萬壽菊中葉黃素的超高壓提取工藝優(yōu)化

劉冰雪 王玲玲 張曉雪 耿宇婷 康荷笛 趙修華

摘 要：為研究萬壽菊中葉黃素的提取工藝，本研究以東北萬壽菊花為提取原料，采用超高壓法提取萬壽菊花中葉黃素并對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用單因素和響應(yīng)面實驗，考察了4種不同因素料液比、提取次數(shù)、保壓時間及提取壓力對葉黃素提取率的影響，最終得到最佳提取工藝條件為：料液比為1∶95.21（g/mL），提取次數(shù)為4次，保壓時間為3 min，提取壓力為200 MPa，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)實驗，得到葉黃素實際提取率可達(dá)（68.57±2.31） mg/g，與預(yù)測值69.38 mg/g一致。與熱回流提取法和微波-超聲協(xié)同提取法相比，超高壓技術(shù)提取萬壽菊花中葉黃素的提取率可以顯著提高。研究結(jié)果表明，超高壓技術(shù)提取萬壽菊花中的葉黃素提取穩(wěn)定性好、工藝合理可靠，并且重復(fù)性強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：萬壽菊;葉黃素;超高壓提取;工藝優(yōu)化;響應(yīng)面

中圖分類號：R914??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A?? 文章編號：1006-8023（2021）04-0071-08

Optimization of Ultra-High Pressure Extraction Process

for Lutein from Marigold

LIU Bingxue， WANG Lingling， ZHANG Xiaoxue， GENG Yuting， KANG Hedi， ZHAO Xiuhua*

（College of Chemistry， Chemical Engineering and Resource Utilization， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract：In order to study the extraction technology of lutein from marigold， this study used northeast marigold as raw material to extract lutein from marigold by ultra-high pressure method and optimized the extraction technology. The single factor experiment and response surface were used to investigate the effects of four different extraction methods， such as solid-liquid ratio， extraction times， holding time and extraction pressure， on the extraction yield of lutein from marigold. Finally， the optimal extraction conditions were obtained as follows： the solid-liquid ratio was 1∶95.21（g/mL）， the extraction times was 4 times， the pressure holding time was 3 min， and the extraction pressure was 200 MPa. Under these conditions， the experiment was repeated for three times. The actual extraction yield of lutein was（ 68.57±2.31）mg/g， which was consistent with the predicted value of 69.38 mg/g. Compared with thermal reflux extraction and microwave-ultrasonic extraction， the extraction rate of lutein from marigold could be significantly improved by ultrahigh pressure extraction. The results showed that the ultra-high pressure extraction of lutein from marigold was stable， reliable and reproducible， and could be widely used.

Keywords：Marigold; lutein; ultra-high pressure extraction; process optimization; response surface

收稿日期：2021-03-12

基金項目：黑龍江省杰出青年基金項目 （JC2018005）

第一作者簡介：劉冰雪，碩士研究生。研究方向為藥物化學(xué)。E-mail： 792224304@qq.com

*通信作者：趙修華，博士，教授。研究方向為植物化學(xué)與植物藥。E-mail： xiuhuazhao@nefu.edu.cn

引文格式：劉冰雪， 王玲玲， 張曉雪， 等. 萬壽菊中葉黃素的超高壓提取工藝優(yōu)化[J].森林工程， 2021，37（4）：71-78.

LIU B X， WANG L L， ZHANG X X， et al. Optimization of ultra-high pressure extraction process for lutein from marigold [J]. Forest Engineering，2021，37（4）：71-78.

0 引言

葉黃素是自然界中的一種天然色素，屬類胡蘿卜素家族，分子內(nèi)含有多個不飽和雙鍵，從而使其具有較強(qiáng)抗氧化性[1]。葉黃素具有諸多的藥理活性，包括預(yù)防和治療多種疾?。S斑病變、青光眼等）有重要作用[2]，同時也可以增強(qiáng)老年人的認(rèn)知能力。研究顯示，在老年人血清中葉黃素含量越高，海馬旁區(qū)灰質(zhì)越厚，認(rèn)知能力測試表現(xiàn)越好[3]。Cheng 等[4]利用 HPLC 法測定了 8 個萬壽菊品種的葉子和花瓣中所含葉黃素的量，研究表明，葉黃素主要存在于萬壽菊的花瓣中，花瓣中葉黃素的含量是花葉中的 20 倍。萬壽菊原產(chǎn)于墨西哥，現(xiàn)如今遍及中國各地。萬壽菊在東北分布更為廣泛，常做路邊觀賞花卉[5]。

由于葉黃素用途廣泛，對其研究愈加深入。已研究的提取方法有熱浸提法[6]、超聲-微波輔助提取法[7]、酶提取法[8]、超臨界萃取法[9]等。熱浸提法因為提取溫度高，容易熱解易失活。超聲-微波輔助提取法具有高效率的優(yōu)點，但工業(yè)批量生產(chǎn)難以實現(xiàn)。酶提取法其操作雖然簡單，但耗時過長的缺點無法解決。超臨界萃取法，雖得到提取物的純度高，但設(shè)備造價高、操作難度大、耗能高及提取成本高等缺點至今無法克服。超高壓提取技術(shù)其原理為：其媒介為水或流體，在一定時間用較大的壓強(qiáng)（≥100MPa）去破壞植物細(xì)胞壁，釋放目標(biāo)活性物質(zhì)[10]。與其他技術(shù)相比，超高壓技術(shù)具有耗能低、提取時間短、效率高以及對生物活性影響小等優(yōu)點[11]。李彥煒[12]采用超高壓技術(shù)，對黃精多糖進(jìn)行提取，最終提取率高達(dá)74.14%，同時，蘇可盈等[13]提取黑茶中的物質(zhì)采用了超高壓和熱回流2種提取方法，結(jié)果顯示，超高壓提取法提取率為13.57%～14.22%，高于熱水提取法的提取率（10.45%～12.45%），超高壓法提取結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)熱回流法。綜上所述，超高壓技術(shù)提取是一種有效的提取手段。目前，超高壓法提取葉黃素的方法還未曾報道。本實驗以萬壽菊為原料，以葉黃素提取率為評價指標(biāo)，以單因素實驗結(jié)果為前提， 確定響應(yīng)面優(yōu)化參數(shù)，實現(xiàn)對超高壓法提取萬壽菊中葉黃素的工藝優(yōu)化。

1 研究方法

1.1 材料

萬壽菊干花購于河北省安國市御顏坊中藥材有限公司，產(chǎn)地為河北。葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（90%）購于上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇（分析純） 、丙酮（分析純）、乙腈（色譜純）和正己烷（分析純） 購于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;乙酸乙酯（分析純） 購于瑞達(dá)化工商行化工有限公司;甲醇（色譜純） 購于山東禹王實業(yè)有限公司;去離子水為實驗室自制;真空密封袋（16絲）購于河北永賀塑料包裝制品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.W1-400/1 超高壓設(shè)備：天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司;標(biāo)準(zhǔn)篩 60目;2489 型高效液相色儀：美國 Waters 公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：德州市昊誠實驗儀器有限公司;P-290 真空封口包裝機(jī)：瑞安市貴澤電子商務(wù)商行。

1.3 方法

1.3.1 超高壓提取流程

萬壽菊干花粉碎后過60目篩。稱取1 g粉末于密封袋中，并加入一定體積（料液比為1∶20～1∶120 （g/mL））的試劑（氯仿、乙酸乙酯、正己烷、甲醇和乙醇）于密封真空袋，混勻放入提取容器中。調(diào)節(jié)參數(shù)值（提取壓力：50～300 MPa;保壓時間：1～6 min;提取次數(shù)：1～6 次）進(jìn)行提取。取出高壓處理后的料液，抽濾。為獲得提取液中以其他形式存在的葉黃素，對提取液進(jìn)行皂化。皂化參數(shù)參考孟繁玲等[14]的方法，用1 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氫氧化鈉溶液與其混合，加入氫氧化鈉溶液與提取液體積比為1∶10，避光60 ℃恒溫水浴1 h，于皂化結(jié)束時用冰乙酸將溶液調(diào)至中性。

1.3.2 篩選提取溶劑

提取溶劑對工藝的影響重中之重[15]。本研究對萬壽菊干花中葉黃素提取工藝中的提取溶劑進(jìn)行篩選，本著對葉黃素溶解性好、沸點低且價格低廉的目的，以氯仿、乙酸乙酯、正己烷、甲醇和乙醇5種溶劑作為提取溶劑，以萬壽菊中葉黃素提取率為最終目的進(jìn)行考察。

稱量5份萬壽菊粉末，每份1 g，分別加入40 mL的氯仿、乙酸乙酯、正己烷、甲醇和乙醇于真空袋中。置于提取容器內(nèi)，設(shè)定參數(shù)值：壓力100 MPa，循環(huán)3次，保壓時間為3 min，進(jìn)行高壓提取。待處理后得葉黃素提取液。

1.3.3 單因素實驗設(shè)計

經(jīng)預(yù)實驗，將保壓時間、提取壓力、循環(huán)次數(shù)和料液比進(jìn)行單因素優(yōu)化。具體優(yōu)化考察范圍及水平設(shè)定見表1。

1.3.4? 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

在上述實驗結(jié)果上，采用響應(yīng)面軟件，進(jìn)行了4個因素的響應(yīng)面實驗設(shè)計，其參數(shù)見表2。建立數(shù)學(xué)模型，以得到最佳工藝。

1.3.5 傳統(tǒng)提取對比實驗

（1）熱回流提?。悍Q量粉末1 g，料液比1∶40 （g/mL），提取溶劑為乙醇，加熱回流4 h，抽濾，皂化處理。得葉黃素提取液

（2）微波-超聲協(xié)同提取：稱量粉末1 g，料液比1∶40（g/mL），提取溶劑為乙醇，50 ℃超聲提取0.5 h后，抽濾，皂化處理，得葉黃素提取液。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1）HPLC法測定葉黃素條件：色譜柱選用 Diamonsil C18 反相柱（200 mm×4.6 mm×5 μm）;波長為445 nm;流動相比例是甲醇與乙腈的比為80∶20;流動相流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL[16]。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備：稱量10 mg葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中用甲醇溶解并定容，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品母液。采用對半稀釋法，配得質(zhì)量濃度為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述HPLC檢測方法進(jìn)行測定，X為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度 （mg/mL），Y為峰面積，計算分析得到其回歸方程為：Y=2×107X+75 333，R2=0.999 8，線性范圍為0～1 mg/mL。

1.3.7 提取率計算

按上述處理得到的葉黃素提取液，經(jīng)HPLC法檢測其濃度。葉黃素提取率公式為：

提取率=提取液中葉黃素的質(zhì)量（mg）投入萬壽菊干花的質(zhì)量（g）×100% 。? （1）

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑篩選結(jié)果

本研究對5種提取試劑進(jìn)行篩選。在同等條件下進(jìn)行提取，對比不同溶劑對提取實驗結(jié)果的影響，實驗結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，其影響由大到小順序為：氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、正己烷。其中提取率表現(xiàn)最優(yōu)的3種溶劑為氯仿、乙酸乙酯和乙醇，提取率分別為25.64%、23.8%、22.67%，對比這些提取率結(jié)果相差不大。這3種溶劑比較，就有機(jī)試劑的毒性而言，乙醇為三者中最小，價格相對便宜且來源廣，易回收可反復(fù)使用[17]?；谏鲜鲈颍_定乙醇為提取溶劑。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

按照上述實驗方法，分析了料液比、保壓時間、提取壓力及提取次數(shù)4個因素對萬壽菊中葉黃素提取率的影響。試驗結(jié)果如圖2所示。

由圖2（a）可知，在料液比從1∶20 （g/mL）提高到1∶120 （g/mL），葉黃素提取率隨著料液比的升高呈先升高后趨于平緩。料液比的變化對于提取原料中葉黃素的結(jié)果影響較大，較小的料液比無法將原料中的葉黃素完全提取出來，故在較小料液比時葉黃素的提取率較小。而當(dāng)料液比1∶80 （g/mL）時，料液比足夠大，可將原料中的有效成分完全提取出來，所以在料液比進(jìn)一步增大時，對提取率的結(jié)果影響不大。故料液比進(jìn)一步優(yōu)化范圍為1∶60～1∶100 （g/mL）。

由圖2（b）可知，當(dāng)保壓時間從1 min提高到6 min時，葉黃素提取率隨保壓時間的升高呈先升高后幾乎不變。保壓時間5 min到6 min其結(jié)果不變。保壓期間高壓設(shè)備對物料持續(xù)施加壓力，保壓時間過短，有可能造成提取溶劑對原材料浸潤不充分或細(xì)胞有效成分無法擴(kuò)散到提取溶劑中，但保壓時間過長，則會浪費大量能耗。故選擇保壓時間進(jìn)一步優(yōu)化范圍為3～5 min。

由圖2（c）可知，在提取壓力從50 MPa提高到300 MPa，葉黃素提取率隨著提取壓力的升高呈先升高后趨于平緩。提取壓力150 MPa后在升高提取壓力時，葉黃素提取率基本維持穩(wěn)定。這可能是萬壽菊干花粉末質(zhì)地較為細(xì)膩、疏松，再經(jīng)歷超高壓處理時葉黃素已擴(kuò)散至溶劑中。通俗來說，提取壓力越大，提取率越高，但當(dāng)提取率達(dá)到臨界值時，過高的壓力只會造成資源的浪費，且可能導(dǎo)致提取材料結(jié)構(gòu)損壞，影響提取效率。故選擇料液比進(jìn)一步優(yōu)化范圍為100～200 MPa。

由圖2（d）可知，在提取次數(shù)從1 次提高到6 次，葉黃素提取率隨提取次數(shù)的升高呈先升高后稍有降低。提取次數(shù)為3 次時，葉黃素提取率達(dá)到峰值。隨提取次數(shù)再增加，葉黃素提取率稍有下降，說明提取次數(shù)過多可能對葉黃素結(jié)構(gòu)具有一定的破壞性。故選提取次數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化范圍為2～4 次。

2.3 實驗參數(shù)設(shè)計及結(jié)果

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，利用 Box-Behnken 中心組合設(shè)計原理，進(jìn)行分析試驗，考察料液比（A）、提取壓力（B）、保壓時間（C）和提取次數(shù)（D）對葉黃素提取率（R）影響，結(jié)果見表3。

2.3.1 實驗結(jié)果擬合

回歸方程的建立與顯著性檢驗。利用 Design-Expert 8.0.6軟件， 通過對多項式回歸分析，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：

Y=62.66+5.30A+6.45B+0.012C+0.44D+1.15AB-0.38AC-0.21AD+0.19BC-0.25BD-0.29CD-4.23A2-2.71B2+0.030C2+0.073D2。

根據(jù)建立的模型進(jìn)行方差分析和顯著性的檢驗，方程顯著性檢驗分析結(jié)果見表4。回歸模型的F值為161.39，研究表明：Pr>F的概率小于0.000 1時，說明該模型符合極顯著標(biāo)準(zhǔn)，Pr>F的概率小于0.05即視為模型顯著，因此A、B、D、AB、A2、B2對葉黃素提取率的影響顯著。利用 Design-Expert 8.0.6軟件， 通過對多項式回歸分析，得到的擬合全變量二次回歸方程模型中回歸決定系數(shù)R2值為0.993 8，校正決定系數(shù)R2（Adj）值為0.987 7，計算結(jié)果表明，該模型擬合度好，該響應(yīng)面適合本研究內(nèi)容的后續(xù)優(yōu)化和設(shè)計。

2.3.2 兩因素間的交叉作用

圖3為不同因素的交互作用對回收率的影響，響應(yīng)曲面越陡峭，表明該因素對回收率的影響越大[18]。從圖3可知，回收率的響應(yīng)曲面向下開口，其關(guān)系呈現(xiàn)明顯二次拋物，且隨著各因素參數(shù)值的增大，提取率逐漸升高，并出現(xiàn)極大值，隨后呈不同斜率的下降，另從方差分析及結(jié)果中可知，AB曲線變化最為密集陡峭，其次為AC，影響最小為BC。

2.3.3 驗證試驗

由響應(yīng)面結(jié)果分析，得到的最優(yōu)條件為：料液比為1∶95.21 （g/mL），提取次數(shù)為4次，保壓時間為3 min，提取壓力為200 MPa。在此條件下驗證模型的有效性，并與傳統(tǒng)熱回流法和超聲-微波協(xié)同提取法進(jìn)行比較，試驗重復(fù)3次。結(jié)果顯示，傳統(tǒng)熱回流法提取率為14.26±0.45 mg/g、超聲-微波協(xié)同提取法提取率為9.73±0.66 mg/g、超高壓輔助提取葉黃素的提取率為68.57±2.31 mg/g。試驗結(jié)果與軟件得出的最優(yōu)預(yù)測值69.38 mg/g相近。對比結(jié)果表明，超高壓輔助提取法顯著優(yōu)于傳同回流法和超聲-微波輔助提取法。在所得模型的擬合下程度較好，該工藝穩(wěn)定性好、重復(fù)性強(qiáng)。

3 結(jié)論

在本研究中，超高壓提取技術(shù)與熱回流提取法、微波-超聲協(xié)同提取法進(jìn)行對比，以葉黃素提取率為參考值，其結(jié)果顯著提高。這一結(jié)果表明，超高壓提取技術(shù)快速高壓破壁的原理，更利于破壞植物細(xì)胞壁，釋放目標(biāo)產(chǎn)物。大大縮短提取時間，也有效地避免由熱效應(yīng)引起的結(jié)構(gòu)異化、損失及降低活性[18]。同時也大大減少了能量損耗。本研究以萬壽菊干花為原料，采取超高壓技術(shù)提取萬壽菊中的葉黃素，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面分析法，確定了超高壓技術(shù)提取萬壽菊中葉黃素的最佳工藝條件為：料液比為1∶95.21（g/mL），提取次數(shù)為4次，保壓時間為3 min，提取壓力為200 MPa，此條件下進(jìn)行3次重復(fù)實驗，葉黃素實際提取率可達(dá)（68.57±2.31）mg/g。說明超高壓技術(shù)對有萬壽菊中葉黃素的提取穩(wěn)定性好、重復(fù)性強(qiáng)。本試驗為提取葉黃素提供了一種新的方法。

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