王東琴,張欣,霍浩然,秦瑞峰,袁增江
邯鄲市中心醫(yī)院普外科,河北邯鄲056000
胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一,每年新發(fā)病例約99萬例、死亡病例約73萬例[1]。我國是胃癌的高發(fā)國家之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),我國每年胃癌新發(fā)病例占全球的一半左右[2],并且許多患者就診時(shí)已屬進(jìn)展期,預(yù)后較差,5年生存率較低。胃癌的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,涉及多種原癌基因和(或)抑癌基因突變、生長因子及其受體異常表達(dá)等,但其確切的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。Rap1 GTP酶激活蛋白(Rap1-GAP)是GTP酶激活蛋白家族中的一員,能夠通過負(fù)性調(diào)控Rap1活性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等[3]。有研究報(bào)道,Rap1GAP在乳腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤等組織中表達(dá)下調(diào),其表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[3-5]。人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒-H長末端重復(fù)關(guān)聯(lián)蛋白2(HHLA2)是新發(fā)現(xiàn)的B7家族成員,具有免疫監(jiān)視、輔助T細(xì)胞激活、維持免疫環(huán)境穩(wěn)定等作用。有研究發(fā)現(xiàn),HHLA2在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá),其高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤免疫逃逸,從而導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[6-7]。但目前Rap1GAP、HHLA2表達(dá)與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚不清楚。2015年8月—2017年9月,本研究觀察了胃癌組織Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達(dá)變化,并探討其表達(dá)與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系?,F(xiàn)報(bào)告如下。
1.1 臨床資料 同期選擇邯鄲市中心醫(yī)院收治的胃癌患者97例。所有患者符合胃癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn);②具有胃癌根治性手術(shù)適應(yīng)證,自愿接受胃癌根治術(shù);③初診,術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療;④臨床病理資料和術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有胃肉芽腫、胃結(jié)核、胃狹窄等其他胃部疾病者;②既往有胃部手術(shù)史者;③合并其他部位惡性腫瘤者;④合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能不全者。其中,男52例、女45例,年齡51~73(58.79±5.62)歲,腫瘤直徑2~6(3.42±0.39)cm;組織分化程度:高分化42例,低中分化55例;浸潤深度:T1、2期39例,T3、4期58例;TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期38例,Ⅲ、Ⅳ期59例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例。本研究經(jīng)邯鄲市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批編號(hào):H20201012006),患者或其家屬知情同意并簽屬知情同意書。
1.2 Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達(dá)檢測 采用RTqPCR法。取胃癌組織及其配對的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣5 cm以上,并經(jīng)組織病理檢查證實(shí)為正常胃組織)各約100 mg,勻漿器中充分研磨,離心后棄上清液。剩余沉淀采用TRIzol法提取總RNA,經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)鑒定,OD260/OD280為1.8~2.0。按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件:50℃45 min,85℃5 min。以cDNA為模板,按熒光定量PCR擴(kuò)增檢測試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由賽默飛世爾科技(中國)有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列:Rap1GAP上游引物5′-GCACTTTCTCGGCAAGGAGCATTT-3′,下 游 引 物5′-TGACATCATGGTATGTCCGGCACT-3′;HHLA2上游引物5′-TACAAAGGCAGTGACCATTTGG-3′,下游引物5′-AGGTGTAAATTCCTTCGTCCAGA-3′;GAPDH上 游 引 物5′-TGACGTGCCGCCTGGAGA?AAC-3′,下游引物5′-CCGGGCATCGAAGGTG?GAAGAG-3′。PCR反應(yīng)體系共25μL:cDNA模板2μL,2 mmol/L MgCl22μL,2.5 mmol/L dNTP 1.6μL,1 mmol/L上下游引物各0.6μL,800 U/L EX TaqHS DNA聚合酶1μL,1×PCR緩沖液17.2μL;反應(yīng)條件:95℃2 min,95℃30 s、52℃30 s、72℃45 s共35個(gè)循環(huán),最后72℃10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析,以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算Rap1GAP、HHLA2 mRNA相對表達(dá)量。所有操作于CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成。
1.3 隨訪 所有患者出院后采用門診復(fù)查或電話形式定期隨訪,每3個(gè)月隨訪1次。隨訪截至2020年9月30日。統(tǒng)計(jì)隨訪期間患者因腫瘤死亡情況,計(jì)算5年生存率。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料經(jīng)K-S檢驗(yàn)符合正態(tài)分布,以±s表示,結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法,生存率比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。危險(xiǎn)因素分析采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 胃癌組織與癌旁正常組織Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達(dá)比較 胃癌組織Rap1GAP、HHLA2 mRNA相對表達(dá)量分別為0.32±0.08、1.03±0.21,癌旁正常組織分別為0.86±0.21、0.42±0.09。胃癌組織Rap1GAP mRNA相對表達(dá)量低于癌旁正常組織,HHLA2 mRNA相對表達(dá)量高于癌旁正常組織(t分別為22.866、18.612,P均<0.05)。
2.2 胃癌組織Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。
2.3 Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 97例胃癌患者全部獲得隨訪,隨訪截至2020年9月30日,死亡43例,無失訪病例。以Rap1GAP mRNA相對表達(dá)量的中位數(shù)(0.30)為截?cái)嘀?,將患者分為Rap1GAP mRNA高表達(dá)者(≥0.30,46例)與低表達(dá)者(<0.30,51例);以HHLA2 mRNA相對表達(dá)量的中位數(shù)(1.01)為截?cái)嘀?,將患者分為HHLA2 mRNA高表達(dá)者(≥1.01,50例)與低表達(dá)者(<1.01,47例)。Rap1GAP mRNA低表達(dá)者5年生存率為37.25%(19/51),Rap1-GAP mRNA高 表 達(dá) 者 為76.09%(35/46);HHLA2 mRNA高表達(dá)者5年生存率為44.00%(22/50),HHLA2 mRNA低 表 達(dá) 者 為68.09%(32/47)。Rap1GAP mRNA低表達(dá)者5年生存率低于Rap1GAP mRNA高表達(dá)者,HHLA2 mRNA高表達(dá)者5年生存率低于HHLA2 mRNA低表達(dá)者(χ2分別為13.831、6.098,P均<0.05)。
2.4 胃癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素分析 以隨訪截至日期胃癌患者生存情況為因變量(存活=0,死亡=1),以性別(男=1,女=2)、年齡(連續(xù)變量)、腫瘤直徑(≥3 cm=1,<3 cm=2)、TNM分期(Ⅰ、Ⅱ期=1,Ⅲ、Ⅳ期=2)、浸潤深度(T1、2期=1,T3、4期=2)、組織分化程度(低中分化=1,高分化=2)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(是=1,否=2)、Rap1GAP mRNA表達(dá)(連續(xù)變量)、HHLA2 mRNA表達(dá)(連續(xù)變量)為自變量,納入Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型。單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析顯示,TNM分期、組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Rap1GAP mRNA表達(dá)、HHLA2 mRNA表達(dá)可能與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)(P均<0.05);多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析顯示,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Rap1-GAP mRNA低表達(dá)、HHLA2 mRNA高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P均<0.05)。見表2。
表2 胃癌患者預(yù)后不良的Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析結(jié)果
胃癌是我國乃至全球常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,如幽門螺旋桿菌感染、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白異常表達(dá)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤免疫逃逸、原癌基因激活和抑癌基因失活等[8-9],但其確切的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。因此,深入探索與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子機(jī)制,對尋找有效的分子診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。
Rap1GAP是GTP酶激活蛋白家族中的一員,能夠負(fù)性調(diào)控Rap1活性。Rap1屬于小分子G蛋白R(shí)as超家族成員之一,具有逆轉(zhuǎn)原癌基因Ras激活突變體引起的細(xì)胞形態(tài)改變和傳遞致癌信號(hào)兩種截然不同的作用,其活性增強(qiáng)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[10]。Rap1GAP編碼的蛋白酶可將Rap1與GTP結(jié)合的活化形式催化轉(zhuǎn)變?yōu)镽ap1與GDP結(jié)合的失活形式,從而影響真核細(xì)胞的增殖、黏附和遷移等生物學(xué)行為[11]。在惡性腫瘤組織中,Rap1GAP mRNA扮演抑癌基因角色。SHAH等[3]研究報(bào)道,Rap1GAP表達(dá)下調(diào)可促使乳腺導(dǎo)管原位癌細(xì)胞的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/有絲分裂原活化蛋白激酶激活,誘導(dǎo)廣泛的細(xì)胞骨架重組和間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)換,從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性。GAO等[12]研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌組織Rap1GAP表達(dá)下調(diào),并且其表達(dá)下調(diào)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不良有關(guān)。但目前Rap1GAP在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不十分清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),胃癌組織Rap1GAP mRNA相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織,并且其低表達(dá)與腫瘤浸潤深度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示Rap1GAP mRNA低表達(dá)可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,從而導(dǎo)致病情進(jìn)展和患者預(yù)后不良,與高衛(wèi)利等[13]報(bào)道一致。
表1胃癌組織Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系
B7家族是一組具有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白,其胞外域與IgV、IgC結(jié)構(gòu)域具有同源性。共刺激信號(hào)是T細(xì)胞抗原特異性激活所必需的,當(dāng)共刺激信號(hào)缺乏時(shí),T細(xì)胞在識(shí)別抗原后不能有效增殖,無法產(chǎn)生免疫應(yīng)答,而B7家族成員則成為共刺激信號(hào)的主要來源[14]。HHLA2是新發(fā)現(xiàn)的B7家族成員,作為T細(xì)胞負(fù)性共刺激分子,主要表達(dá)于人抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞,亦可表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及B細(xì)胞,可為效應(yīng)T細(xì)胞對腫瘤反應(yīng)提供免疫監(jiān)視,還能為記憶T細(xì)胞激活提供良好的免疫環(huán)境[15]。HHLA2在人體正常組織中極少表達(dá),而在肺、卵巢、肝、食道等惡性腫瘤組織中高表達(dá)。JING等[6]研究報(bào)道,HHLA2在肝內(nèi)膽管癌組織中表達(dá)明顯升高,并且其表達(dá)與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞水平密切相關(guān)。CHENG等[16]研究發(fā)現(xiàn),HHLA2在非小細(xì)胞肺癌組織中廣泛表達(dá),并與肺腺癌EGFR突變和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞增加有關(guān)。但HHLA2在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不十分清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),胃癌組織HHLA2 mRNA相對表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織,并且其高表達(dá)與腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示HHLA2 mRNA能夠參與胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,其機(jī)制可能與HHLA2 mRNA過表達(dá)能夠抑制T細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞的殺傷作用,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視有關(guān)[17-18]。
本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),Rap1GAP mRNA低表達(dá)者5年生存率低于Rap1GAP mRNA高表達(dá)者,HHLA2 mRNA高表達(dá)者5年生存率低于HHLA2 mRNA低表達(dá)者;Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析顯示,Rap1GAP mRNA低表達(dá)、HHLA2 mRNA高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。結(jié)果提示,Rap1GAP、HHLA2 mRNA表達(dá)可作為胃癌預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。
綜上所述,胃癌組織Rap1GAP低表達(dá)、HHLA2高表達(dá),二者異常表達(dá)與胃癌惡性生物學(xué)行為和患者預(yù)后不良有關(guān)。Rap1GAP、HHLA2 mRNA有可能成為胃癌預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。