“防風(fēng)-白術(shù)”抗結(jié)直腸癌作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

張 芳 沈 趣 吳 繁 王彬彬

結(jié)直腸癌發(fā)病率居所有癌癥的第三位，死亡率近年已躍居癌癥第二位[1-2]。結(jié)直腸癌病因尚不明確，但大量的研究證據(jù)表明結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是有遺傳、環(huán)境和生活因素等多方面作用的結(jié)果，與結(jié)腸癌家族史、炎癥性腸病、紅肉和加工肉攝入、糖尿病、肥胖、吸煙、飲酒等危險因素相關(guān)[3]。結(jié)直腸癌屬中醫(yī)“癥瘕”“廟瘤”“積聚”“腸覃”“大瘕泄”“鎖肛痔”“腸風(fēng)”“臟毒”等范疇[4-5]。中醫(yī)認為，結(jié)直腸癌發(fā)病多由先天稟賦不足、肝氣郁結(jié)、飲食失調(diào)、外感濕邪、脾腎虧虛等導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，濕熱內(nèi)生，蘊結(jié)腸道，積久而發(fā)病。臨床治療結(jié)直腸癌多從腸道濕熱論治，用藥以防風(fēng)、白術(shù)使用最為頻繁，患者反饋獲益頗佳。白術(shù)健脾補中氣使脾氣自健，以補其虛；防風(fēng)行氣活血化瘀使?jié)裥叙錾?，以治其實。目前防風(fēng)-白術(shù)治療結(jié)直腸癌的分子機制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，以致其在臨床上未被廣泛應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 防風(fēng)-白術(shù)主要化學(xué)成分篩選 本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCSMP，https//lsp.nwu.edu.cn/tcsmp.php）[6]檢索，以口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18 為閾值，篩選出防風(fēng)-白術(shù)的主要化學(xué)成分。

1.2 防風(fēng)-白術(shù)主要化學(xué)成分基因靶點預(yù)測 利用uniport（https://www.uniport.org/）數(shù)據(jù)庫將已篩選出的防風(fēng)-白術(shù)主要化學(xué)成分對應(yīng)的靶點與相應(yīng)的人類已知基因靶點匹配[7]。

1.3 CRC 基因靶點預(yù)測 在GeneCards（https://www.genecard.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)直腸癌相關(guān)基因，獲得結(jié)直腸癌相關(guān)基因。

1.4 網(wǎng)絡(luò)合并及分析 使用R 語言選取藥物主要成分基因靶點與疾病基因靶點交集，并繪制venn圖，并將防風(fēng)-白術(shù)的活性成分與預(yù)測的基因交集關(guān)聯(lián)，很有可能得到防風(fēng)-白術(shù)治療結(jié)直腸癌的活性成分及基因靶點，采用Cytoscape 3.7.1 軟件對所得結(jié)果進行可視化處理，并采用拓撲學(xué)分析各網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的介度、緊密度以及連接度，遴選防風(fēng)-白術(shù)治療結(jié)直腸癌的核心蛋白。利用String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/Version 11.0）預(yù)測靶標(biāo)蛋白相互作用關(guān)系，把防風(fēng)-白術(shù)預(yù)測作用靶標(biāo)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，獲得靶標(biāo)蛋白相互作用關(guān)系。

1.5 防風(fēng)-白術(shù)抗結(jié)直腸癌靶點生物功能分析及通路分析 應(yīng)用R 語言對防風(fēng)-白術(shù)治療結(jié)直腸癌的靶點進行GO（Gene Ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號通路富集分析，探究防風(fēng)-白術(shù)治療結(jié)直腸癌潛在靶點涉及的生物學(xué)過程及信號通路。

2 結(jié)果

2.1 防風(fēng)-白術(shù)化學(xué)成分篩選及靶點預(yù)測 通過TCSMP 數(shù)據(jù)庫檢索，以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18 為篩選條件并篩去無對應(yīng)靶點的成分，得到防風(fēng)-白術(shù)活性化合物紫花前胡素、珊瑚菜素、防風(fēng)色酮醇、α-香樹精等共25 種。利用Uniport 數(shù)據(jù)庫將靶點名稱統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化處理后發(fā)現(xiàn)20 個活性成分具有對應(yīng)靶點（見表1），共對應(yīng)61 個靶點。

表1 防風(fēng)-白術(shù)活性成分

2.2 防風(fēng)-白術(shù)治療結(jié)直腸癌的候選靶點 通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索得到與結(jié)直腸癌相關(guān)靶點共9330 個，由于靶點數(shù)量大，選取其中relevance＞10 的靶點作為研究對象，得到密切關(guān)聯(lián)靶點1262 個。通過OMIM 數(shù)據(jù)庫檢索得到與結(jié)直腸癌相關(guān)基因341個，兩個數(shù)據(jù)庫共篩選得到基因靶點1603 個。通過R 語言對比分析結(jié)直腸癌與防風(fēng)-白術(shù)有效活性成分對應(yīng)靶標(biāo)的共有部分，最終得到防風(fēng)-白術(shù)活性成分治療結(jié)直腸癌的潛在靶點共35 個，并繪制成Venn圖。見表2，圖1。

圖1 結(jié)直腸癌與防風(fēng)-白術(shù)相關(guān)靶點韋恩圖

表2 防風(fēng)-白術(shù)抗結(jié)直腸癌預(yù)測靶標(biāo)

2.3 防風(fēng)-白術(shù)活性成分抗結(jié)直腸癌的作用靶標(biāo)分析 將篩選的活性化合物及靶點導(dǎo)入Cytoscape

3.7.1 軟件構(gòu)建“疾病-藥物-成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），其中，三角形節(jié)點代表防風(fēng)-白術(shù)有效活性成分，圓形節(jié)點代表作用靶標(biāo)，菱形節(jié)點代表結(jié)直腸癌，六邊形節(jié)點代表防風(fēng)-白術(shù)，邊線代表藥物、疾病、活性成分與靶標(biāo)之間的相互聯(lián)系。漢黃芩素（Wogonin）對應(yīng)的靶點最多，共有29 個靶點與其直接相連，前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）與有效化合物及結(jié)直腸癌間聯(lián)系邊線最多，提示漢黃芩素可作為防風(fēng)-白術(shù)抗結(jié)直腸癌的關(guān)鍵藥理成分，通過影響PTGS2 發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用。從圖2 中可以看出，防風(fēng)的多個活性成分可作用于一個靶點，也可以作用于不同靶點，同時，35 個作用靶點涉及多條信號通路，且多條信號通路中又可通過共有靶點相連，體現(xiàn)了防風(fēng)-白術(shù)多成分、多靶點、多通路協(xié)同抗結(jié)直腸癌的作用機制。

圖2 “疾病-藥物-成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 防風(fēng)-白術(shù)與結(jié)直腸癌相關(guān)靶標(biāo)PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 在String 數(shù)據(jù)庫平臺構(gòu)建共有靶點的蛋白互作PPI 網(wǎng)絡(luò)（見圖3），將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，利用軟件分析和處理（見圖4），網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點大小及顏色深淺反應(yīng)Degree 值的大小。PPI 網(wǎng)絡(luò)前十的核心基因分別是CASP3、AKT1、JUN、CCND1、IL-6、ESR1、PTGS2、RELA、MAPK14、CDKN1A。

圖3 String 平臺PPI 網(wǎng)絡(luò)互作圖

圖4 靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析 采用Conbioconductor 數(shù)據(jù)庫及R 語言對防風(fēng)-白術(shù)、CRC 的交集靶點進行GO 功能富集分析，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為P 值＜0.05，GO 分析得到具有顯著意義的65 條GO 功能條目，均為分子功能，前20 條GO 分析結(jié)果如圖5 所示，主要涉及結(jié)合DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（DNA-binding transcription factor binding）、核受體活性（nuclear receptor activity）、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性（ligand-activated transcription factor activity）等過程。KEGG 分析共得到139 條具有顯著意義的通路，前20 條與結(jié)直腸癌相關(guān)度較高的通路如圖6所示，圓點越大顏色越紅，表明該通路富集的靶點越多，P 值也越小，排名靠前的信號通路主要有人巨細胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（Hepatitis B）、Kaposi 肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）等。

圖5 核心靶點的GO 分析

圖6 核心靶點的KEGG 分析

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討防風(fēng)-白術(shù)治療結(jié)直腸癌的潛在作用機制，構(gòu)建疾病-藥物-成分-標(biāo)靶網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)表明了防風(fēng)-白術(shù)治療結(jié)直腸癌具有多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的特點，該網(wǎng)絡(luò)提示抗結(jié)直腸癌的核心成分為漢黃芩素、β 谷甾醇、3β-羥基蒼術(shù)酮。漢黃芩素能夠通過下調(diào)綠膽素還原酶A（BLVARA），達到抑制結(jié)直腸癌細胞系HT-29 及SW620 細胞的增殖，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進程，從而發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用[8]。Β-谷甾醇可以抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)期凋亡，抑制其遷移和侵襲，通過Akt/GSK-3β 信號通路抑制EMT[9-10]，并且能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能，降低IgG、IgG1 等特異性抗體水平，抑制炎癥細胞因子產(chǎn)生[11]，從而減輕腫瘤病人的炎癥反應(yīng)。

將藥物-疾病交集靶點進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的分析，利用Cytoscape 的cytohubba 插件MCC 算法計算出PPI 網(wǎng)絡(luò)前十位核心基因，與CRC 相關(guān)度較高的靶點有CASP3、AKT1、JUN、CCND1、IL-6、ESR1、PTGS2 等。故推測上述靶點與防風(fēng)-白術(shù)治療結(jié)直腸癌的作用機制密切相關(guān)。CASP3 通過切割各種基本細胞蛋白在凋亡通路中起著關(guān)鍵作用，在結(jié)直腸癌、卵巢癌和乳腺癌等幾種類型癌癥中，CASP3mRNA 水平明顯低于正常人[12]，通過調(diào)節(jié)CASP3 水平治療結(jié)直腸癌[13]。AKT1 是PI3K/Akt 信號通路中的核心靶標(biāo)，調(diào)控細胞代謝、細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡和血管生成等方面[14]。異常激活的Akt 可通過抑制蛋白水解酶Caspase9 活性促使結(jié)直腸癌細胞逃避細胞凋亡，同時激活下游mTOR 標(biāo)靶引發(fā)一系列反應(yīng)進而導(dǎo)致結(jié)直腸癌細胞增殖、血管生成和侵襲等[15]。JUN在細胞增殖、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮中要作用[16]。CCND1 基因編碼的細胞周期蛋白，具有促進細胞增殖和基因轉(zhuǎn)錄等功能，可在多種癌癥中成高表達，阻斷CCND1 編碼細胞周期蛋白的治療策略將有助于干擾多種癌癥特異性新高通路達到治療癌癥的目的[17]。IL-6 持續(xù)可激活各種炎癥/免疫/凋亡基因，如Bcl-2 基因家族和VEGF，這些基因?qū)е履[瘤細胞入侵、血管生成和轉(zhuǎn)移[18]。ESR1 在結(jié)直腸癌組織中的表達水平顯著高于正常的結(jié)直腸組織[19]，給予結(jié)直腸癌患者5-FU 治療后可顯著降低患者癌組織中ESR1 mRNA 的表達水平及無病生存期（DFS）[20]。PTGS2 參與大腸癌發(fā)展的早期階段，最初影響腫瘤的基質(zhì)微環(huán)境，然后影響上皮細胞，并且PTGS2 表達與結(jié)直腸癌中端粒酶活性之間成負相關(guān)關(guān)系[21]。

GO 功能富集分析共得到65 個富集項，且均為分子功能，防風(fēng)-白術(shù)治療結(jié)直腸癌可能與核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、結(jié)合DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸活性、類固醇結(jié)合等條目密切相關(guān)。促進膽汁酸核受體活性可以明顯抑制直腸腫瘤細胞增殖能力[22-23]?？寡住⒖咕?、抗脂質(zhì)過氧化、KEGG 通路富集提示，防風(fēng)-白術(shù)抗結(jié)直腸癌的信號通路主要集中在惡性腫瘤、CRC 相關(guān)通路等，與AGE-RAGE 信號通路、乙型肝炎、人巨細胞病毒感染、IL-17、EB 病毒感染等信號通路密切相關(guān)。AGERAGE 信號通路激活可促進直腸癌HCT116 細胞的增殖、遷移、侵襲和克隆形成能力，并維持腫瘤細胞干性，其機制可能與AGE/RAGE/通路介導(dǎo)的EMT 有關(guān)[24]。結(jié)直腸癌患者血清HBs Ag 表達可能與結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移及浸潤深度有關(guān)[25]，慢性HBV 感染與結(jié)直腸癌風(fēng)險增加顯著相關(guān)[26]。人巨細胞病毒編碼的US28 基因使結(jié)直腸癌患者有更大的化療耐藥性及更高的侵襲能力，并加速細胞周期進展[27]。IL-17 在結(jié)直腸癌患者的血清和組織中表達上調(diào)，在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后中有重要作用，可以抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生[28]。EB 病毒誘導(dǎo)基因3 可能介導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞對5-FU 的耐藥過程[29]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了防風(fēng)-白術(shù)治療結(jié)直腸癌的作用靶點及作用機制，闡明防風(fēng)-白術(shù)通過多成分-多靶點-多通路治療結(jié)直腸癌，為進一步實驗研究和臨床應(yīng)用提供了新思路、指明了新方向。但是，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究藥物治療疾病的靶點仍存在局限性，其雖然能較為系統(tǒng)地預(yù)測活性成分、作用靶點與作用通路，但預(yù)測結(jié)果不能完全證明其正確性，其作用機制需要開展體外和體內(nèi)實驗進行驗證。