn)氣溶膠在霧化裝置中霧化1 min后即達(dá)到均一穩(wěn)定。該方法適用于吸入性藥物評(píng)價(jià)研究，也為吸入制劑霧化氣溶膠供試品分析和有效控制提供了科學(xué)依據(jù)。