混合菌群協(xié)同降解孔雀石綠及其產(chǎn)物分析

郝至純，石先陽

(安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院 濕地生態(tài)保護與修復(fù)安徽省重點實驗室，合肥 230601)

孔雀石綠(Malachite green)是一種廣泛應(yīng)用于木、絲、革等行業(yè)的三苯甲烷類染料。因采用孔雀石綠進行消毒操作方便，成本低，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的使用較普遍[1]。另一方面，孔雀石綠具有高殘留和“三致”效應(yīng)[2]，需對含孔雀石綠廢水進行處理，以避免其對自然環(huán)境和生物造成嚴重和不可逆轉(zhuǎn)的影響。物理化學(xué)法處理染料易導(dǎo)致二次污染，而生物處理法具有極好的環(huán)境兼容性且成本低。利用微生物對有毒染料廢水進行無害化處理，是減輕其毒性的一種有效方法[3]。通過微生物的馴化和培養(yǎng)，篩選出對染料廢水具有高效脫色性能的菌株。

混合微生物種群處理系統(tǒng)較純菌株處理系統(tǒng)能更有效地降解污染物[4]，不同菌株在混合培養(yǎng)中的互補作用可提高其降解效率且混合菌可利用基質(zhì)范圍更廣[5]。研究表明混合菌群對污染物的處理性能取決于系統(tǒng)中細菌菌群的多樣性[6]。各菌株作用于染料分子的不同部分和基團時，有些菌株之間可形成共代謝機制[7]。如Pseudomonasaeruginosa、Ochrobactrumsp.和Providenciavermicola構(gòu)成的混合菌群處理印染廢水，16 h內(nèi)COD去除率達95%[8]。中等嗜堿菌群分別處理含200 mg/L直接藍151、直接紅31的染料廢水，5 d內(nèi)脫色率分別為97.57%和95.25%[9]。另有研究證實混合菌群對本澤馬黃S8-G、諾威克隆艷藍FN-R和諾威克隆超級黑G的脫色率分別為65%、90%和90%[10]。然而混合菌群降解孔雀石綠的研究鮮見報道。

為實現(xiàn)孔雀石綠的降解，本研究通過分離高效微生物菌株，構(gòu)建一組具有高效降解性能的混合菌群，協(xié)同降解孔雀石綠，考察不同因素對孔雀石綠脫色的影響，基于對降解產(chǎn)物的分析探討混合菌群對孔雀石綠的降解機制，以期為混合菌群應(yīng)用于實際染料廢水的處理提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 污泥

污泥取自一個實驗室運行的序批式間歇反應(yīng)器。

1.1.2 培養(yǎng)基

無機鹽培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1.5，硫酸銨0.5，氯化鈉1.0，磷酸二氫鉀2.65，十二水合磷酸氫二鈉4.26，七水合硫酸鎂0.2；液體LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10；固體LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂15～20。

1.1.3 染料

三苯甲烷類染料——孔雀石綠，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，其相對分子質(zhì)量為364.92。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與鑒定

取適量污泥接種于含50 mg/L孔雀石綠的LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)。待液體培養(yǎng)基完全脫色后，取脫色液稀釋成10-5～10-7后涂布于含50 mg/L孔雀石綠的固體LB平板上，于30 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，挑取顏色較淺、形態(tài)不一的單菌落進行3～5輪的分離純化后保藏。篩選出兩株對孔雀石綠具有較強脫色能力的菌株，分別命名為JY-11和HCS77。使用SK8255試劑盒(上海生工)從細菌中提取基因組DNA，采用通用引物27F(AGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)對細菌的16S rDNA序列進行PCR擴增，產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序；再與NCBI的數(shù)據(jù)庫進行同源性的比較，通過MAGE 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 脫色實驗

用無菌牙簽挑取JY-11和HCS77(30 ℃固體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d)單菌落，分別接種至0.5 mL液體LB培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)8 h。待渾濁后，分別轉(zhuǎn)至100 mL液體LB培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)16 h。取OD600=0.5的J-H混合菌液(將JY-11和HCS77按濃度比1∶1進行混合，構(gòu)建出J-H混合菌群)接種至50 mL無機鹽培養(yǎng)基中，以JY-11、HCS77單菌和J-H死菌(95 ℃水浴滅活20 min)為對照，投加染料進行脫色實驗。研究供氧條件(好氧、厭氧均設(shè)為150 r/min條件下反應(yīng)，兼氧設(shè)為靜置反應(yīng))、染料濃度(25、50、100、150和200 mg/L)、pH(5、6、7、8、9和10)及溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃)對孔雀石綠脫色率的影響。

1.2.3 脫色率測定與紫外-可見吸收光譜分析

取50 mg/L孔雀石綠溶解液、1 h和6 h的降解上清液(12 000 r/min離心3 min)，用紫外分光光度計在190～800 nm范圍內(nèi)進行全波長掃描。再用紫外分光光度計測得反應(yīng)液在617 nm波長處吸光度的下降情況[11]。按以下公式計算:

Dr= (C0-Ct) /C0× 100%

其中，C0為原染料濃度，Ct為剩余染料濃度，Dr為脫色率。

1.2.4 降解產(chǎn)物分析

收集50 mg/L孔雀石綠原液、6 h和12 h的混合培養(yǎng)物，并在12 000 r/min下離心10 min，取上清液。用50 mL的三氯甲烷(sigma)萃取3次，合并萃取液，加入無水硫酸鈉脫水，旋干，溶解在1 mL的甲醇(sigma)中，用TSQ8000EVO三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo Fisher Scientific)進行GC-MS分析。柱溫設(shè)定為從50 ℃升溫至320 ℃(30 ℃/min)，9 min內(nèi)升至320 ℃。載氣(甲烷)流速為1.0 mL/min，分流比10∶1，離子源為EI，離子源溫度280 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效脫色菌株的篩選及鑒定

從污泥中篩選了對孔雀石綠具有較強脫色能力的高效菌株JY-11和HCS77，其相關(guān)序列提交GenBank，登錄號分別為MK813903和MK813372。通過Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，經(jīng)MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果顯示菌株JY-11的l6S rDNA序列與Pseudomonasaeruginosastrain PA06 MN326719.1的距離最近，同源性為99%，確定菌株JY-11為銅綠假單胞菌，菌株HCS77的l6S rDNA序列與Bacilluscereusstrain HVR22 JQ739719.1同源性為99%，確定菌株HCS77為蠟質(zhì)芽孢桿菌。

圖1 基于l6S rDNA序列構(gòu)建的銅綠假單胞菌JY-11 (a)和蠟質(zhì)芽孢桿菌HCS77(b)的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic trees of Pseudomonas aeruginosa JY-11 (a) and Bacillus cereus strain HCS77 (b) based on a comparative analysis of 16S rDNA sequence

2.2 混合菌群降解孔雀石綠及動力學(xué)分析

在兼氧、pH 7.0、30 ℃條件下，考察2株單菌(銅綠假單胞菌JY-11和蠟樣芽胞桿株單菌HCS77)與J-H混合菌群(活菌和死菌)對孔雀石綠(50 mg/L)的脫色效果。圖2顯示J-H混合菌群較單菌對孔雀石綠具有更高的降解效率，在4 h時對孔雀石綠的脫色率近乎100%，而單菌JY-11和HCS77僅為3.67%和73.09%，且該混合菌群完全脫色時間較單菌快5倍。據(jù)報道，利用一株新分離的真菌Lasiodiplodiasp.在最優(yōu)條件下降解孔雀石綠(50 mg/L)，需反應(yīng)24 h才能達到96.9%的脫色率[12]。利用BacilluscereusKM201428處理含3.65 mg/L孔雀石綠的廢水，需培養(yǎng)12 h才能到達脫色終點[13]。由此可見J-H混合菌群對孔雀石綠的脫色能力明顯優(yōu)于單菌及其他脫色菌株，這表明混合培養(yǎng)的微生物間存在協(xié)同代謝作用[14-15]。4 h時混合菌群的死菌吸附對孔雀石綠的脫色率僅為13.9%，此后44 h內(nèi)維持不變，證實混合菌群對染料脫色主要經(jīng)微生物降解。

圖2 混合菌群(活菌和死菌)與純菌株的脫色對比Figure 2 Comparison of decolorization between mixed bacteria (living bacteria and dead bacteria) and pure strains

在兼性好氧、pH 7.0、30 ℃和染料濃度為50 mg/L條件下，計算0、0.5、1、1.5、2和4 h時，混合菌群對孔雀石綠的降解速率，對J-H混合菌群降解孔雀石綠的動力學(xué)過程進行分析表明，J-H混合菌群對孔雀石綠脫色的動力學(xué)與二級動力學(xué)擬合度最高(R2=0.925 8)，與一級動力學(xué)擬合度較低(R2=0.785 7)。因此，J-H混合菌群對孔雀石綠的脫色過程符合二級動力學(xué)過程(圖3)，其特征可用二級模型來進行解釋。

圖3 J-H混合菌群對孔雀石綠脫色的動力學(xué)分析Figure 3 Kinetic analysis of malachite green decolorization by J-H mixed flora

2.3 不同因素對混合菌群降解孔雀石綠的影響

在pH 7.0、30 ℃和染料濃度為50 mg/L條件下，研究J-H混合菌群在好氧、兼氧和厭氧條件下對孔雀石綠的脫色能力。結(jié)果表明：在好氧、兼氧條件下，J-H混合菌群對孔雀石綠的脫色效果好，兼氧條件下4 h脫色率達99.54%，而厭氧條件下脫色率僅為有氧條件下脫色率的一半[圖4(a)]。這是由于銅綠假單胞菌與蠟質(zhì)芽孢桿菌均為需氧菌，在嚴格厭氧條件下無法正常生長導(dǎo)致脫色能力不佳。

不同濃度的孔雀石綠對J-H混合菌群降解的影響見圖4(b)。結(jié)果表明，當(dāng)孔雀石綠濃度為25 mg/L時，J-H混合菌群2 h內(nèi)即脫色完成，其脫色時間僅為混合菌群對50 mg/L孔雀石綠完全脫色時間的一半。而當(dāng)孔雀石綠濃度為100、150和200 mg/L時，12 h脫色率為91.04%、41.83%和34.84%。J-H混合菌群的脫色能力與染料濃度呈反比關(guān)系，這一結(jié)果與幾種微生物如Photobacteriumleiognathistrain MS[16]和Cedeceadavisae[17]對孔雀石綠的脫色結(jié)果頗有相似之處。染料濃度愈高，其毒性愈強，從而抑制脫色菌株的生長、產(chǎn)酶或阻塞酶的活性位點，進而影響微生物菌群對染料的脫色[12,18]。

圖4(c)顯示孔雀石綠濃度為50 mg/L時，不同pH值對J-H混合菌群脫色的影響；pH值為5～8的范圍內(nèi)脫色效果較好，2 h脫色率在90%以上，pH值為6時脫色效果最佳，2 h內(nèi)完全脫色；pH值為9～10時，12 h內(nèi)脫色率仍在75%以上。這些結(jié)果證實J-H混合菌群具有較強酸堿適應(yīng)性，能在較寬的pH值在5～10范圍內(nèi)降解孔雀石綠。JY-11和HCS77純菌株對孔雀石綠的最適脫色pH值范圍分別為6～8和5～7。與純菌株相比，J-H混合菌群對印染廢水的pH值耐受性會更大。

混合菌群在20 ℃～40 ℃范圍內(nèi)對50 mg/L孔雀石綠的脫色效率[圖4(d)]表明，環(huán)境溫度為30 ℃時，J-H混合菌群對孔雀石綠的脫色效果最優(yōu)，2 h脫色率可達99.53%。當(dāng)溫度低于或高于30 ℃時(20 ℃～40 ℃)，脫色率均有降低，但12 h內(nèi)脫色率仍在95%以上。不同菌種對孔雀石綠的最適脫色溫度有差異。JY-11純菌株對孔雀石綠脫色的最佳溫度在30 ℃～40 ℃范圍內(nèi)，HCS77純菌株對孔雀石綠脫色的最佳溫度在20 ℃～35 ℃范圍內(nèi)。

圖4 供氧條件(a)、染料濃度(b)、pH(c)和溫度(d)對脫色率的影響Figure 4 Effects of oxygen supply (a), dye concentration (b), pH (c) and temperature (d) on decolorization rate

2.4 混合菌群降解孔雀石綠的產(chǎn)物分析及降解機理

已有研究表明，不同種類細菌對孔雀石綠脫色途徑相似[1]。脫色前，孔雀石綠全波長掃描光譜在618 nm處有一個特征主峰，在316 nm、422 nm處有兩個較小的峰(圖5)，其中618 nm處的特征主峰在脫色后逐漸消失，而316 nm、422 nm處的特征吸收峰則顯著降低，且脫色后有2個新的吸收峰產(chǎn)生(250 nm和369 nm)。說明染料的共軛結(jié)構(gòu)被完全破壞[20]。有研究證實若為細胞吸附下的脫色，則所有吸收峰均成比例地降低，若為生物降解下的脫色，則吸收峰會逐漸消失并產(chǎn)生新峰，即發(fā)色基團被降解并出現(xiàn)新的產(chǎn)物[19-20]。由此表明 J-H混合菌群對孔雀石綠的脫色是生物降解的結(jié)果。

圖5 降解前后孔雀石綠的全波長掃描圖譜Figure 5 UV-visible spectrum of malachite green before and after degradation

如圖6和圖7所示，孔雀石綠原液于10.39 min時出峰，其分子離子峰對應(yīng)的質(zhì)荷比為330。經(jīng)過12 h脫色，10.39 min時的色譜峰基本消失，同時產(chǎn)生2個新的色譜峰，出峰時間分別為8.90 min(質(zhì)荷比為225)和12.67 min(質(zhì)荷比為136)。通過與GS/MS數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準物進行比對，證實新產(chǎn)生的2種產(chǎn)物分別為4-(二甲氨基)二苯甲酮和4-(二甲氨基)苯酚。這一結(jié)果與Micrococcussp. strain BD1[21]、Shewanelladecolorationis. NTOUl[22]和Burkholderiacepacoa[23]降解孔雀石綠的產(chǎn)物基本一致。

圖6 降解前(a)和降解后(b)的孔雀石綠GC-MS色譜圖Figure 6 Chromatography in GC-MS of malachite green before (a) and after (b) degradation

圖7 無色孔雀石綠(a)、孔雀石綠降解產(chǎn)物4-(二甲氨基) 二苯甲酮(b)和4-(二甲氨基)苯酚(c)的質(zhì)譜圖Figure 7 Mass spectrogram of leucomalachite green (a), malachite green degradation product 4-(dimethylamino) benzophenone (b) and 4-(dimethylamino) phenol (c)

根據(jù)孔雀石綠降解產(chǎn)物的分析，推測J-H混合菌群對孔雀石綠的降解途徑(圖8)：孔雀石綠(MG)先經(jīng)加氫反應(yīng)轉(zhuǎn)化為無色孔雀石綠(LMG)，然后孔雀石綠中心碳發(fā)生羥基化反應(yīng)，隨后該位置迅速發(fā)生碳-碳鍵斷裂，產(chǎn)生兩種新的產(chǎn)物，即 4-(二甲氨基) 二苯甲酮和4-(二甲氨基)苯酚。

圖8 J-H混合菌群降解孔雀石綠的可能降解途徑Figure 8 The possible degradation pathway of malachite green by J-H mixed flora

混合菌群對有機污染物的高效降解，主要是通過微生物間互利共生、酶系互補[24]。單一菌株酶種類不全或酶量配比不協(xié)調(diào)，因此，多菌種混合培養(yǎng)彌補了單一菌株這方面的缺陷，從而提高對有機物的降解能力。

3 討論

據(jù)目前的研究報道，微生物法對有色廢水中孔雀石綠的去除頗有成效。Du等[25]發(fā)現(xiàn)Pseudomonassp. strain DY1在反應(yīng)24 h時對100 mg/L孔雀石綠的脫色率可達90.3%。Deng等[26]研究發(fā)現(xiàn)將一株新分離的Bacilluscereusstrain DC11用于降解孔雀石綠(20 mg/L)，在4 h時即可達到95%的脫色率。但將共培養(yǎng)微生物應(yīng)用于孔雀石綠的降解并沒有相關(guān)的研究報道。

在本研究中利用由銅綠假單胞菌JY-11和蠟樣芽胞桿菌HCS77構(gòu)成的J-H混合菌群在最優(yōu)條件下對50 mg/L孔雀石綠進行降解，2 h內(nèi)即實現(xiàn)完全脫色。該混合菌群不僅具強降解能力，對嚴苛的環(huán)境條件也有較好的適應(yīng)性，在工業(yè)廢水處理上具有廣闊的應(yīng)用前景。后續(xù)將往實驗室運行的序批式反應(yīng)器中外加高效混合菌群，探究其對廢水生物處理系統(tǒng)的強化作用，以期實現(xiàn)該高效混合菌群在工業(yè)實踐上的應(yīng)用。

4 結(jié)論

(1)從污泥中分離篩選出的兩株對孔雀石綠具有較強脫色能力的高效菌株分別命名為銅綠假單胞菌JY-11和蠟樣芽胞桿菌HCS77，兩者按比例混合成為J-H混合菌群。(2)J-H混合菌群對孔雀石綠脫色效果優(yōu)于單菌，反應(yīng)4 h脫色率接近100%，符合二級反應(yīng)動力學(xué)過程。(3)不同因素對J-H混合菌群脫色孔雀石綠的影響結(jié)果表明，兼氧和好氧條件、低染料濃度均有利于孔雀石綠的脫色；且該混合菌群對pH和溫度的適應(yīng)能力較強。在最優(yōu)條件下，2 h內(nèi)J-H混合菌群對孔雀石綠脫色完全。(4)J-H混合菌群降解孔雀石綠的主要產(chǎn)物為4-(二甲氨基)二苯甲酮和4-(二甲氨基)苯酚。