食管癌組織lncRNA PCAT-1、ANXA10表達變化及其臨床意義

蒲高祥，姚陽

遂寧市中心醫(yī)院腫瘤科，四川遂寧629000

食管癌是一種原發(fā)于食管上皮細胞的惡性腫瘤，在我國具有較高的發(fā)病率和病死率［1］。食管癌的發(fā)生與癌基因激活和抑癌基因失活密切相關(guān)，但其確切的發(fā)病機制尚不完全清楚。因此，探索食管癌發(fā)病的分子機制，對其早期診斷和靶向治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，能夠參與細胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程。前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（PCAT-1）是lncRNA家族成員之一，定位于人染色體8q24上，能夠參與染色體重構(gòu)、脂質(zhì)代謝及細胞有絲分裂等過程，還能促進腫瘤細胞增殖和侵襲［2］。有研究發(fā)現(xiàn)，PCAT-1通過結(jié)合其靶基因PRC2阻礙抑癌基因BRCA2表達，從而使DNA修復(fù)和基因重組能力減弱，最終導(dǎo)致前列腺癌的發(fā)生風(fēng)險增加［3］。由此推測，PCAT-1在前列腺癌的發(fā)病過程中可能起原癌基因作用。膜聯(lián)蛋白A10（ANXA10）屬于Ca2+依賴磷脂結(jié)合蛋白，定位于人染色體4q33上，在免疫抑制、細胞增殖、抑制蛋白激酶活性等方面具有重要作用［4］。有研究報道，肝癌細胞ANXA10表達降低，且其表達與甲胎蛋白水平上調(diào)、p53基因突變以及肝癌復(fù)發(fā)有關(guān)［5］，提示ANXA10在抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有抑癌基因作用。但目前l(fā)ncRNA PCAT-1、ANXA10表達與食管癌的關(guān)系報道較少。2016年5月—2017年10月，本研究觀察了食管癌組織lncRNA PCAT-1、ANXA10表達變化，并探討其表達與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期遂寧市中心醫(yī)院收治的食管癌患者87例。納入標準：①符合食管癌診斷標準［6］，并經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷；②初診；③年齡≥18歲；④具備食管癌根治手術(shù)指征；⑤既往無放化療史或食管手術(shù)史。排除標準：①合并Barrett食管炎或反流性食管炎者；②伴有其他部位原發(fā)性惡性腫瘤者；③肝腎功能失代償者；④先天性免疫功能異常者。其中，男60例、女27例，年齡42～70（58.21±7.33）歲，酗酒52例；腫 瘤直徑：>3 cm 33例，≤3 cm 54例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期76例，Ⅲ期11例；組織分化程度：低分化8例，中分化38例，高分化41例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移80例。本研究經(jīng)遂寧市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準（審批文號：2016-0124），患者或其家屬知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 lncRNA PCAT-1、ANXA10表達檢測 采用實時熒光定量PCR技術(shù)。收集術(shù)中新鮮獲取的食管癌組織及癌旁組織（距腫瘤組織邊緣≥5 cm，經(jīng)組織病理檢查證實為正常食管組織），液氮速凍后轉(zhuǎn)運至-80℃冰箱保存，待組織成批。取部分食管癌組織與癌旁正常組織，液氮下充分研磨，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按PrimeScript RT Reagent Kit說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：42℃60 min，70℃5 min。以cDNA為模板，按SYBR Green PCR Master Mix Kit說明進行PCR擴增。所有引物序列由北京天根生化科技有限公司設(shè)計合成。引物序列：lncRNA PCAT-1上游引物5′-TTGTGGAAGCCCCGCAAGGCCTGAA-3′、下游引物5′-TGTGGGGCCTGCACTGGCACTT-3′，內(nèi)參GAPDH上 游 引 物5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′、下 游 引 物5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′；ANXA10上游引物5′-GAGCAGCTTTCGGATCACTT-3′、下游引物5′-TCATCAGTGCCTACTCCCTTC-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CCTCTGACTTCAACAGC?GACAC-3′、下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTG?TA-3′。PCR擴增體系共20μL：2×SYBR Master Mix 10μL，cDNA模板2μL，上下游引物各0.4μL，dH2O 7.2μL；反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃5 s、60℃20 s、72℃15 s共40個循環(huán)。擴增反應(yīng)結(jié)束后進行熔解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者出院后以電話或門診復(fù)查形式定期隨訪，隨訪截至2020年10月30日，統(tǒng)計患者3年總體生存率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗符合正態(tài)分布，以±s表示，結(jié)果比較采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-Rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織與癌旁正常組織lncRNA PCAT-1、ANXA10表達比較 食管癌組織lncRNA PCAT-1相對表達量為3.64±1.31，癌旁正常組織為1.22±0.56，食管癌組織lncRNA PCAT-1相對表達量高于癌旁正常組織（t=15.844，P<0.05）；食管癌組織ANXA10相對表達量為0.61±0.23，癌旁正常組織為1.95±0.74，食管癌組織ANXA10相對表達量低于癌旁正常組織（t=16.129，P<0.05）。

2.2 食管癌組織lncRNA PCAT-1、ANXA10表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 食管癌組織lncRNA PCAT-1、ANXA10相對表達量與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 食管癌組織lncRNA PCAT-1表達與ANXA10表達的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，食管癌組織lncRNA PCAT-1表達與ANXA10表達呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.757，P<0.05）。

2.4 食管癌組織lncRNA PCAT-1、ANXA10表達與患者預(yù)后的關(guān)系 至隨訪截至日期，共隨訪1～36個月，隨訪期間死亡37例，無失訪病例。以食管癌組織lncRNA PCAT-1相對表達量的中位數(shù)（3.63）為臨界值，將患者分為lncRNA PCAT-1高表達者（≥3.63，43例）、lncRNA PCAT-1低表達者（<3.63，44例），lncRNA PCAT-1高表達者3年總體生存率為37.21%（16/43），lncRNA PCAT-1低 表 達 者 為59.09%（26/44），lncRNA PCAT-1高表達者3年總體生存率低于lncRNA PCAT-1低表達者（χ2=4.167，P<0.05）。以食管癌組織ANXA10相對表達量的中位數(shù)（0.62）為臨界值，將患者分為ANXA10高表達者（≥0.62，41例）、ANXA10低表達者（<0.62，46例），ANXA10高表達者3年總體生存率為60.98%（25/41），ANXA10低表達者為36.96%（17/46），ANXA10高表達者3年總體生存率高于ANXA10低表達者（χ2=5.696，P<0.05）。見圖1、2。

圖1 食管癌組織不同lncRNA PCAT-1表達者生存曲線

圖2 食管癌組織不同ANXA10表達者生存曲線

3 討論

我國是世界上食管癌的高發(fā)國家之一，每年因食管癌死亡約15萬例，并且男性死亡例數(shù)約為女性的2倍［1］。有研究報道，食管癌發(fā)生的本質(zhì)是細胞基因組改變，特別是一些癌基因和抑癌基因改變［7-8］。近年來，隨著基因測序技術(shù)不斷成熟，人們逐漸發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾、lncRNA、DNA拷貝數(shù)改變以及DNA甲基化等能夠參與腫瘤細胞的分化和凋亡，影響腫瘤微環(huán)境，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色［9］。但食管癌發(fā)病的確切分子機制仍不完全清楚。

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，由于缺乏有效的開放閱讀框，不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，過去被認為是轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物。近年隨著人們對lncRNA認識的逐步深入，發(fā)現(xiàn)lncRNA能夠通過調(diào)控染色質(zhì)重構(gòu)、磷酸化以及miRNA降解等生物學(xué)過程，參與細胞增殖、分化、凋亡等生命活動［8］。lncRNA PCAT-1屬于Mariner轉(zhuǎn)座子家族，與前列腺癌風(fēng)險相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點毗鄰，能夠以競爭性結(jié)合miRNA的方式調(diào)節(jié)靶基因表達［10］。有研究表明，miR-218能夠通過與lncRNA PCAT-1結(jié)合，抑制lncRNA PCAT-1表達，從而使結(jié)合物蛋白基因沉默，繼而使肝癌細胞增殖速度降低［11］，結(jié)果提示lncRNA PCAT-1在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中可能具有促癌基因作用。藥物試驗表明，食管癌組織lncRNA PCAT-1基因沉默后腫瘤細胞增殖能力明顯減弱，同時其對順鉑的耐藥性明顯降低［12］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管癌組織lncRNA PCAT-1高表達，并且其表達與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示lncRNA PCAT-1可能參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展，其機制可能為食管癌組織原癌基因c-Myc表達上調(diào)，而c-Myc是lncRNA PCAT-1的上游基因，能夠結(jié)合lncRNA PCAT-1的Alu序列，使其啟動子激活，從而使lncRNA PCAT-1表 達 上 調(diào)［10］。有 研 究 亦 發(fā) 現(xiàn)，lncRNA PCAT-1表達上調(diào)能夠激活Cyclin B、Cyclin E、Cyclin D1等細胞周期蛋白，使G0/G1期腫瘤細胞數(shù)量降低，而S期腫瘤細胞數(shù)量增加，加速細胞周期循環(huán)，從而導(dǎo)致腫瘤細胞分裂和分化能力增強［13-14］。此外，lncRNA PCAT-1高表達還能促進基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9表達，使Snial基因活化，從而促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使腫瘤細胞易于侵襲和遷移［12］。

ANXA10屬于Annexins家族成員，其C末端能夠結(jié)合Ca2+和磷脂形成空間三級結(jié)構(gòu)，而N末端在與其他蛋白結(jié)合后能夠決定其相應(yīng)的生物學(xué)功能［4］。Annexins家族是重要的膜功能蛋白，在胞吞、胞吐、Ca2+信號傳導(dǎo)、抗凝、細胞分裂和分化、血管生成以及免疫抑制等方面具有重要的調(diào)控作用［15-16］。有研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)ANXA10表達能夠抑制肝癌細胞增殖和分化，并且其表達變化與肝癌臨床分期、組織分化程度和患者預(yù)后呈負相關(guān)［17］。既往研究發(fā)現(xiàn)，ANXA10能夠抑制鈣結(jié)合蛋白S100A4表達，而S100A4是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要誘導(dǎo)劑之一，其表達下調(diào)能夠阻礙腫瘤進展［15］，表明ANXA10在細胞癌變過程中具有抑制作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管癌組織ANXA10相對表達量降低，并且其表達與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，結(jié)果提示ANXA10可能在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中具有抑制作用，其機制可能為ANXA10轉(zhuǎn)錄基因甲基化，使其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致ANXA10轉(zhuǎn)錄基因沉默，繼而引起ANXA10表達下調(diào)［18］。有研究表明，ANXA10表達下調(diào)可導(dǎo)致結(jié)合銜接蛋白Grb2能力減弱，從而使ERK/MAPK信號通路活化，腫瘤細胞釋放大量生長因子，并促進腫瘤細胞分裂，加速腫瘤細胞增殖和遷移［15-16］。此外，ANXA10表達下調(diào)對鈣結(jié)合蛋白S100A4的抑制能力減弱，而活化的S100A4能夠結(jié)合晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，從而激活NF-κB信號通路，促進腫瘤細胞侵襲和遷移［19］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管癌組織lncRNA PCAT-1表達與ANXA10表達呈負相關(guān)關(guān)系，提示lncRNA PCAT-1可能通過結(jié)合ANXA10轉(zhuǎn)錄基因靶點，使ANXA10蛋白轉(zhuǎn)錄受阻，進而導(dǎo)致食管癌侵襲能力增強。有研究表明，lncRNA PCAT-1通過海綿miR-508-3p基因抑制ANXA10表達，從而促進食管癌進展［20］。ZANG等［21］研究認為，ANXA2能夠與c-Myc結(jié)合，而c-Myc又是lncRNA PCAT-1的靶點基因，表明lncRNA PCAT-1與Annexins家族確實存在一定聯(lián)系，但其具體機制仍不清楚，尚需進一步研究證實。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，lncRNA PCAT-1高表達者3年總體生存率低于lncRNA PCAT-1低表達者，ANXA10高表達者3年總體生存率高于ANXA10低表達者，即lncRNA PCAT-1表達上調(diào)和ANXA10表達下調(diào)時，食管癌患者生存時間明顯縮短。結(jié)果表明，lncRNA PCAT-1、ANXA10表達變化可能與食管癌患者預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，食管癌組織lncRNA PCAT-1高表達、ANXA10低表達，二者表達與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后有關(guān)。lncRNA PCAT-1、ANXA10有可能成為食管癌早期診斷、靶向治療和預(yù)后評估的生物標志物。