多發(fā)性肌炎差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

楊樂(lè)，秦超

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南寧530000

特發(fā)性炎癥性肌?。↖IM）是一組罕見(jiàn)的異質(zhì)性自身免疫性疾病，主要特征是四肢近端進(jìn)行性對(duì)稱性肌無(wú)力、血清肌酶水平升高、肌電圖呈活動(dòng)性肌病改變，肌肉活檢時(shí)可觀察到炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。根據(jù)臨床病理特征，IIM可分為多發(fā)性肌炎（PM）、皮肌炎、散發(fā)性包涵體肌炎、免疫介導(dǎo)的壞死性肌病等亞型［1］。其中，PM是IIM中最常見(jiàn)的類型。據(jù)報(bào)道，PM的發(fā)病率約為2/10萬(wàn)，發(fā)病年齡多為30～60歲，男女比約為1∶2［2］。遺傳因素參與PM的發(fā)病過(guò)程，幾乎所有PM患者與HLA-DR52有關(guān)。有研究報(bào)道，PM患者肌細(xì)胞內(nèi)膜可見(jiàn)由CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)［3］。除累及肌肉外，PM還可造成心、肺、腎等臟器受累。AIRIO等［4］研究報(bào)道，PM患者5年生存率約為75%，10年生存率約為55%，其中位生存期一般為11年。目前，PM治療主要依靠激素和免疫抑制劑，但激素或免疫抑制劑治療往往需要數(shù)月甚至數(shù)年，藥物不良反應(yīng)不可避免［5］。因此，深入探索PM的發(fā)病機(jī)制，對(duì)研發(fā)相應(yīng)的靶向藥物具有重要意義。本研究采用生物信息學(xué)方法篩選PM的差異表達(dá)基因（DEGs），旨在為研發(fā)相應(yīng)的靶向藥物提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 登錄美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院旗下美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的GEO芯片數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“polymy?ositis”為檢索詞，獲得基因表達(dá)譜GSE128470。該基因表達(dá)譜種屬為人類，芯片平臺(tái)為Affymetrix Human Genome U133A Array，GPL96［HG-U133A］。樣本來(lái)源于肌肉組織，其中7份來(lái)自PM患者肌肉組 織 樣 本（GSM3676317、GSM3676318、GSM3676319、GSM3676320、GSM3676321、GSM3676322、GSM3676323）、12份來(lái)自對(duì)照肌肉樣本（GSM3676285、GSM3676286、GSM3676287、GSM3676288、GSM3676289、GSM367690、GSM3676291、GSM3676292、GSM3676293、GSM3676294、GSM3676295、GSM3676296）。

1.2 DEGs篩選 運(yùn)用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析工具GEO2R對(duì)所選芯片的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行DEGs篩選，篩選條件為P<0.05且|log2FC|≥2，獲取PM的DEGs。

1.3 DEGs功能注釋（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）信號(hào)通路分析 將獲得的DEGs輸入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）在線網(wǎng)站，選擇P<0.05且count>5的DEGs進(jìn)行GO富集分析，包括生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能，同時(shí)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析。

1.4 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）預(yù)測(cè)DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape3.8.2軟件中插件MOCOD識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò)中最重要的模塊，并對(duì)模塊中的DEGs進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析，篩選條件為P<0.05且count>5。

1.5 關(guān)鍵基因篩選 采用Cytoscape3.8.2軟件中的插件CytoHubba并以degree為標(biāo)準(zhǔn)，篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中前十位的DEGs并作為關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選結(jié)果 通過(guò)GEO2R在線分析工具，以P<0.05且|log2FC|≥2為篩選條件，從基因表達(dá)譜GSE128470中共篩選出366個(gè)PM相關(guān)的DEGs，其中表達(dá)上調(diào)基因331個(gè)、表達(dá)下調(diào)基因35個(gè)。

2.2 DEGs的GO富集分析結(jié)果 GO富集分析顯示，DEGs主要涉及的生物學(xué)過(guò)程：干擾素γ介導(dǎo)的信號(hào)通路、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、抗原加工和呈遞、先天性免疫反應(yīng)、通過(guò)Ⅱ類MHC進(jìn)行抗原加工和肽或多糖抗原呈遞、通過(guò)Ⅰ類MHC進(jìn)行抗原加工和肽抗原呈遞、防御病毒、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、趨化性、細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子反應(yīng)、經(jīng)由TAP依賴的MHCⅠ類進(jìn)行抗原加工和呈遞外源性肽抗原、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用；細(xì)胞組成：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的組成部分、細(xì)胞外空間、細(xì)胞外泌體、MHCⅡ類蛋白復(fù)合物、質(zhì)膜、細(xì)胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體運(yùn)輸小泡膜、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)域、質(zhì)膜的組成部分、胞質(zhì)溶膠、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；分子功能：肽抗原結(jié)合、MHCⅡ類受體活性、趨化因子活性、抗原結(jié)合、免疫球蛋白受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、肝素結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、整聯(lián)蛋白結(jié)合、受體結(jié)合。

2.3 DEGs的KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果 KEGG信號(hào)通路分析顯示，DEGs主要涉及的信號(hào)通路：抗原處理和呈遞、吞噬體、同種異體移植排斥、細(xì)胞黏附分子（CAMs）、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、Toll樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、金黃色葡萄球菌感染、自身免疫性甲狀腺疾病、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心模塊 采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape3.8.2軟件中插件MOCOD識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò)中最重要的模塊，見(jiàn)圖1。GO富集分析顯示，該模塊中的基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程：干擾素γ介導(dǎo)的信號(hào)通路、Ⅰ型干擾素信號(hào)通路、抗原加工和呈遞、免疫反應(yīng)、經(jīng)由TAP依賴的MHCⅠ類進(jìn)行抗原加工和呈遞外源性肽抗原、通過(guò)Ⅰ類MHC進(jìn)行抗原加工和肽抗原呈遞、通過(guò)Ⅱ類MHC進(jìn)行抗原加工和肽或多糖抗原呈遞、T細(xì)胞受體信號(hào)通路；細(xì)胞組成：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的組成部分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體運(yùn)輸小泡膜、MHCⅡ類蛋白復(fù)合物、高爾基體膜、細(xì)胞表面、轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡膜、網(wǎng)格蛋白包被的內(nèi)吞囊泡膜、吞噬小泡膜、內(nèi)吞小泡膜、溶酶體膜；分子功能：肽抗原結(jié)合、MHCⅡ類受體活性、受體結(jié)合。KEGG信號(hào)通路分析顯示，該模塊中的基因主要參與同種異體移植排斥、EB病毒感染、CAMs、抗原處理和呈遞、吞噬體、金黃色葡萄球菌感染、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、炎癥性腸病。

圖1 DEGs中核心模塊的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 關(guān)鍵基因篩選結(jié)果 PPI網(wǎng)絡(luò)中前十位的DEGs作為關(guān)鍵基因，分別為PTPRC、STAT1、CD44、VCAM1、ICAM1、IRF8、IRF1、ITGB2、TYROBP、HLADRB1。

3 討論

PM是一組由多種原因引起的，以骨骼肌間質(zhì)性炎性改變和肌纖維變性為特征的自身免疫性疾病，除累及肌肉組織外，還可引起其他臟器或組織受累。PM晚期可累及食管，導(dǎo)致患者吞咽困難，進(jìn)而引起反流性食管炎，有可能導(dǎo)致吸入性肺炎甚至窒息［6］。PM患者血液往往處于高凝狀態(tài)，血栓栓塞的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯增加［7］。此外，PM患者罹患心臟病、惡心腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)亦明顯增加。目前，臨床主要通過(guò)血清學(xué)檢查、影像學(xué)和肌電圖檢查、神經(jīng)傳導(dǎo)檢查以及組織活檢等方法診斷PM，但沒(méi)有特定的檢查方法和靶向藥物。

本研究從GEO芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取PM患者和健康人群肌肉組織的基因芯片（GSE128470），篩選得到366個(gè)DEGs，其中表達(dá)上調(diào)基因331個(gè)、表達(dá)下調(diào)基因35個(gè)。通過(guò)DAVID在線網(wǎng)站進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析。GO富集分析顯示，DEGs的主要功能涉及干擾素γ介導(dǎo)的信號(hào)通路、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的組成部分、肽抗原結(jié)合、MHCⅡ類受體活性、趨化因子活性等；KEGG信號(hào)通路分析顯示，DEGs主要富集在抗原處理和呈遞、吞噬體、同種異體移植排斥、CAMs、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用等。通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape軟件中插件MOCOD識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心模塊，并對(duì)模塊中的基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，核心模塊中的基因主要功能涉及干擾素γ介導(dǎo)的信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的組成部分、肽抗原結(jié)合等；KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，核心模塊中的基因主要富集在同種異體移植排斥、CAMs等。本研究最后采用Cytoscape軟件中的插件CytoHubba，篩選出了PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前十位的關(guān)鍵基因，分別為PTPRC、STAT1、CD44、VCAM1、ICAM1、IRF8、IRF1、ITGB2、TYROBP、HLA-DRB1。

STAT1的編碼蛋白可被干擾素α、干擾素γ等激活，該蛋白能夠介導(dǎo)多種基因的表達(dá)［8］。有研究表明，PM患者STAT1表達(dá)明顯高于健康志愿者，可能是因?yàn)镾TAT1參與了JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，從而形成轉(zhuǎn)錄激活因子干擾素α活化因子和干擾素刺激基因因子3，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與干擾素刺激應(yīng)答原結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄，從而參與組織損傷［9］。VCAM1的編碼蛋白可介導(dǎo)白細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并可在動(dòng)脈粥樣硬化和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮作用［10］。ICAM1可編碼在內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面糖蛋白［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，ICAM1和VCAM1在PM患者肌內(nèi)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并作為白細(xì)胞功能相關(guān)抗原1和極晚激活抗原4的配體發(fā)揮作用，從而使活化的淋巴細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞并遷移至肌肉纖維［12］。HLA-DRB1屬于HLAⅡ類β鏈旁系同源物，其編碼蛋白可通過(guò)呈現(xiàn)源自細(xì)胞外蛋白的肽，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［13］。HLA在PM的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，這可能是因?yàn)镠LA分子能夠影響T細(xì)胞受體發(fā)育、外周耐受以及對(duì)環(huán)境因子的免疫反應(yīng)等［14］。

目前，PTPRC、CD44、IRF8、IRF1、ITGB2、TYROBP與PM的相關(guān)研究較少。PTPRC編碼蛋白酪氨酸磷酸酶，蛋白酪氨酸磷酸酶是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程的信號(hào)分子，如細(xì)胞有絲分裂、致癌轉(zhuǎn)化，還是T、B細(xì)胞抗原受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)劑［15］。CD44的編碼蛋白能夠參與細(xì)胞—細(xì)胞相互作用、細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移等，該蛋白還能參與淋巴細(xì)胞活化、再循環(huán)和歸巢以及腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程［16］。IRF8編碼IRF家族蛋白，該家族蛋白可與干擾素刺激的反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素（干擾素α、干擾素β）分泌［17］。人類IRF8缺失會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的原發(fā)性免疫缺陷，其附近序列變異是炎癥性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥等多種慢性炎性疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。IRF1的編碼蛋白是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子或腫瘤抑制因子，也是與先天性和后天性免疫應(yīng)答有關(guān)基因的激活劑，該蛋白能夠在細(xì)胞增殖、凋亡以及免疫反應(yīng)和DNA損傷反應(yīng)中發(fā)揮作用［18］。ITGB2的編碼蛋白在免疫應(yīng)答中起重要作用，該基因缺陷可導(dǎo)致白細(xì)胞黏附障礙［19］。TYROBP的編碼蛋白可能與膜糖蛋白的殺傷細(xì)胞性抑制受體家族有關(guān)，并且可以充當(dāng)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腦髓鞘形成和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［20］。

本研究從PM患者肌肉組織中共篩選出366個(gè)DEGs，其中表達(dá)上調(diào)基因331個(gè)、表達(dá)下調(diào)基因35個(gè)，這些DEGs主要參與抗原處理和呈遞、免疫反應(yīng)、吞噬體、CAMs等信號(hào)通路，其中PTPRC、STAT1、CD44、VCAM1、ICAM1、IRF8、IRF1、ITGB2、TY?ROBP、HLA-DRB1為PM的關(guān)鍵基因。這些關(guān)鍵基因有可能成為PM早期診斷、靶向治療和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物。