黃芪多糖的不同提取優(yōu)化工藝

余萍　趙寶娥　李欠

摘要 目的：比較不同提取工藝的黃芪多糖提取率。方法：選用超聲波輔助提取法對黃芪多糖進行提取，比較正交實驗最優(yōu)提取工藝和響應面試驗最優(yōu)提取工藝的提取率。結果：經由響應面優(yōu)化得出：最優(yōu)提取時間22 min，最優(yōu)提取溫度50 ℃，最優(yōu)料液比16∶1（mL/g），理論提取率為9.93%;經過正交設計優(yōu)化得出：最優(yōu)提取時間20 min，最優(yōu)提取溫度40 ℃，最優(yōu)料液比15∶1（mL/g），理論提取率為9.56%。結論：經二種優(yōu)化結果進行驗證比較，研究結果表明響應面法優(yōu)化結果更為準確、合理，更適宜推廣。

關鍵詞 黃芪多糖;正交優(yōu)化;響應面優(yōu)化;工藝比較;提取溫度;提取時間;液料比;提取率

Comparison of Different Extraction Optimization Processes of Astragalus Polysaccharides

YU Ping，ZHAO Bao′e，LI Qian

（Gansu Provincial Key Laboratory of Arid Land Crop Science，Gansu Provincial Key Laboratory of Technical Innovation for Standardized Production of Chinese Medicinal Materials，Materials College of Agriculture，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Abstract Objective：To compare the extraction rate of Astragalus polysaccharides under different extraction technologies.Methods：Astragalus polysaccharides were extracted by ultrasonic-assisted extraction method，and the extraction rate of the optimal extraction process of the orthogonal test and the optimal extraction process of the response surface test were compared.Results：Through response surface optimization，the optimal extraction time was 22 min，the optimal extraction temperature was 50 ℃，the optimal material-to-liquid ratio was 16∶1（mL/g），and the theoretical extraction rate was 9.93%; After orthogonal design optimization，the optimal extraction time was 20 min，the optimal extraction temperature was 40 ℃，the optimal material-to-liquid ratio was 15∶1（mL/g），and the theoretical extraction rate was 9.56%.Conclusion：After verification and comparison of 2 optimization results，the research results show that the response surface method optimization results are more accurate，reasonable and more suitable for promotion.

Keywords Astragalus polysaccharide; Orthogonal optimization; Response surface optimization; Process comparison; Extraction temperature; Extraction time; Liquid-to-material ratio; Extraction rate

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.003

黃芪是中藥方劑中最常用補益藥之一，古代曾書寫為“黃耆”，始見于《五十二病方》[1]，清代始，將“耆”字簡寫成“芪”字，在《神農本草經》中列為上品[2]。

黃芪是甘肅的道地藥材，同時也是十大隴藥之一，主要分布在甘肅、內蒙古、山西、東北等地。黃芪在防病治病實際應用過程中入藥部位一般取自于豆科植物膜莢黃芪和蒙古黃芪干燥根，黃芪主要藥效成分為黃芪多糖類，黃芪皂苷類，黃芪黃酮類。它具有補氣固表，利尿脫毒，斂瘡生肌之效[3]。近年來在防病治病上的需求量一直在增加[4]。黃芪多糖對人體具有免疫調節(jié)的功效，一般用于治療免疫調節(jié)障礙等癥，同時具有抗病毒、抗衰老、抗輻射及抗氧化等功效，應用前景十分廣闊，因此具有開發(fā)為新的中藥標準提取物的潛在價值，但以黃芪多糖含量為指標成分的研究報道較少[5-7]。本實驗采用超聲法輔助提取法，運用苯酚硫酸法對產自隴西黃芪進行多糖含量進行測定，把多糖作為正交優(yōu)化和響應面優(yōu)化的目標，為黃芪多糖在后續(xù)生產實踐中的合理開發(fā)利用提供理論參考，同時也為黃芪多糖作為目標提取物的提取制備工藝提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 植物材料黃芪（購自蘭州黃河藥材市場，產自甘肅隴西）經甘肅農業(yè)大學農學院中草藥教研室陳垣教授鑒定為中藥黃芪;D-無水葡萄糖標準品、苯酚、濃硫酸均為分析純。

HH-S2數顯恒溫水浴鍋（江蘇正基儀器有限公司）;離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）;電子天平（慈溪市天東衡器廠，型號：HX203T）;紫外可見分光光度計（島津企業(yè)（中國）有限公司）;超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多糖提取方法 黃芪飲片經干燥后粉碎，過40目篩，取10 g黃芪粉末并按設計液料比加純水，按設計的相應提取溫度和提取時間進行超聲提取，經紗布或脫脂棉濾過后濃縮至20 mL，加入3倍體積無水乙醇靜置數小時，置冰箱中過夜沉淀，然后于離心機離心最后干燥，得到粗多糖[8]。

1.2.2 標準曲線繪制 把D-無水葡萄糖標準品粉末在105 ℃下干燥至恒重，并置于分析天平上進行精密稱定，最后于100 mL容量瓶中定容至100 mL，最終得到濃度為100 μg/mL的D-無水葡萄糖標準溶液，作為對照品溶液，然后放置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ靡埔汗芤迫藴嗜芤?、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL濃度為100 μg/mL的標準溶液，分別置于不同的試管之中，加蒸餾水至2.0 mL。再在試管中分別加入5%的苯酚溶液1.0 mL，然后迅速在試管中加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后置于水浴鍋中在40 ℃下保溫加熱15 min，取出后置于裝有冷水的燒杯中冷卻10 min，然后在490 nm處測定吸光度值并記錄。濃度作為橫坐標，吸光度值作為縱坐標，繪制標準曲線[9]，在0.010 0～0.100 0 mg/mL濃度范圍內線性關系良好，求得出回歸方程為：Y=0.0128X+0.02，R2=0.996。見表1。

1.2.3 精密度考察 精確吸取D-無水葡萄糖對照品溶液0.4 mL置試管中，按照標準曲線操作步驟重復測定5次，測得RSD%=1.73%。見表2。

1.2.4 供試品溶液制備 精確稱取所得粗多糖約50 mg，加水溶解并定容至50 mL，搖勻后量取1 mL，加水稀釋定容至250 mL，即為供試品溶液。采取苯酚-硫酸法對黃芪多糖進行含量測定，首先精密量取樣品溶液0.5 mL移入10 mL容量瓶中加蒸餾水定容至10 mL。然后再精密量取1 mL置于試管中，按照標準曲線繪制的方法（1.3.2）操作，測得吸光度。用分光光度計在波長490 nm處測定吸光度，同時采用蒸餾水做空白對照，進而計算出粗多糖濃度。

2.5 多糖含量測定計算 R（%）=[（C×V₁×V₂×N）/（V₃×M×10⁶）]×100

R為多糖提取率，C是比色液濃度（μg/mL），V1是比色液體積（mL），V2是定容體積（mL），N表示稀釋倍數，V3是提供樣品體積（mL），M為試驗樣品質量（g）[10]。

3 結果

3.1 最佳單因素條件

3.1.1 提取時間對多糖提取率的影響 經查閱文獻把黃芪多糖提取料液比設計為20∶1（mL/g），把黃芪多糖提取溫度設計為40 ℃，把黃芪多糖提取時間分別設計為10、20、30、40、50 min。然后進行時間因素對黃芪多糖提取率影響試驗。見圖1。由此可知，黃芪多糖提取率在10～20 min之間遞增，在20 min時達到較大值，之后稍有下降但趨于平緩，實驗結果顯示，提取時間過長可能會使多糖結構發(fā)生改變或破壞而影響多糖提取率使之下降，所以選擇20 min為較佳的黃芪多糖提取時間[11]。

3.1.2 提取液料比對多糖提取率的影響 經查閱文獻把黃芪多糖提取過程料液比分別設計為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），把提取溫度設計為40 ℃、把時間設計為30 min進行液料比因素對黃芪多糖提取率影響試驗。見圖2。由此可知，在5∶1（mL/g）增加到15∶1（mL/g）時黃芪多糖提取率呈遞增趨勢，在15∶1（mL/g）時達到最大值，之后稍有起伏，但提取率與15∶1（mL/g）相差不大，考慮到提取容器的容量問題選擇15∶1（mL/g）為較佳液料比。

3.1.3 提取溫度對多糖提取率的影響 將查閱文獻把黃芪多糖料液比設計為20∶1，把黃芪多糖時間設計為30 min，同時選取溫度為30、40、50、60、70 ℃進行溫度因素對黃芪多糖提取率影響試驗。見圖3。

如圖3所示，多糖提取率在溫度30～50 ℃之間呈明顯遞增，并在50 ℃時提取率達到最大，之后逐漸降低，研究結果表明溫度過高可使糖分子結構發(fā)生改變而降低，因此選擇50 ℃為較優(yōu)提取溫度[12]。綜上實驗結果，單因素最優(yōu)條件為提取時間20 min，提取溫度50 ℃，液料比15∶1（mL/g）。

3.2 響應面優(yōu)化多糖提取工藝

3.2.1 Box-Behnken設計試驗結果與分析 根據Box-Behnken原理進行試驗設計，把多糖提取率作為響應值，結合單因素試驗結果進行試驗因素的水平范圍的確定，軟件Design-Expert 8.0.6，同時采用液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）進行三因素三水平的響應面試驗設計。見表3。

根據表中設計的各因素水平進行試驗，利用所得吸光度計算各種條件下的多糖提取率。見表4。

從表4分析可知，當把黃芪多糖的提取時間設定為20 min，提取溫度設定為50 ℃，液料比設定為15∶1（mL/g）時黃芪多糖提取率最高，結果顯示為10.43%。以黃芪多糖的多糖提取率（R）為響應值，采用Design-Expert8.0.6軟件對黃芪多糖的提取時間、提取溫度，液料比進行回歸分析，所得回歸模擬方程為：

R=9.86+0.52A+0.68B+0.012C-0.46AB-0.49AC+0.42BC-1.88A²-1.23B²-0.29C²-0.56A2B-0.062A2C+0.070AB²。

經過對模型進行方差分析，得出的結果見表5、表6。

由表5可知，試驗整體模型F=18.47，P=0.000 4，說明該模型有統(tǒng)計學意義（P<0.01），失擬項F=1.42，P=0.361 5，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），結合表6中多元相關系數R2=0.959 6，調整后R2Adj=0.907 7，說明模型擬合良好，該實驗設計合理，可用此模型進行黃芪多糖的提取工藝的分析和預測。從F值可以判斷出各因素對黃芪多糖提取率影響程度為：A（提取液料比）>B（提取時間）>C（提取溫度）。

3.2.2 響應面及等高線結果（工藝優(yōu)化最佳條件）依據所得二次線性回歸方程，采用Design-Expert8.0.6軟件繪制出3個因素對糖提取率交互影響的三維響應曲面圖和等高線圖。見圖4。

由圖4可知，當提取溫度一定時，在液料比不斷增加的情況下，黃芪多糖提取率呈現出先增大后趨于平緩的趨勢，相反，當液料比保持一定時，隨著提取溫度的升高，黃芪多糖提取率同樣呈現出先平緩增大后減小的趨勢，說明液料比大于溫度對多糖提率影響[13]。由圖5可知，當提取時間一定時，隨著液料比的增大，黃芪多糖提取率逐漸增大后趨于平緩，反之亦然，當液料比一定時，隨著提取時間的延長，黃芪多糖提取率同樣呈現出先增大后減小的趨勢。由圖6可知，當提取溫度一定處于一定的水平時，黃芪多糖提取率隨著提取時間的推移呈現先增大后減小，反之亦然，當提取時間處于一定的水平時，黃芪多糖提取率跟著提取溫度先增大后減小。

由效應曲面圖a、c、e可知響應面具有最高點，從響應面的陡峭程度和等高線的橢圓程度來看，提取的液料比對黃芪多糖提取率的影響最顯著，液料比和溫度的交互作用顯示出很明顯的作用，時間和溫度的交互作用也顯示出相對明顯的作用，料液比和時間的交互作用顯示較弱的作用[13]。這與表5、6中的方差分析結果相一致。

3.2.3 響應面優(yōu)化結果及驗證性實驗Design-Expert 根據對回歸方程進行分析得到黃芪多糖提取率最大時對應的最佳提取條件為：液料比15.7∶1，提取時間21.25 min，提取溫度49.40 ℃，且黃芪多糖理論提取率為9.93%，結合實際情況確定最終優(yōu)化方案為：液料比16∶1，提取時間22 min，提取溫度50 ℃。在根據圖表中顯示出的最佳工藝條件，進行3次平行驗證性實驗，進而分別得到的多糖提取率分別為9.36%、8.98%、9.52%，平均值為9.29%，與預測值的相近。由此可知，該模型的預測性良好，此工藝提取黃芪多糖是可靠的，有較大實用價值。

3.3 正交試驗設計優(yōu)化多糖提取工藝

3.3.1 正交試驗設計 參考前期單因素實驗考察結果對黃芪多糖提取率進行實驗設計，用多糖提取率作為正交實驗優(yōu)劣評價指標，分別從提取時間、提取溫度、料液比3個因素對多糖提取率進行影響程度的考察，使用正交試驗法設計多糖提取工藝，設置的因素水平見表7。

3.3.2 試驗結果 L9（33）正交試驗直觀分析結果。見表8。根據R值[14]大小，可得各因素對黃芪多糖提取影響程度大小為：C1（提取液料比）>A1（提取時間）>B1（提取溫度）。

由表9可知，FA1=58.581，FB1=17.928，FC1=73.639，PA1=0.017<0.05，PC1=0.013<0.05，因此可認為因素A1（提取時間）、C1（提取液料比）均有統(tǒng)計學意義，為主要影響因素，PB1=0.053>0.05，因此因素B1（提取溫度）無統(tǒng)計學意義，為次要影響因素，即各因素影響程度大小為C1（提取液料比）>A1（提取時間）>B1（提取溫度）。

R2=0.993（調整后R2=0.974），以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義

3.3.3 正交設計優(yōu)化結果及驗證性試驗 由表9可知，各因素對黃芪多糖提取率影響程度大小為C1（提取液料比）>A1（提取時間）>B1（提取溫度）;結合表8中各因素Ki值[14]確定黃芪多糖最佳提取條件為A1，2、B1，1、C1，2，即提取時間為20 min，提取溫度為40 ℃，提取液料比為15∶1（mL/g）。通過3組平行試驗驗證，得到在最優(yōu)提取條件下多糖提取率分別為9.26%，8.46%，8.70%，平均值為8.81%，與正交試驗結果幾近一致，表明此提取條件穩(wěn)定、可靠。

3.4 優(yōu)化工藝結果比較 由表10可知，SPSS正交實驗法優(yōu)化得出的最優(yōu)黃芪多糖提取條件為：提取時間20 min，料液比15∶1（mL/g），提取溫度40 ℃，黃芪多糖理論預測提取率為9.56%，實際提取率為8.81%，偏差為0.75%。經響應面優(yōu)化得出黃芪多糖最優(yōu)提取條件為：提取時間22 min，提取溫度50 ℃，料液比16∶1（mL/g），黃芪多糖理論預測提取率為9.93%，實際實驗提取率為9.29%，偏差為0.64%。就提取率和偏差度而言，二種優(yōu)化結果均可，具體哪一種更為符合要求需視具體情況和要求而定。

4 討論

4.1 本實驗采用超聲提取法，運用苯酚硫酸法對多糖含量進行測定，作為正交優(yōu)化和響應面優(yōu)化的指標。通過對響應面試驗設計優(yōu)化得出的最佳提取工藝和正交試驗設計優(yōu)化得出的最佳提取工藝的比較，可以看出二種方法優(yōu)化的最優(yōu)工藝條件除溫度相差10 ℃外，其他條件幾乎趨于一致，而且在響應面優(yōu)化和正交實驗優(yōu)化二種優(yōu)化結果中，溫度對提取率的影響小于液料比和時間對提取率的影響，在不考慮生產能耗等問題的情況下，二種優(yōu)化結果均可作為提取工藝的選擇依據。

4.2 就二種優(yōu)化方法而言，與響應面法優(yōu)化比較，正交法優(yōu)化只能得到觀察組中的最佳組合，無法考察或預測觀察組以外的情況[15]。而響應面法建立的二次回歸優(yōu)化模型則能較好預測試驗設置水平之外黃芪多糖的提取率，精確度也略優(yōu)于正交試驗設計法[16]。本實驗中響應面法優(yōu)化的工藝條件下得到的多糖提取率也略大于正交試驗法得到的多糖提取率，從這些方面來看，選擇響應面優(yōu)化結果作為最佳工藝生產條件更為合理，更值得推廣。

4.3 多糖是黃芪藥材的重要活性成分之一，具有多種多樣的生物功效和臨床應用效果，應用前景十分廣闊，具有開發(fā)為新的中藥標準提取物的潛在價值。黃芪多糖提取的方法目前已經普遍運用的有大孔樹脂提取法、水提純沉法、堿水提法、堿醇提法、超微粉碎技術提取等，但都存在耗能高，高級結構容易發(fā)生改變等缺點[17-18]。雖然超聲法單獨提取并不常用，但在能耗方面少于其他方法。以黃芪多糖含量為指標成分的研究報道也較少，水提醇沉法作為一種可取的多糖提取方法，得到了工業(yè)化生產廣泛應用[19]。隨著工業(yè)化生產技術水平的發(fā)展和黃芪多糖利用價值如藥用價值、食用價值、美容價值等的不斷發(fā)展應用，超聲輔助提取黃芪多糖也將成為工業(yè)化生產的選擇方向[4]。本實驗采用超聲法提取、二種優(yōu)化設計方法比較所得到的最優(yōu)黃芪多糖提取條件，可為其提供實驗依據，對黃芪藥材的質量控制也具有重要的意義。

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（2020-07-05收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學基金項目（31860102）;甘肅省自然科學基金項目（18JR3RA185）;甘肅農業(yè)大學盛彤笙科技創(chuàng)新基金項目（GSAU-STS-2037）;甘肅農業(yè)大學人才引進專項（GSAU-RCZX201704）

作者簡介：余萍（1995.05—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中藥分析及質量評價，E-mail：shinianyue@qq.com

通信作者：李欠（1984.02—），女，博士，副教授，研究方向：中藥分析及質量評價，E-mail：liqian1984@gsau.edu.cn