鐵死亡調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

馬臣杰，張 雯，曾 瑾，宋孚洋

(1. 寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；2. 寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，銀川 750001)

細(xì)胞死亡(Cell death)與生物體的生長、發(fā)育、衰老和疾病密切相關(guān)。迄今為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)凋亡(Apoptosis)、程序性壞死(Necroptosis)、焦亡(Pyroptosis)和氧中毒(Oxeiptosis)等多種程序性細(xì)胞死亡(Programmed cell death，PCD)。Dolmsy等[1]在篩選抗腫瘤藥物時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠引起癌細(xì)胞死亡的新化合物Erastin。有趣的是，Erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式與當(dāng)時(shí)已知的細(xì)胞死亡方式皆不相同，未觀察到凋亡小體的形成、DNA的斷裂以及Caspase家族的激活，亦無法被Caspase抑制劑逆轉(zhuǎn)。經(jīng)過數(shù)年深入研究，Dixony等[2]于2012年進(jìn)一步提出了一種鐵依賴性的程序性細(xì)胞死亡概念，并將其正式并命為鐵死亡(Ferroptosis)。

鐵死亡的發(fā)生伴隨著細(xì)胞內(nèi)鐵離子流紊亂、活性氧(ROS)和脂質(zhì)過氧化物水平的顯著性升高等現(xiàn)象，最終因細(xì)胞膜磷脂內(nèi)側(cè)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)導(dǎo)致膜破損，細(xì)胞崩解死亡。已經(jīng)證實(shí)鐵死亡與神經(jīng)退行性疾病、腫瘤疾病、心腦血管疾病和急性腎損傷等多種疾病的存在密切關(guān)系。

1 鐵死亡的特征

1.1 鐵死亡的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

鐵死亡形態(tài)學(xué)特征主要包括：線粒體膜密度增高、脊顯著減少、膜出現(xiàn)破裂，整體表現(xiàn)為線粒體萎縮；細(xì)胞核大小正常且保持完整、染色質(zhì)未見發(fā)生凝集；細(xì)胞膜未見起泡，但膜密度增加；膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜的流動(dòng)性均發(fā)生了改變[3](表1)。

表1 鐵死亡與凋亡、程序性壞死及焦亡之間的特征比較Table 1 Characteristic comparison among ferroptosis，apoptosis，necroptosis and pyroptosis

1.2 鐵死亡的生物化學(xué)特征

鐵死亡所具有典型的生化特征，常被用來評價(jià)鐵死亡的發(fā)生狀態(tài)。如：細(xì)胞內(nèi)Fe2+和活性氧(ROS)水平的升高發(fā)生芬頓反應(yīng)(Fenton reaction)，半胱氨酸攝入量的減少，谷胱甘肽的耗竭，羥基(OH-)、羥基自由基(·HO)和脂質(zhì)氫過氧化物(Lipid hydroperoxides，LOOH)的水平升高，生物膜中多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等[4]。

1.3 鐵死亡的調(diào)控因子

研究發(fā)現(xiàn)，參與調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵細(xì)胞因子大致有數(shù)十種[5]，主要包括核受體輔激活蛋白4(Nuclear receptor coactivator 4，NCOA4)、花生四烯酸15-脂氧合酶(Arachidonate 15-Lipoxygenase，ALOX15)、Voltage-dependent anion-selective channel protein 2(VDAC2/3)、SLC7A11、SLC3A2、谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione peroxidase，GPX4)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin receptor，TFR)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin TF)及儲(chǔ)鐵蛋白(Ferrtin)等[6]。

2 鐵死亡的分子調(diào)控機(jī)制

2.1 鐵離子代謝

鐵元素是生物體必需的營養(yǎng)元素之一。通常細(xì)胞內(nèi)鐵的平衡性表現(xiàn)在鐵的吸收、輸出、利用和儲(chǔ)存之間的平衡。當(dāng)鐵死亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)積累大量的游離Fe2+。游離Fe2+氧化性極強(qiáng)，容易與H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng)(Fenton reaction)，產(chǎn)生能對DNA、蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì)造成氧化損傷的羥基自由基，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生損傷細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]。芬頓反應(yīng)式為Fe2++H2O2=Fe3++OH-+·HO。

已知鐵死亡發(fā)生時(shí)Fe2+的主要來源有2個(gè)：(1)攜帶Fe3+的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin, TF)與質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin receptor，TFR)結(jié)合后，質(zhì)膜形成囊泡將攜帶Fe3+的轉(zhuǎn)鐵蛋白攝入胞內(nèi)，隨后囊泡內(nèi)低pH促使Fe3+從轉(zhuǎn)鐵蛋白剝離，脫落的Fe3+被還原成Fe2+游離于胞質(zhì)中，或者與Ferritin結(jié)合形成鐵池(Iron pool)；(2)鐵池中的鐵蛋白可在核受體輔激活蛋白4(Nuclear receptor coactivator 4，NCOA4)的介導(dǎo)下被自噬溶酶體包裹，進(jìn)而降解、釋放出大量Fe2+(圖1)。

2.2 脂質(zhì)過氧化反應(yīng)

脂質(zhì)過氧化(Lipid peroxidation)是指脂質(zhì)在自由基或脂質(zhì)過氧化酶的作用下失去的氫原子，導(dǎo)致脂質(zhì)碳鏈的氧化、斷裂及縮短，并產(chǎn)生脂質(zhì)自由基、脂質(zhì)氫過氧化物和活性醛(丙二醛、4-羥基壬烯醛)等具有細(xì)胞毒性物質(zhì)，最終造成細(xì)胞損傷的脂質(zhì)氧化降解反應(yīng)[9]。在鐵死亡中，脂質(zhì)過氧化的危害主要體現(xiàn)在它導(dǎo)致了多聚不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamines PE)2種重要生物膜組分的氧化降解。

PUFA是細(xì)胞和細(xì)胞器膜磷脂的主要成分，也是合成磷脂雙分子層內(nèi)層主要成分PE的重要底物。磷脂雙分子層作為維持細(xì)胞膜流動(dòng)性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對維持細(xì)胞的正常生長、增殖、分化、衰老、死亡、免疫等具有重要功能。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)會(huì)改變PUFA的分子構(gòu)型，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的流動(dòng)性和穩(wěn)定性，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞容易破裂死亡。PUFA與自由基親和力高，其雙鍵之間的氫原子極易被自由基氧化。PUFA的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)大致分為2個(gè)階段。首先，羥基自由基和過氧化氫等活性氧類物質(zhì)獲取PUFA中的氫原子產(chǎn)生脂質(zhì)自由基(Lipid ROS，L-)；然后，脂質(zhì)自由基與氧分子作用生成脂質(zhì)過氧化自由基(Lipid peroxyl radicals，LOO-)。脂質(zhì)過氧化自由基從其他PUFA中奪取氫原子形成脂質(zhì)自由基和脂氫過氧化物(Lipid hydroperoxide，LOOH)。脂質(zhì)過氧化自由基能不停參與PUFAs的氧化過程，使得PUFAs的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)具有級聯(lián)式反應(yīng)特征。

PE是生物膜甘油磷脂，在線粒體內(nèi)膜中含量約占總磷脂的40%，在其他細(xì)胞器生物膜中約占總磷脂的15%～25%[10]。PE具有多種細(xì)胞功能，包括作為磷脂酰膽堿的前體和重要的翻譯后修飾的底物，影響膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞和細(xì)胞器膜融合、氧化磷酸化、線粒體生物生成和自噬等[11]。PE與自由基的親和力并不高，在發(fā)生脂質(zhì)過氧化之前需要在2種酶作用下形成氧化位點(diǎn)。首先，?；o酶a合成酶長鏈家族成員4(Long-chain acyl-CoA synthetase-4，ACSL4)利用花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)和腎上腺酸(adrenic acid，AdA)合成花生四烯酰-CoA(AA-CoA)和腎上腺酰-CoA(AdA-CoA)；然后，AA/AdA-CoA在溶磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3(Lysophosphatidylcholine Acyltransferase 3，LPCAT3)催化下與PE形成PE-AA/AdA[12]。PE-AA/AdA容易被自由基或花生四烯酸15-脂氧合酶(Arachidonate 15-Lipoxygenase，ALOX15)氧化為具有細(xì)胞毒性的脂氫過氧化物PE-AA/AdA-OOH促進(jìn)鐵死亡發(fā)生[12](圖1)。

圖1 鐵死亡的分子調(diào)控機(jī)制Figure 1 Mechanisms of ferroptosis

值得一提的是，Doll等[13]和Bersuker等[14]發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡誘導(dǎo)因子2(Apoptosis inducing factor mitochondria-associated 2，AIFM2)能與脂質(zhì)過氧化自由基清除劑——輔酶Q10(Coenzyme Q10，CoQ10)協(xié)同作用抑制細(xì)胞鐵死亡的作用，并將其更名為鐵死亡抑制蛋白1(Ferroptosis-suppressor-protein 1，F(xiàn)SP1)。

2.3 谷胱甘肽代謝

谷胱甘肽是一種水溶性三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸氨基酸殘基組成。人體中的谷胱甘肽有2種型態(tài)，一種是還原型谷胱甘肽(GSH)，另一種是氧化型谷胱甘肽(GSSG)。還原性谷胱甘肽是人機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑，不僅將H2O2還原成H2O，清除自由基，維持胞內(nèi)自由基含量的平衡狀態(tài)，還作為谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione peroxidase，GPX4)的輔因子參與過氧化脂質(zhì)LOOH的還原反應(yīng)，修復(fù)生物膜中的LOOH，防止鐵死亡的發(fā)生。谷胱甘肽的耗竭會(huì)導(dǎo)致GPX4失活，增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用，從而導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生。GPX4是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗脂質(zhì)過氧化酶，亦是鐵死亡的核心調(diào)控因子。GSH作為GPX4的輔因子，可與GPX4協(xié)同發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用，促使細(xì)胞膜上的脂質(zhì)過氧化物發(fā)生還原反應(yīng)，遏制鐵死亡的發(fā)生。因此，谷胱甘肽耗竭，GPX4酶活被抑制，是細(xì)胞執(zhí)行鐵死亡的必要條件。

細(xì)胞主要通過合成谷胱甘肽來維持胞內(nèi)谷胱甘肽水平。谷胱甘肽的合成過程主要分為2步(圖1)：第1步，細(xì)胞按照1∶1的攝入比例通過System Xc-從胞外攝入半胱氨酸和谷氨酸，半胱氨酸和谷氨酸在依賴于ATP的半胱氨酸-谷氨酸連接酶(Gglutamate-cysteine ligase，GCL)作用下形成γ-谷氨酰半胱氨酸；第2步，γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)谷胱甘肽合成酶(Glutathione synthetase，GSS)催化生成谷胱甘肽。谷胱甘肽的合成效率主要受限于半胱氨酸的濃度。

溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC3A2)和溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC7A11)組成了半胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)(System Xc-)。當(dāng)System Xc-亞基活性被抑制時(shí)，細(xì)胞對半胱氨酸的攝入量不足，進(jìn)而阻斷了谷胱甘肽的合成，致使被H2O2和過氧化脂質(zhì)迅速消耗的谷胱甘肽無法得到補(bǔ)充；同時(shí)，胞內(nèi)谷胱甘肽濃度下降會(huì)抑制GPX4的活性，導(dǎo)致細(xì)胞抗脂質(zhì)過氧化能力驟降，細(xì)胞極易發(fā)生鐵死亡。高明輝等[15]研究證實(shí)，細(xì)胞處于半胱氨酸饑餓狀態(tài)時(shí)，清除線粒體或者抑制線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈(Electron transfer chain，ETC)可減弱鐵死亡的發(fā)生。

3 鐵死亡的調(diào)節(jié)劑

3.1 鐵死亡的激活劑

依據(jù)鐵死亡激活劑的作用靶點(diǎn)，大致可以將其分為3類。第1類是System Xc-抑制劑，例如Erastin和Sorafenib等。Erastin是鐵死亡強(qiáng)效激活劑，一方面它通過System Xc-阻斷細(xì)胞對半胱氨酸的攝入，造成谷胱甘肽(Glutathione，GSH)耗竭，降低GPX4活性，進(jìn)而減弱細(xì)胞抗脂質(zhì)氧化能力[1-2]；另一方面它與線粒體電壓依賴陰離子通道蛋白(Voltage-dependent anion-selective channel protein 2，VDAC2/3)結(jié)合并抑制其活性，導(dǎo)致線粒體功能障礙并釋放大量的自由基，增強(qiáng)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[16]。Sorafenib則是一種廣譜激動(dòng)劑，除了誘導(dǎo)鐵死亡之外，還可引起細(xì)胞自噬和凋亡[17]。第2類是GPX4抑制劑，例如RSL3和FIN56等。RSL3可與GPX4結(jié)合并抑制其蛋白活性，導(dǎo)致胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物積累過量[18]。FIN56是一種特異性較強(qiáng)的鐵死亡誘導(dǎo)劑，可降低胞內(nèi)GPX4和CoQ10蛋白豐度來激活鐵死亡[19]。RSL3和FIN56都可直接作用于抗脂質(zhì)過氧化核心細(xì)胞因子GPX4。第3類是GSH消耗劑，例如半胱氨酸酶(Cysteinase)、BSO和順鉑(Cisplatin)等。Cysteinase可直接降解半胱氨酸，阻斷GSH的合成[20]。BSO抑制谷氨酸半胱氨酸連接酶的活性，導(dǎo)致胞內(nèi)無法產(chǎn)生足量的GSH合成前體——甘氨酸[21]。順鉑是一線廣譜抗癌藥物，其主要副作用之一是增加機(jī)體內(nèi)ROS水平消耗GSH，具有腎毒性[22]。

此外，有些激活劑可以通過誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)或者增加胞內(nèi)游離鐵離子水平來觸發(fā)鐵死亡。如iFSP1可在過表達(dá)FSP1的GPX4基因缺失細(xì)胞系中抑制FSP1活性并促進(jìn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對細(xì)胞造成損傷[13]。枸櫞酸鐵銨通過上調(diào)胞內(nèi)游離鐵離子水平，來強(qiáng)化芬頓反應(yīng)產(chǎn)生過量的自由基[23]。

3.2 鐵死亡的抑制劑

鑒于鐵死亡的發(fā)生依賴鐵離子的代謝紊亂，以及脂質(zhì)或谷胱甘肽的過氧化反應(yīng)，所以大部分鐵死亡抑制劑屬于鐵螯合劑或抗氧化劑。鐵螯合劑的主要作用是清除游離的鐵離子。甲磺酸去鐵胺(Deferoxamine mesylate，DFO)是臨床上使用最多的鐵離子螯合劑之一，可與游離鐵離子結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而削弱芬頓反應(yīng)，常被用于治療慢性鐵過載相關(guān)疾病[24]。鐵死亡抗氧化劑能夠清除羥基自由基或脂質(zhì)自由基。最經(jīng)典的自由基清除劑為他汀類藥物和利普生司他汀類藥物。初代他汀類藥物Ferrostatin是目前使用最廣泛的鐵死亡強(qiáng)效抑制劑，可以阻止Erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS和脂質(zhì)ROS的積累[2]。利普生司他汀類藥物L(fēng)iproxstatin含有酰胺類和磺胺類亞基，在機(jī)體內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性和藥物吸收分布[25]。尚未發(fā)現(xiàn)Liproxstatin除了抑制鐵死亡之外能否影響其他細(xì)胞死亡方式[26]。

脂質(zhì)過氧化酶抑制劑也具有抑制鐵死亡的作用。例如脂溶性抗氧化劑維生素E(Vitamin E)，不但可以抑制LOX活性，而且其O-H鍵較弱容易向過氧自由基和其他自由基輸送氫原子，保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡氧化損傷[27]。哮喘藥齊留通(Zileuton)可抑制LOX-5水平，可通過減弱PE的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)降低鐵死亡的發(fā)生[28]。

4 鐵死亡與疾病的關(guān)系

4.1 癌癥(Cancer)

癌癥是一類幾乎可以發(fā)生在人體的任何器官或組織中，并且容易侵襲擴(kuò)散至臨近組織器官的疾病，被世界衛(wèi)生組織列為人類第二大死亡病因[29]，給全球患者和醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)造成了巨大傷害和損失。促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡一直是研發(fā)抗癌藥物的重點(diǎn)方向，然而癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗凋亡能力，使得這類抗癌藥物在實(shí)際應(yīng)用中療效有所弱化。

近年來，在大腸癌[30]、胃癌[31]、胰腺癌[32]、肺癌[33]和三陰性乳腺癌[34]等癌癥研究中，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡或者鐵死亡激活劑與抗腫瘤藥物聯(lián)合作用時(shí)利于對腫瘤的干預(yù)、抑制和清除[30-32]。

4.2 神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative disease)

神經(jīng)退行性疾病是一類因神經(jīng)元結(jié)構(gòu)或功能逐漸退化導(dǎo)致的疾病。神經(jīng)元是大腦和脊髓的基本組成單位，它的病變會(huì)給大腦和脊髓造成不可逆的損傷，影響人體運(yùn)動(dòng)或記憶功能。在大腦的老化過程中，黑質(zhì)部、球狀核、尾狀核、皮層等腦部區(qū)域會(huì)出現(xiàn)進(jìn)行性的鐵沉積，而這些大腦區(qū)域與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[35]。阿爾茨海默病(AD)是最常見的認(rèn)知功能障礙神經(jīng)退行性疾病，其重要病理特征之一是脂質(zhì)過氧化物的積累、鐵離子穩(wěn)態(tài)失衡[36]及海馬體嚴(yán)重受損[37]。研究發(fā)現(xiàn)，缺失GPX4基因的小鼠同時(shí)具有鐵死亡生化特征和AD表征，并且該小鼠模型的AD表征可以被鐵死亡抑制劑緩解[37]。神經(jīng)元發(fā)生病變死亡，其病變神經(jīng)元中顯示鐵水平激增[38]和抗氧化劑GSH耗竭[39]。臨床研究表明，鐵螯合劑可以通過降低患者體內(nèi)的鐵含量來緩解早期PD患者的運(yùn)動(dòng)癥狀，從而減輕患者的運(yùn)動(dòng)癥狀[40]。

4.3 缺血再灌注損傷(Ischemia/reperfusion injury)

缺血再灌注損傷是指缺血的組織或器官經(jīng)血液灌注后發(fā)生結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙的癥狀。鐵死亡在缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[41]。目前，多種鐵死亡相關(guān)治療劑已被用于治療缺血再灌注引起的腸道損傷[42]和橫紋肌溶解癥(Rhabdomyolysis)[43]等疾病。鐵死亡抑制劑 Liproxstatin可改善缺血/再灌注所致小鼠肝損傷[44]。

4.4 急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)

急性腎損傷患者常常會(huì)伴隨突然的腎臟功能喪失，通常作為急性腎損傷的并發(fā)癥而發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致患者死亡。研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡抑制劑在AKI模型中具有良好的腎臟保護(hù)效果[45-46]。

5 小結(jié)

鐵死亡作為一種由鐵離子、自由基及脂質(zhì)過氧化物介導(dǎo)的非凋亡性程序性細(xì)胞死亡方式，它的起始和執(zhí)行都是在嚴(yán)格的分子調(diào)控機(jī)制下進(jìn)行。盡管已有許多研究成果證實(shí)了鐵死亡與多種疾病具有密切的關(guān)系，但是鐵死亡在人類疾病中的功能研究尚處于起步階段。鐵死亡如何促進(jìn)炎癥的發(fā)展？鐵死亡與免疫應(yīng)答是否存在關(guān)聯(lián)？仍有許多未知問題有待解答。深入研究鐵死亡在人類疾病中的作用，對尋求更有效的疾病干預(yù)和治療藥物具有深遠(yuǎn)意義。