汞中毒模型建立及中藥干預(yù)試驗(yàn)

黃精貴 黃小娟 梅金鈺 黃鷗飛 李文仕

摘要：目的 探討中藥綠豆及其復(fù)方海爾福清千口服液對(duì)汞中毒小鼠于預(yù)效果的實(shí)驗(yàn)研究。方法 用小白鼠復(fù)制汞中毒動(dòng)物模型，然后用中藥灌胃干預(yù)，測定各種指標(biāo).用氯化汞（HgCl2）注射小鼠腹腔染毒，2周，然后用綠豆水提取液及其復(fù)方海爾福清千口服液灌胃干預(yù)2周.測定染毒前后及干預(yù)后的血紅蛋白含量;實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取血分離血清測定，處死小鼠，取大腦，制備10%勻漿待測.其余器官肝，腎，生殖器，用甲醛浸泡送病理研究（另文）.結(jié)果下面按1綠豆組，2清千組，3模型組，4正常組，依次排列，血紅蛋白（Hb）含量，染毒前：各組間比較，F(xiàn)=1.605，p=0.203，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。染毒后：依次排列146.28±19.40▲▲a164.39±13.95▲★a152.26±31.94▲▲c183.63±16.96★★各組間比較，F(xiàn)=6.369，p=0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;中藥干預(yù)后，依次排列為121.61±13.53▲▲b137.52±15.41▲▲★b145.43±19.17▲▲★★b171.13±17.12★★中藥干預(yù)后：各組間比較，F(xiàn)=16.635，p=0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;腦（chAT）活力，26.00±8.82★★69.91±35.52★▲78.98±24.89★▲122.42±45.36▲▲：F=8.853，P=0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;腦（GSH-PX）活力，142.89±23.38★★126.48±8.11▲113.75±15.82▲▲149.71±22.93★★差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;腦超氧陰離子自由基（）清除率%，汞中毒明顯下降;結(jié)論 綜合分析，汞中毒小鼠，血紅蛋白、體重、大腦部分與記憶相關(guān)的關(guān)鍵酶活力，均明顯下降;中藥干預(yù)后有一定恢復(fù)，以海爾福清千口服液更顯著一些。

關(guān)鍵詞：汞中毒 ; 小鼠 ; 綠豆; 海爾福清千口服液 ; 干預(yù)

【中圖分類號(hào)】R995 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2021）08-014-02

汞在工業(yè)上有重要的用途，據(jù)報(bào)導(dǎo)統(tǒng)計(jì)有3000多種，但在工業(yè)生產(chǎn)過程中容易造成環(huán)境污染，是環(huán)境污染主要毒物之一。汞中毒損害機(jī)體重要器官，如腎臟，造血系統(tǒng)，生殖系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)，等[1]。本實(shí)驗(yàn)主要探討汞對(duì)記憶有關(guān)的關(guān)鍵酶活性的影響，以及中藥具有解毒作用的綠豆及其復(fù)方制劑對(duì)其干預(yù)治療作用的探討。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)導(dǎo)如下。

1. 試劑與方法：

1.1試劑. 乙酰膽堿酯酶（AchE）測試盒、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（chAT）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX），測試盒、甘油三酯、總膽固醇、尿素氮測定試劑盒、總蛋白測定試劑盒。1-奈胺、鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸（HCL）、高鐵氰化鉀、氰化鉀、無水磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉，過硫酸銨， 氯化汞，均為國產(chǎn)分析純。

1.2中藥綠豆干品，購自市面，制取流程：稱取中藥放鍋內(nèi) 加自來水20倍加熱煮沸40分鐘過濾加熱濃縮冷卻 加3倍量v/v95%乙醇沉淀過夜過濾棄沉淀回收乙醇藥液定容裝瓶105℃高壓消毒30 分鐘 . 常溫，保存待用。復(fù)方海爾福清千口服液由廣西云球生物科技有限公司研發(fā)部提供， 由綠豆、銀花、茯苓、甘草.等組成[2].

1.3動(dòng)物， 小白鼠40只，昆明種（SPF級(jí)），健康，雌雄各半，鼠齡40天平均體重30克。購自湖南省長沙市天勤生物技術(shù)有限公司， 物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）209-0014. 質(zhì)量檢測單位， 湖南省動(dòng)檢二站，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)單位：右江民族醫(yī)學(xué)院，使用許可證號(hào)：SYXK桂2011-0010。）.放空氣凈化鼠架裝置內(nèi)，分籠喂養(yǎng)，每籠6只，雌雄分開，由學(xué)院動(dòng)物室提供用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲用自來水。

1.4實(shí)驗(yàn)方法：

用健康小白鼠40只，分成4組，（1）、（2）、（3）為造模組，另設(shè)（4）為正常對(duì)照組.每組10只.用100mg/dl濃度HgCl2水溶液給小鼠腹腔注射染毒[3]，每日一次，染毒 10 天后， （1綠豆組）、（2清千組）組開始分別用中藥綠豆提取液和海爾福清千口服液（綠豆、銀花、茯苓、甘草復(fù)方液）作灌胃干預(yù)，以成人量折算， 劑量為0.1mL/只，每日一次，（3模型組）、（4正常對(duì)照組）組用等體積的蒸餾水灌胃，連續(xù)實(shí)驗(yàn)30日結(jié)束.測定染毒前， 染毒后，中藥灌胃干預(yù)后血紅蛋白（Hb）. 結(jié)束從眼球后取血， ，分離血清， 測定生化指標(biāo)：血清甘油三酯、總膽固醇、尿素氮、總蛋白參照文獻(xiàn)說明書測定;處死小鼠，取出大腦，稱重，在冷凍下研磨， 用生理鹽水制備10%腦組織勻漿，離心3000rpm，10min，后取上清液，放冰箱備用。

1.5測定方法

血紅蛋白（Hb）測定采用氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）法，參照文獻(xiàn)[3]。測定腦勻漿乙酰膽堿酯酶（AchE）、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（chAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX），活力。Tc用COD-CE-PAP測定;TG用GPO-OAO法測定;尿素氮用脲酶波氏法測定;AchE根據(jù)乙酰膽堿在AchE催化下產(chǎn)生乙酸和膽堿，膽堿再與巰基顯色劑作用產(chǎn)生黃色化合物TNB（對(duì)稱三硝基苯），比色測定;具體操作按試劑盒說明書;清除率測定利用比色法[6]，其原理： 由A液中三羥甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）與B液中過硫酸銨混合后，產(chǎn)生氧自由基（），經(jīng)鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、1-奈胺等連續(xù)反應(yīng)， 產(chǎn)生一種黃色產(chǎn)物， 可以比色測定。具體操作參考文獻(xiàn)[4]。乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（chAT）測定是以乙酰輔酶A和膽堿為底物，在chAT催化下，反應(yīng)的生成物與顯色劑結(jié)合，在324nm處有吸收峰，以此測定并計(jì)算chAT活力. 具體操作按試劑盒說明書。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS軟件（13.0版）統(tǒng)計(jì)，多組均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05。結(jié)果用（）表示。

2.結(jié)果

2.1一般情況.共用小鼠40只， 雌性 20 只，雄20只，4組每組10只. 綠豆組死亡2只， 模型組死亡2只， 清千組和正常對(duì)照組無死亡。

2.2染毒前， 染毒后，中藥灌胃干預(yù)后小鼠血紅蛋白（Hb）含量測定結(jié)果。 結(jié)果顯示，組間比較， 染毒前，小鼠血紅蛋白（Hb） 各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。染毒后，正常組明顯高于其他各組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥干預(yù)后， 正常組明顯高于其他各組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

方差分析：組間比較;血紅蛋白Hb， 染毒前：各組間比較， F=1.605， p=0.203， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。染毒后： 各組間比較， F=6.369， p=0.001，與正常組比較， ▲P<0.05， ▲▲P<0.01; 與綠豆組比較， ★P<0.05， ★★P<0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。中藥干預(yù)后： 各組間比較， F=16.635， p=0.0010，與正常組比較， ▲P<0.05， ▲▲P<0.01; 與綠豆組比較， ★P<0.05， ★★P<0.01; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。

組內(nèi)染毒前 、染毒后、中藥干預(yù)后（前中后）比較;綠豆組（前中后）比較，F(xiàn)=32.267， p=0.000，與中藥干預(yù)后比較，a P<0.01; 與染毒后比較，b P<0.01; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。清千組（前中后）比較，F(xiàn)=26.473， p=0.000，與中藥干預(yù)后比較，a P<0.01; 與染毒后比較，b P<0.01; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。模型組（前中后）比較，F(xiàn)=6.208， p=0.006，與染毒前比較，c P<0.05; b P<0.01; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。正常組（前中后）比較，F(xiàn)=2.155， p=0.135，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。

2.3腦乙酰膽堿酯酶（AchE），乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（chAT）， 腦谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力測定結(jié)果. 結(jié)果顯示， 腦乙酰膽堿酯酶（AchE）， 組間比較： 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（chAT）， 組間比較： 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 腦（GSH-PX）活力， 組間比較： 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 見表2。

方差分析：組間比較： 腦乙酰膽堿酯酶（AchE）活力：F=0.269，P=0.847， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。; 腦（chAT）活力， ：F=8.853，P=0.001， 與正常組比較， ★P<0.05， ★★P<0.01; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 與綠豆組比較， ▲P<0.05， ▲▲P<0.01， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 腦（GSH-PX）活力，與正常組比較， ▲P<0.05， ▲▲P<0.01; 與模型組比較， ★★P<0.01; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;

2.4腦超氧陰離子自由基（）清除率%、血清超氧陰離子自由基（）清除率%，血清總蛋白測定結(jié)果. 結(jié)果顯示， 腦超氧陰離子自由基（）清除率%、組間比較： 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 血清超氧陰離子自由基（）清除率%， 組間比較： 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;，血清總蛋白， 組間比較：，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義.見表3.

方差分析：組間比較： 腦自由基（）（清除率% ）：F=42.14，P=0.000， 與正常組比較，▲▲P<0.01， 與清千組比較， ★★P<0.01， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 血清自由基（）（清除率% ）， 組間比較： F=2.883，P=0.061差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 血清總蛋白， F=10.585，P=0.000， 與正常組比較， ★★P<0.01， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;

2.5小鼠血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、尿素氮含量測定結(jié)果. 結(jié)果顯示，組間比較， 血清甘油三酯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 總膽固醇（TC）， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 尿素氮，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5 。

方差分析：方差分析：TG， 各組間比較，F(xiàn)=9.474，p=0.000， 與正常組比較，▲▲P<0.01， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 總膽固醇（TC）， 各組間比較，F(xiàn)=0.449，p=0.685， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 尿素氮， 各組間比較，F(xiàn)=2.742，p=0.056，與清千組比較，★P<0.05， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;

2.2染毒前、染毒后、中藥干預(yù)后小鼠體重測定結(jié)果. 結(jié)果顯示， 造模前、治療前，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 治療后，各組間比較， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;

方差分析：小鼠體重， 組間比較， 染毒前：各組間比較， F=0.119， p=0.948， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。染毒后， F=6.040，p=0.002， 與組間比較， 與正常組比較，▲▲P<0.01， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 中藥干預(yù)后：各組間比較， F=2.350， p=0.089， 與正常組比較， ▲P<0.05， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;

組內(nèi)前中后比較， 綠豆組，染毒前， 染毒后， 中藥干預(yù)后（前中后）比較， F=3.677， p=0.035，與染毒后比較， aP<0.05， 中藥干預(yù)后明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 清千組（前中后）比較， F=9.757， p=0.001， 與染毒后比較， b P<0.01， 染毒后明顯下降，中藥干預(yù)后明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 模型組（前中后）比較， F=0.428 p=0.656，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 正常組（前中后）比較， F=0.700 p=0.505，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;

3討論

3.1本次實(shí)驗(yàn)染毒 10 天，綠豆組死亡2只， 模型組死亡2只， 清千組和正常對(duì)照組無死亡。

3.2造模后血紅蛋白下降，說明造血系統(tǒng)受到損害。汞對(duì)造血系統(tǒng)的抑制作用，主要對(duì)血紅素合成過程中關(guān)鍵酶的抑制，造成血紅素減少引起貧血[6]。

3.3腦乙酰膽堿酯酶（AchE），乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（chAT），是大腦中與記憶有關(guān)的關(guān)鍵酶，為科學(xué)界普遍公認(rèn)，它們存在于大腦神經(jīng)細(xì)胞中，主要分布在海馬部位和皮層，乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶催化合成神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，而乙酰膽堿酯酶則催化乙酰膽堿分解，它們的活性維持著乙酰膽堿合成與分解的平衡，從而維持著神經(jīng)傳導(dǎo)正常進(jìn)行和記憶。本實(shí)驗(yàn)表明，染毒小鼠乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性明顯下降，催化乙酰膽堿合成減少，而乙酰膽堿酯酶活性沒有降低，催化乙酰膽堿分解沒有降低，勢必造成神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿減少而影響記憶功能[7]。

3.4其他，腦（GSH-PX）活力和腦超氧陰離子自由基（）清除率%、。（GSH-PX）活力是機(jī)體清除超氧陰離子自由基（）重要的酶[4]，汞中毒小鼠模型組（GSH-PX）活力明顯降低，低于正常組，表明清除超氧陰離子自由基（）能力下降，而另一實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，超氧陰離子自由基（）清除率%汞中毒組降低則證明了這點(diǎn)。而中藥干預(yù)組在模型組與正常組之間，表明清除超氧陰離子自由基（）能力已明顯提升，綠豆組己接近正常組正常組。

3.5其他，從血清尿素氮含量表明，模型組最高，其次是綠豆組，最低是清千組，說明模型組腎臟排泄功能受到一定損害，而清千組保護(hù)腎臟排泄功能最好，血清尿素氮含量還低于正常組。體重變化表明，染毒三個(gè)組染毒后有降低，正常組沒有變化，中藥干預(yù)后有回升，由于后階段己停止染毒，所以模型組體重也緩慢升高，但較慢。正常組體重一直在升高，但由于時(shí)間僅30天，沒有太大變化。血清總膽固醇（TC）各組間差異無顯著性，而甘油三酯（TG）正常組明顯高于染毒三個(gè)組，血清蛋白染毒組還高正常組，表明汞染毒損害了肝臟對(duì)甘油三酯代謝，而對(duì)肝臟膽固醇代謝、蛋白代謝尚未損害到，一般認(rèn)為，肝臟代償能力較大，損害較嚴(yán)重時(shí)才引起蛋白異常。有關(guān)這方面的解釋，還需進(jìn)一步探討。

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第一作者：黃精貴，女，出生年月：1998年02月。右江民族醫(yī)學(xué)院2017級(jí)藥學(xué)本科班學(xué)生。通訊作者：李文仕，副主任藥師，E-mail： sqzhang224@163.com