圓錐南芥適應(yīng)高山干旱環(huán)境機(jī)制

唐 婷，陶發(fā)清，李唯奇

(1. 湖南科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物遺傳改良與綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重金屬污染土壤生態(tài)修復(fù)與安全利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湘潭 411201; 2. 中國科學(xué)院 昆明植物研究所 西南野生生物種質(zhì)資源庫, 昆明 650201)

種子萌發(fā)過程非常復(fù)雜，不僅受內(nèi)部生理生化活動調(diào)控，還受外界環(huán)境因素如水分、溫度、氧氣和光照等影響[1]。在種子成熟過程中，母體植株?duì)I養(yǎng)組織合成大量ABA(Abscisic acid, ABA)運(yùn)輸至種子，對種子后續(xù)發(fā)育發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2-3]。在擬南芥種子發(fā)育后期，合子組織中產(chǎn)生ABA誘導(dǎo)種子休眠[4]。木豆植物的種子遭遇高溫脅迫時(shí)，通過合成多種HSPs(Heat shock proteins, HSPs)促進(jìn)種子萌發(fā)過程胚軸伸長，增強(qiáng)耐熱能力[5]。在煙草中，過表達(dá)HSP70能夠提高植物對干旱的耐受能力[6]。另外，過表達(dá)sHSP17.7的水稻植株能增強(qiáng)對水分脅迫的耐受性[7]。植物在面臨不利生長環(huán)境條件下，通過啟動相關(guān)生理生化和分子活動，增強(qiáng)種子抗逆能力或調(diào)控種子以休眠的形式度過，這是適應(yīng)環(huán)境的保護(hù)性策略。

高山環(huán)境綜合有多種非生物脅迫，包括溫度脅迫、干旱脅迫和土壤貧瘠等[8]。圓錐南芥(Arabispaniculata)生長在高山環(huán)境中，是擬南芥(Arabidopsisthaliana)的近緣物種[9]。圓錐南芥通過調(diào)整營養(yǎng)生長和繁殖發(fā)育循環(huán)以適應(yīng)高山氣候條件[10]。前期發(fā)現(xiàn)圓錐南芥對短期高溫脅迫具有光合修復(fù)能力和系統(tǒng)性耐熱能力[11-12]，還能通過調(diào)整細(xì)胞膜膜脂分子的含量和組成方式適應(yīng)長期中高溫脅迫[13]。在秋季，圓錐南芥種子開始成熟；當(dāng)冬季來臨，高山土壤上覆蓋冰雪，水分非常短缺；到第二年春季，冰雪融化，圓錐南芥種子萌發(fā)，逐漸生長成幼苗。根據(jù)圓錐南芥的生長周期，缺水環(huán)境是否作為其種子休眠的誘導(dǎo)因素，以避免種子萌發(fā)后被低溫冰雪凍傷，值得探索。

本文用不同濃度(150、300和600 mmol/L)甘露醇模擬高山環(huán)境中的干旱脅迫，通過將圓錐南芥與其近緣物種擬南芥進(jìn)行比較，旨在明確干旱脅迫是否導(dǎo)致圓錐南芥種子休眠；通過檢測萌發(fā)過程植物內(nèi)源激素ABA含量和熱激蛋白合成量，以挖掘其在干旱脅迫下對種子萌發(fā)是否發(fā)揮生理功能。

1 材料和方法

1.1 材料和處理

圓錐南芥和擬南芥種子經(jīng)75%體積分?jǐn)?shù)的乙醇和5%體積分?jǐn)?shù)的NaClO進(jìn)行表面消毒，種植于含有不同甘露醇濃度MS培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱中(22 ℃)，光照120 μmol/(m2·s)，光周期為(12 h/12 h)，培養(yǎng)22 d。從第1天開始一直到第22天，每天統(tǒng)計(jì)兩物種的萌發(fā)率，萌發(fā)統(tǒng)計(jì)以胚軸伸出種皮為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 植物激素ABA含量的檢測

利用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定植物組織的內(nèi)源激素。稱取0.5～1.0 g植物材料，加 2 mL樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL 試管,再用2 mL提取液分2次將研缽沖洗干凈，沖洗液一并轉(zhuǎn)入試管，搖勻后放置在4 ℃下提取4 h，1 000 r/min 離心15 min，取上清液。沉淀再加入1 mL 提取液，搖勻，置4 ℃下再提取1 h，離心，合并上清液記錄最終體積。上清液過C-18 固相萃取柱后轉(zhuǎn)入離心管，用氮?dú)獯蹈?，用樣品稀釋液定容。在酶?biāo)板中加入包被抗原，37 ℃水浴鍋中3 h后，室溫下洗滌包被液。加入ABA標(biāo)準(zhǔn)品(100 g/mL)，待測樣品和一抗，37 ℃ 水浴鍋中孵育0.5 h，經(jīng)洗滌后再加二抗，37 ℃ 水浴鍋中孵育0.5 h，再次洗滌后，加底物鄰苯二胺(OPD)顯色，用酶標(biāo)儀測定490 nm處OD值。

1.3 熱激蛋白的檢測

將300 mmol/L甘露醇處理前后的種子用液氮研磨成粉，然后添加0.5 mL蛋白提取液，2 μL β-巰基乙醇和2.5 μL PMSF，震蕩混勻。4 ℃，7 000 r/min離心10 min，取上清液檢測蛋白質(zhì)濃度。按照相應(yīng)的比例配好分離膠和濃縮膠，待凝固后，添加蛋白樣品，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜。將已轉(zhuǎn)的PVDF膜用甲醇潤洗后，用5% 脫脂牛奶封閉，然后進(jìn)行一抗(HSP101和HSP70)雜交，再次洗滌后，進(jìn)行二抗雜交，最后用NBT顯色。

1.4 數(shù)據(jù)分析和處理

用SPSS(19.0)單因素分析(ANOVA)，進(jìn)行多重比較數(shù)據(jù)是否存在顯著性差異(P<0.05)，最后用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 干旱脅迫對圓錐南芥和擬南芥種子萌發(fā)率的影響

(a)甘露醇處理后圓錐南芥和擬南芥的種子萌發(fā)的表型分析; (b)甘露醇處理后圓錐南芥和擬南芥的種子萌發(fā)(三角形為圓錐南芥，圓形為擬南芥)。圖1 甘露醇對圓錐南芥和擬南芥種子萌發(fā)的影響分析Figure 1 Effects of mannitol on seed germination rates of A. paniculata and A. thaliana

在培養(yǎng)基中添加不同濃度的甘露醇模擬干旱脅迫，比較圓錐南芥與擬南芥的種子萌發(fā)率(圖1)。在正常培養(yǎng)基上，擬南芥從第1天開始萌發(fā)，萌發(fā)率為11.6%；圓錐南芥從第3天開始萌發(fā)，萌發(fā)率為57.8%，而此時(shí)擬南芥萌發(fā)率達(dá)97.3%。在含150 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基上，擬南芥萌發(fā)趨勢稍慢于正常生長條件，第5天萌發(fā)率達(dá)到95.2%；圓錐南芥在第5天才出現(xiàn)萌發(fā)，萌發(fā)率為43.2%，第10天逐漸上升至79.7%，后續(xù)萌發(fā)率保持不變。隨著甘露醇濃度升高至300 mmol/L，擬南芥萌發(fā)率在第8天仍能達(dá)到94.5%；圓錐南芥的種子在第22天才出現(xiàn)13.9%的萌發(fā)率。當(dāng)甘露醇濃度升高到600 mmol/L，擬南芥在第8天開始萌發(fā)，萌發(fā)率為23.0%，在第22天，達(dá)到36.2%；圓錐南芥種子整個(gè)培養(yǎng)周期都沒有萌發(fā)。然而，將受甘露醇處理的圓錐南芥種子轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基上，又能正常萌發(fā)了。綜上表明干旱脅迫會推遲植物的萌發(fā)時(shí)間，而圓錐南芥種子萌發(fā)對干旱脅迫更加敏感，出現(xiàn)種子暫時(shí)休眠的現(xiàn)象。

2.2 干旱脅迫對圓錐南芥和擬南芥種子中ABA含量的影響

為了從生理水平上探索影響干旱脅迫下圓錐南芥種子出現(xiàn)休眠的原因，利用ELISA檢測了兩物種干種子，在正常培養(yǎng)基上即將萌發(fā)的種子和在300 mmol/L甘露醇處理下種子內(nèi)源激素ABA含量(圖2)。在已成熟的干種子中，擬南芥ABA含量為1.1 ng/g，圓錐南芥ABA含量達(dá)到9.2 ng/g，顯著高于擬南芥，說明圓錐南芥干種子受ABA調(diào)控而具有休眠性狀；擬南芥干種子內(nèi)源ABA含量比較低，不具有休眠性狀。在正常培養(yǎng)基上已吸脹即將萌發(fā)的種子，兩物種ABA的含量都比干種子顯著降低，擬南芥ABA含量下降更顯著，也與擬南芥種子萌發(fā)更快的特點(diǎn)相吻合。受甘露醇的影響，兩物種的ABA含量都比其正常萌發(fā)時(shí)更高，圓錐南芥的ABA含量又回升到干種子的水平，這可能與二者種子萌發(fā)都有所延遲相關(guān)。

不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖2 圓錐南芥和擬南芥種子ABA含量測定Figure 2 The ABA contents in A. paniculata and A. thaliana

2.3 干旱脅迫對圓錐南芥和擬南芥種子中HSPs蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平上探索影響干旱脅迫誘導(dǎo)圓錐南芥種子出現(xiàn)暫時(shí)休眠的原因，利用Western Blot檢測兩物種干種子，在正常培養(yǎng)基上將萌發(fā)的種子和在300 mmol/L甘露醇處理下種子的HSP101和HSP70蛋白表達(dá)含量。在正常培養(yǎng)基中，圓錐南芥和擬南芥的HSP101蛋白表達(dá)量都比較低，其中擬南芥的含量略高。在甘露醇處理下，擬南芥的HSP101表達(dá)量顯著升高，圓錐南芥的HSP101表達(dá)量較對照變化不大，其表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于擬南芥。另外，在正常條件下，兩物種的HSP70含量都非常低，幾乎檢測不到。然而，受甘露醇誘導(dǎo)，擬南芥HSP70表達(dá)量急劇增加，圓錐南芥HSP70表達(dá)量仍保持很低的水平。結(jié)果說明：干旱脅迫誘導(dǎo)擬南芥HSP101和 HSP70蛋白合成，以參與和維持種子萌發(fā)過程，圓錐南芥由于其HSP101和 HSP70不受干旱脅迫誘導(dǎo)，因此可能不參與萌發(fā)，導(dǎo)致出現(xiàn)短暫性種子休眠。

3 討論與結(jié)論

高山環(huán)境是一個(gè)綜合有干旱、高溫和低溫等各種氣候脅迫的天然實(shí)驗(yàn)室。高山植物最本質(zhì)的特點(diǎn)是：種子不會在當(dāng)前季節(jié)(冬季前)萌發(fā)，只有在冬季缺水環(huán)境下經(jīng)歷了足夠長時(shí)間的休眠期，在雪融化后，萌發(fā)才迅速開始，隨后的萌發(fā)活動具有明顯的時(shí)間延續(xù)性[14]。另外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15],加利福尼亞州每年生雜草在春季提前完善根系發(fā)育和縮小植株形態(tài)，通過以夏季休眠的形式度過炎熱缺水的環(huán)境，最終保持其存活率。圓錐南芥生長在高山環(huán)境中，經(jīng)過長期進(jìn)化，各個(gè)發(fā)育階段已適應(yīng)高山環(huán)境的各種特殊氣候條件。圓錐南芥在干旱環(huán)境下保持種子休眠的狀態(tài)(圖1)，這可能是其自身對冬季寒冷氣候的一種保護(hù)策略，也是對高山極端環(huán)境的適應(yīng)策略。

在干旱脅迫下，ABA通過控制葉片中氣孔關(guān)閉減少水分喪失，啟動植物中一系列響應(yīng)ABA相關(guān)基因表達(dá)的信號途徑，提高植物的抗旱能力[16]。ABA含量已成為衡量植物對干旱耐受能力高低的一種重要指標(biāo)。在種子吸脹過程中，ABA從頭合成代謝受抑制，且分解代謝激活，其含量降低啟動萌發(fā)過程[17]。然而，在種子成熟過程中，ABA合成代謝增強(qiáng)，其含量升高啟動休眠。因此，ABA含量對調(diào)控種子萌發(fā)和休眠的動態(tài)平衡發(fā)揮重要的作用。在成熟的種子中，圓錐南芥的ABA含量顯著高于擬南芥(圖2)，從另外一個(gè)角度說明其種子處于休眠狀態(tài)。在正常萌發(fā)過程中，圓錐南芥ABA含量明顯下降，說明其分解代謝加強(qiáng)，和其他植物一樣，圓錐南芥種子的休眠狀態(tài)已轉(zhuǎn)變成萌發(fā)狀態(tài)。通過甘露醇處理，圓錐南芥種子的ABA含量又回升到干種子的水平，說明其種子再次處于休眠狀態(tài)。綜合以上可以得知，圓錐南芥在干旱環(huán)境下，啟動種子ABA含量的合成代謝，使ABA含量升高，這是圓錐南芥種子適應(yīng)高山冬季氣候的保護(hù)性策略。

熱激蛋白在大多數(shù)植物應(yīng)對高溫脅迫和干旱脅迫過程中發(fā)揮保護(hù)性作用[18]。據(jù)報(bào)道印度芥末HSP101 受熱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)量增加數(shù)倍[19]，小分子HSP17.4的轉(zhuǎn)錄水平受到干旱脅迫誘導(dǎo)而升高[20]。異源超表達(dá)紫花苜蓿MsHSP70的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株對干旱脅迫具有更強(qiáng)的耐受性[21]。廣寄生[Taxillusichinensis(DC.) Danser]HSP可能參與種子對干旱脅迫的初期響應(yīng)[22]。研究發(fā)現(xiàn)匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)小分子HSP17.4在種子萌發(fā)過程中具有調(diào)控ABA相關(guān)信號途徑功能[23]。本研究發(fā)現(xiàn)圓錐南芥種子HSP101和HSP70不受干旱脅迫而誘導(dǎo)表達(dá)，推測可能其種子內(nèi)部ABA含量已經(jīng)儲備較高，其合成代謝已非?；钴S，不需要耗費(fèi)大量物質(zhì)和能量合成HSP101和HSP70以激活A(yù)BA合成代謝通路。擬南芥HSP101和HSP70在干旱條件下，表達(dá)量明顯增強(qiáng)(圖3)，推測其可能依靠HSP誘導(dǎo)ABA的生物合成來應(yīng)對干旱脅迫。

圖3 甘露醇處理圓錐南芥和擬南芥種子萌發(fā)過程HSP101和HSP70蛋白表達(dá)分析Figure 3 Protein expression analysis of HSP101 and HSP70 in germinated seeds of A. paniculata and A. thaliana on the normal growth medium and growth medium supplied with mannitol