穩(wěn)定表達熒光素酶BGC823細胞系的構(gòu)建

王 琳， 張紫怡， 金 靜， 段海瀟， 王潤楊， 胡 翰， 汪 洋， 劉濱磊

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院， 湖北 武漢 430068)

圖 1 BGC823細胞對不同濃度嘌呤霉素敏感性曲線

圖 2 流式細胞儀檢測BGC823-Fluc單克隆細胞純度

圖 3 BGC823細胞與FLuc-BGC823細胞生長對比

圖 4 相對熒光值與細胞數(shù)目的相關(guān)性曲線

圖 5 活體動物拍攝裸鼠腹腔植瘤

胃癌的形態(tài)學(xué)、分子特征復(fù)雜，具有高度異質(zhì)性，為了鑒定病理和分子生化機制，已經(jīng)在大鼠和小鼠中建立了各種實驗動物模型[1]。生物發(fā)光是存在于生物體內(nèi)的一種特殊類型的發(fā)光現(xiàn)象，主要指在酶的催化作用下將生物能轉(zhuǎn)化成光能的過程，而不依賴于有機體對光的吸收[2]。生物發(fā)光成像技術(shù)具有非侵襲性、可定量、高靈敏度、操作簡單，以及能夠?qū)崟r及連續(xù)動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域[3]。

熒光素酶(luciferase)報告系統(tǒng)是生物發(fā)光最常見的系統(tǒng)之一，是luciferase 以熒光素(luciferin)、三磷酸腺苷(ATP)和O2為底物，在Mg2+存在時發(fā)生酶促反應(yīng)產(chǎn)生光子的過程[4]。熒光素酶報告基因被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建特殊的單克隆細胞系，用于抗腫瘤藥物的篩選。被熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細胞可通過腹腔植瘤到動物體內(nèi)，可用生物發(fā)光成像儀進行檢測?？伦诨偷热藰?gòu)建了穩(wěn)定表達熒光素酶的B16R細胞系，并構(gòu)建適用于小動物活體成像觀察的C57 小鼠皮下移植瘤模型[5]。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是重要的探針分子，廣泛應(yīng)用于標(biāo)記特定分子或細胞[6]，其缺陷是不能像酶一樣有信號放大作用[7]，表達量低時不易檢測。熒光素酶標(biāo)記的細胞檢測時需添加熒光素酶底物，可快速、無創(chuàng)地進行活體檢測，具有較高的靈敏性、特異性和組織穿透能力，適用于體內(nèi)成像[8]。熒光蛋白作為一種自發(fā)熒光，受到激發(fā)光源后可在倒置顯微鏡下觀察到，因為自發(fā)熒光的體內(nèi)成像可能被生物體內(nèi)部一些組織干擾，比較適用體外的相關(guān)研究。本研究構(gòu)建含單色熒光素酶以及GFP綠色熒光蛋白的BGC823細胞系，形成雙熒光標(biāo)記，生物發(fā)光和熒光成像的優(yōu)點被應(yīng)用在一起，在實際應(yīng)用中有更多兼容性。

1 材料與方法

1.1 細胞試劑和儀器

實驗使用的細胞株(BGC823)購于北京協(xié)和醫(yī)院細胞資源中心；細胞所用的培養(yǎng)基是DME/F-12(HyClone， USA)；lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒購于Thermo Fisher Scientific 公司；PiggyBac-Dual-Promoter-Firefly Luciferase( PBDP-FLUC) 重組質(zhì)粒和PBDP 轉(zhuǎn)座酶， 本實驗室提供。 大腸桿菌菌株DH5α，本團隊制備；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(天根生物公司)。嘌呤霉素和MTS購自碧云天生物；BD流式細胞檢測儀，倒置熒光顯微鏡，Nikon公司)。多功能酶標(biāo)儀Thermo Fisher Scientific；熒光素酶底物(翊圣)；北京東聯(lián)生物安全柜。

1.2 質(zhì)粒的提取

從-80℃超低溫冰箱中取出用甘油保存的PBDP-FLuc質(zhì)粒大腸桿菌。該質(zhì)粒由實驗室前期構(gòu)建并保存，在室溫快速解凍后以1∶1000的比例與LB液體培養(yǎng)基混勻，放37°C搖床1600 r/min進行搖菌15 h。質(zhì)粒提取按照天根小提質(zhì)粒試劑盒說明書操作。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

BGC823細胞復(fù)蘇后培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化并將BGC823細胞并傳代至24孔板105個細胞每孔，細胞存活率97%。當(dāng)細胞密度達到80%左右時，質(zhì)粒PBDP-FLuc和PBDP-transposase以5∶1比例根據(jù)Lip3000說明書進行轉(zhuǎn)染操作。 BGC823細胞轉(zhuǎn)染24 h后在倒置顯微鏡的藍光和白光下可觀察到GFP陽性率。

1.4 細胞敏感性實驗及單克隆篩選

將細胞擴培到T 25瓶后，鋪24孔板。當(dāng)24孔板中細胞覆蓋率達到80%時，棄去原細胞培養(yǎng)液。分別配置含嘌呤霉素濃度為1 、2 、 3、4、5、6、 7、 8、 9、10 μg/mL的DME/F12完全培養(yǎng)基，各3mL；給24孔板做好嘌呤霉素濃度標(biāo)記，分別將含嘌呤霉素的DME/F12培養(yǎng)基加入對應(yīng)孔，每種嘌呤霉素濃度設(shè)置3個孔平行對照。將24孔板轉(zhuǎn)移至CO2細胞培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為37℃，CO2濃度設(shè)置為5%進行細胞培養(yǎng)，連續(xù)觀察細胞狀態(tài)，2 d更換一次培養(yǎng)基，最終以第4天殺死24孔板中所有細胞的最低嘌呤霉素濃度為最佳嘌呤霉素篩選濃度。

有限稀釋法獲得BGC823單克隆，用DME/F12完全培養(yǎng)基(含10% FBS)將細胞稀釋至1000個/mL。取干凈無菌96孔板，每孔中加入100 μL DME/F12完全培養(yǎng)基(含10%FBS)，再加入稀釋后的細胞懸液1 μL，于 CO2細胞培養(yǎng)箱中，37℃恒溫，5% CO2濃度進行細胞培養(yǎng)。待細胞貼壁后(7 d左右)，在倒置顯微鏡下觀察，記錄只有單個細胞增殖成團的孔。繼續(xù)在CO2細胞培養(yǎng)箱中，37℃恒溫，5% CO2濃度進行細胞培養(yǎng)。待細胞長至80%，在倒置熒光顯微鏡下檢測細胞發(fā)光情況，觀察到一個孔全部細胞均發(fā)光后， 進行擴大培養(yǎng)，依次擴大到24孔板、6孔板，再到T-25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，細胞長滿T-25 cm2細胞培養(yǎng)瓶。每個細胞樣品取106個用于后續(xù)流式檢測。

1.5 流式細胞儀檢測BGC823-FLuc細胞純度

用流式細胞儀對BGC823-FLuc單克隆細胞系進行純度鑒定。分別收集BGC823細胞和BGC823-FLuc細胞各106個于EP管中，將細胞懸液離心(800 r/min×4 min)，棄去舊培養(yǎng)液，加入1 mL PBS洗滌，離心(800 r/min× 4min)，加500 μL PBS重懸，將上樣密度調(diào)整為2×106個/mL，過細胞濾網(wǎng)，流式細胞儀設(shè)置上樣細胞數(shù)為5×105個，檢測細胞純度，純度大于98%即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。

1.6 MTS實驗檢測細胞活力與生長曲線

取5塊干凈無菌96孔板，將培養(yǎng)的BGC823細胞和BGC823-FLuc細胞消化計數(shù)后，接種到同一塊96孔板中(共3個平行孔)，每孔加100 μL密度為5×105個/mL的細胞懸液，CO2細胞培養(yǎng)箱中，37℃恒溫，5% CO2濃度進行細胞培養(yǎng)。5塊96孔板的培養(yǎng)時間分別為0、24、48、72、96 h。

培養(yǎng)結(jié)束后參照MTS說明書進行如下操作：加入MTS 20 μL，CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，置于多功能酶標(biāo)儀上，在490 nm波長處，以培養(yǎng)基所在孔測定的吸光度值作為背景值，計算時所有樣品測定的吸光度值均減去背景值。生長曲線的縱坐標(biāo)是吸光度值，橫坐標(biāo)是BGC823細胞數(shù)目，Excel繪制細胞生長曲線。

1.7 熒光素酶活性鑒定

細胞傳代培養(yǎng)后，收集細胞，梯度稀釋后加入到96孔板中，每孔100 uL，BGC823-FLuc細胞數(shù)分別為5×104、2.5×104、1.25×104、6250、3125、1563個，每種密度設(shè)置4個平行孔。設(shè)置對照孔，加入100 uL PBS 緩沖液，設(shè)置4個平行孔。按照熒光素酶底物使用說明書，全程避光，各孔均加入稀釋50倍的熒光素酶底物100 uL，使熒光素酶底物濃度為0.15 mg/mL，培養(yǎng)箱孵育5 min，多功能酶標(biāo)儀檢測化學(xué)發(fā)光。

1.8 BGC823細胞和BGC823-FLuc細胞的裸鼠體內(nèi)成瘤實驗

隨機選取5～6周齡裸鼠9只，分成3組，每組3只。對第一組裸鼠均腹腔注射100 μL，密度為5×106個/mL的BGC823-FLuc細胞；對第二組裸鼠均腹腔注射100 μL，密度為5×106個/mL的BGC823細胞；對第三組裸鼠腹腔注射100 μL PBS緩沖液。接種7 d后，按照熒光素酶底物使用說明書，腹腔注射熒光素酶反應(yīng)底物，底物用量30 mg/mL，100 μL/只，讓裸鼠自由活動10 min后，麻醉裸鼠，再進行動物活體成像，拍攝記錄三組裸鼠體內(nèi)熒光素酶發(fā)光情況。

2 結(jié)果

2.1 BGC823細胞對嘌呤霉素敏感性實驗

通過查閱文獻，選取嘌呤霉素的濃度范圍為1～10 μg/mL進行細胞敏感性實驗。通過最終繪制曲線可知，4天內(nèi)殺死所有細胞的最低嘌呤霉素濃度為6 μg/mL。因此6 μg/mL作為嘌呤霉素加壓篩選的最佳濃度。

2.2 流式細胞儀檢測BGC823-FLuc細胞純度

對穩(wěn)轉(zhuǎn)BGC823-FLuc細胞與BGC823細胞進行流式細胞儀鑒定。通過對比兩者流式檢測結(jié)果可知，F(xiàn)L1-A+表示GFP陽性率，與對照組相比GFP陽性率為99.9%，說明BGC823-Fluc單克隆細胞系構(gòu)建成功。

2.3 MTS實驗測定BGC823細胞與BGC823-FLuc細胞生長曲線

MTS法檢測BGC823細胞活力值。OD 490顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染了熒光素酶基因的細胞在0、24、48、72、96這幾個時間點吸光度值差異無顯著性(P>0.05)，說明穩(wěn)轉(zhuǎn)熒光素酶基因?qū)GC823細胞增殖幾乎無影響。

2.4 熒光素酶檢測

以細胞數(shù)目為橫坐標(biāo)，相對熒光值為縱坐標(biāo)，繪制細胞數(shù)目與相對熒光值的相關(guān)性曲線，相對熒光值和BGC823-Fluc細胞數(shù)目成正比例關(guān)系，且細胞數(shù)目和相對熒光值相關(guān)性為0.9791，說明熒光素酶在單克隆細胞系中表達。

2.5 BGC823-FLuc和BGC823裸鼠腹腔植瘤結(jié)果

裸鼠腹腔進行BGC823-Fluc和BGC823細胞注射后，7 d后腹腔注射熒光素酶反應(yīng)底物30 mg/mL，100 μL/只，讓裸鼠自由活動10 min后，在動物活體成像系統(tǒng)中檢測裸鼠體內(nèi)發(fā)光情況。第一組3只裸鼠體內(nèi)注射BGC823-Fluc，活體動物成像顯示，3只老鼠體內(nèi)均能檢測到熒光，可以通過熒光來判斷裸鼠體內(nèi)腫瘤進展。第二組3只裸鼠體內(nèi)注射BGC823，未檢測到熒光。第三組3只裸鼠體內(nèi)注射PBS，也未檢測到明顯熒光。

3 討論與結(jié)論

通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將含GFP和熒光素酶的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到胃癌細胞(BGC823)中，經(jīng)過嘌呤霉素加壓篩選，有限稀釋法挑選單克隆，經(jīng)擴大培養(yǎng)后，MTS實驗進行細胞活力鑒定并繪制生長曲線，流式細胞儀鑒定，陽性率為99.9%，表明成功構(gòu)建表達GFP及熒光素酶基因(FLuc)的胃癌細胞系(BGC823-FLuc)。葛曉梅等構(gòu)建的人胃癌細胞系顯示PDX模型來源的腫瘤細胞系不能完全替代PDX模型，需要和PDX模型結(jié)合使用[9]，在單個細胞系中結(jié)合不同的生物讀數(shù)提供了優(yōu)于常規(guī)基于細胞的測定的顯著優(yōu)勢，并接種到裸鼠皮下，建立裸鼠胃癌細胞模型，結(jié)合動物活體成像技術(shù)監(jiān)測腫瘤的生長過程。

這一模型的成功構(gòu)建，能夠為胃癌治療藥物篩選、胃癌免疫學(xué)治療、腫瘤的聯(lián)合治療手段等動物水平實驗提供極的大便利，能夠讓觀察者直觀而精確地判斷腫瘤在體內(nèi)的進展。與綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白等報告基因相比，熒光素酶靈敏度更高，穩(wěn)定性更好，背景干擾更低，在動物體內(nèi)的穿透性更強[10-13]，使熒光素酶報告基因在腫瘤治療和其他生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。