經(jīng)方甘草干姜湯成分的快速分析及其治療呼吸系統(tǒng)疾病的作用

牛 璐李偉霞 張 輝王曉艷張明亮陳毓龍?zhí)七M(jìn)法

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州450046； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥臨床評(píng)價(jià)技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450000； 3.河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州450046）

甘草干姜湯是《金匱要略》 中記載的一首經(jīng)方，由炙甘草（12 g）和炮姜（6 g）兩味中藥組成，主治肺痿咳吐涎沫［1］?！督饏T要略講義·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治第七》第五條言，“肺痿吐涎沫而不咳者，其人不渴，必遺尿，小便數(shù)，所以然者，以上虛不能制下故也。此為肺中冷，必眩，多涎唾，甘草干姜湯以溫之”［2］。方中炙甘草和炮姜配伍，干姜辛溫能走能受，溫中回陽，溫肺化痰，偏治里寒，炮焦，有溫經(jīng)止血功效；配炙甘草，補(bǔ)脾益氣，祛痰止咳，緩急止痛，辛從甘化，能受中復(fù)陽。兩藥合用，一補(bǔ)脾胃之虛，一復(fù)中焦之陽，使中陽得運(yùn)，統(tǒng)攝有權(quán)，則吐血可止［3］。共同起到益氣、溫陽、化痰、止血的功效［4］。該方藥簡(jiǎn)力宏，今人多認(rèn)為此方有“培土生金”之妙，是現(xiàn)代臨床治療肺痿、哮喘、眩暈、尿頻等病證常用的基本方［5］。但目前有關(guān)甘草干姜湯的研究多集中在臨床觀察方面，而物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的研究報(bào)道較少［6?9］。故本研究擬采用超高液相色譜?四級(jí)桿?飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra?performance liquid chromatography?quadrupole?time of flight?mass spectrometry，UPLC?Q?TOF／MS）技術(shù)結(jié)合UNIFI 數(shù)據(jù)庫對(duì)甘草干姜湯中化學(xué)成分進(jìn)行快速分析，基于此，進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)甘草干姜湯治療呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病（肺纖維化、間質(zhì)性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病、哮喘）的作用機(jī)制進(jìn)行探討，以期為甘草干姜湯的質(zhì)量控制、體內(nèi)過程分析及作用機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)，也為甘草干姜湯在臨床的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters AcquityTMUPLC 液相系統(tǒng)；Xevo G2?XS QTof 質(zhì)譜儀，配有 Lock?spray 接口，電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），MassLynx v4.1 質(zhì)譜工作站；ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；XS105DU型十萬分之一天平（瑞士梅特勒?托利多集團(tuán)）；Neofuge 1600R型臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；KQ?100DE型數(shù)顯超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 乙腈（批號(hào)JB086630）和甲醇（批號(hào)10999607909）為色譜純?cè)噭?，購自德?guó)Merck 公司；甲酸（批號(hào)3257145）色譜純?cè)噭?，購自北京迪馬科技有限公司；亮氨酸腦啡肽（批號(hào)W15071909）購自美國(guó)Waters 公司；其他試劑均為分析純。炙甘草（批號(hào)19120101）購自鄭州瑞龍制藥股份有限公司，炮姜（批號(hào)190901）購自安徽石田中藥飲片有限公司；經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部陳天朝主任藥師鑒定，均符合2015年版《中國(guó)藥典》（一部）炙甘草、炮姜項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)［10］。

對(duì)照品10?姜酚（批號(hào)CHB180311）、橙皮苷（批號(hào)CHB180523）、甘草酸（批號(hào)CHB180610）、絡(luò)石苷元（批號(hào)CHB190106）、蒙花苷（批號(hào)CHB180120）、野黃芩苷（批號(hào)CHB180629）、木犀草苷（批號(hào)CHB180111）購自成都克洛瑪生物科技有限公司；補(bǔ)骨脂定（批號(hào)16042601）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（批號(hào)16060103）、補(bǔ)骨脂寧（批號(hào)160422）、川續(xù)斷皂苷乙（批號(hào)150922）、大豆苷（批號(hào)17040603）、大豆苷元（批號(hào)17122504）、大黃素甲醚（批號(hào)141214）、槲皮苷（批號(hào)151016）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；丹酚酸B（批號(hào)P10A8F41491）、冬凌草乙素（批號(hào)Z13A7S13006）、地膚子皂 苷 IC（批號(hào)P15M6F2）、丹參酮Ⅰ（批號(hào)P20J8F40359）購自上海源葉生物科技有限公司；甘草次酸（批號(hào)lw19090603）、甘草素（批號(hào)lw19052203）和芒柄花素（批號(hào)lw18022712）購自南京良緯生物科技有限公司；甘草苷（批號(hào)PRF8110742）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；特女貞苷（批號(hào)111926?201404）購自中國(guó)食品藥品檢定研究院，以上所有對(duì)照品純度均≥98.0%。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 將炙甘草、炮姜飲片打粉，過80 目篩，精確稱取炙甘草粉末1.030 2 g、炮干姜粉末0.499 0 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入30 mL 50%甲醇，超聲提取1 h（功率100 W，頻率40 kHz），靜置后吸取上清液1 mL，于離心機(jī)14 000 r／min 離心10 min，吸取上清液100 μL待分析。

2.2 對(duì)照品溶液制備分別精密稱定對(duì)照品10?姜酚、橙皮苷、甘草酸、絡(luò)石苷元、蒙花苷、野黃芩苷、木犀草苷、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂寧、川續(xù)斷皂苷乙、大豆苷、大豆苷元、大黃素甲醚、槲皮苷、丹酚酸B、冬凌草乙素、地膚子皂苷IC、丹參酮Ⅰ、甘草次酸、甘草素、芒柄花素、甘草苷和特女貞苷，加甲醇分別制備成質(zhì)量濃度分別為520、420、640、380、208、332、304、298、284、306、420、338、420、360、260、220、204、300、282、420、340、272、296、220 μg／mL 的對(duì)照品貯備液。

2.3 數(shù)據(jù)采集與處理

2.3.1 色譜條件 流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫（0～1 min，20% B；1～24 min，20%～80% B；24～25 min，80%～100% B；25～27 min，100% B；27～27.5 min，10%～100% B；27.5～30 min，10% B）；柱溫40 ℃；體積流量0.3 mL／min；進(jìn)樣量2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 ESI 源，以MSEContinuum 模式在負(fù)離子條件下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。毛細(xì)管電壓2.5 kV；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度250 ℃；錐孔電壓40 V；錐孔氣體積流量50 L／h；脫溶劑體積流量600 L／h；碰撞能量（10～45 V）；間隔掃描時(shí)間0.1 s。質(zhì)量掃描范圍50～1 200m／z。準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用亮氨酸?腦啡肽（1eucine?enkephalin，ESI－m／z554.261 5）溶液為鎖定質(zhì)量溶液，采用甲酸鈉溶液對(duì)儀器質(zhì)量軸進(jìn)行校正。

2.3.3 成分分析 查閱在線和離線數(shù)據(jù)庫（PubMed、TCMSP、Chemical book、Chemspider、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫等）及相關(guān)文獻(xiàn)，收集甘草干姜湯中單味藥的化學(xué)成分信息，主要包括化合物英文名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式，自建甘草干姜湯成分?jǐn)?shù)據(jù)庫（EXCEL），導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI 數(shù)據(jù)庫。將采集的甘草干姜湯質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI 軟件中，建立過濾篩選方法，設(shè)置質(zhì)量誤差為5×10－6，保留時(shí)間誤差為0.1 min，響應(yīng)值＞5 000，將甘草干姜湯的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與所建數(shù)據(jù)庫進(jìn)行自動(dòng)匹配，結(jié)合對(duì)照品保留時(shí)間及文獻(xiàn)信息進(jìn)一步進(jìn)行確認(rèn)，并進(jìn)行成分歸屬。

2.4 甘草干姜湯中活性成分及呼吸系統(tǒng)疾病靶點(diǎn)的收集和匹配 首先基于成分分析結(jié)果，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平 臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug?likeness，DL）≥0.18，對(duì)甘草干姜湯中活性化合物進(jìn)行篩選；然后通過TCMSP 及Swiss Target Prediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch）數(shù)據(jù)庫對(duì)甘草干姜湯中活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

在疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫（genetic association database，GAD）、治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD）（http：／ ／bidd.nus.edu.sg／group／ttd，TTD）和基因名片數(shù)據(jù)庫（Gene Cards） （http：／ ／www.genecards.org／）等對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病肺纖維化（Pulmonary fibrosis）、間質(zhì)性肺疾病（Interstitial lung disease）、慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease）、哮喘（Asthma）的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

所有靶點(diǎn)通過Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.Unitprot.org／）將蛋白名轉(zhuǎn)換成基因名后，采用維恩圖對(duì)甘草干姜湯活性成分靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，得到成分?疾病共有靶點(diǎn)。

2.5 京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路富集和基因本體論（Gene_ Ontology，GO）生物功能分析 將甘草干姜湯活性成分與疾病共有靶標(biāo)輸入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（https：／ ／david.ncifcrf.gov／ conversion.jsp），進(jìn)行KEGG 通路分析和GO 富集分析。KEGG 通路篩選以p?value＜0.05 為限制條件。GO 富集分析，包括生物過程（BP，Biological Process）、分子過程（MF，Molecular Function）和細(xì)胞組成（CC，Cellular Component）3個(gè)部分，以p?value＜0.05 為限制條件。結(jié)合基迪 奧云平臺(tái)（Omicshare 數(shù)據(jù)庫）（http：／ ／www.omicshare.com／ tools／index.php／）將篩選條目制作成高級(jí)氣泡圖。

2.6 成分?靶點(diǎn)?疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用生物信息分析軟件Cytoscape 3.6.1 構(gòu)建甘草干姜湯的“成分?靶點(diǎn)?疾病”網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)（node）表示活性成分、靶基因、疾病和通路，節(jié)點(diǎn)間相互關(guān)系用邊（edge）表示，利用軟件網(wǎng)絡(luò)分析（Network Analyzer）功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥?/p>

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證甘草干姜湯活性成分與作用靶點(diǎn)相互作用 將“2.6”篩選得到的核心成分作為小分子配體庫，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫下載各活性成分結(jié)構(gòu)mol2 格式；在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）（http：／ ／www.rcsb.org／）下載重要潛在靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)pdb 格式，作為受體庫。采用SYBYL?X 1.3 軟件對(duì)小分子化合物及受體進(jìn)行優(yōu)化，并利用對(duì)接套件（Docking suite）選項(xiàng)進(jìn)行分子對(duì)接；將對(duì)接后的蛋白導(dǎo)入Pymol 3.8 軟件進(jìn)行渲染作圖。同時(shí)，通過藥物數(shù)據(jù)庫（Drugbank）（https：／ ／www.drugbank.ca／）查找作用于潛在靶點(diǎn)的臨床藥物進(jìn)行對(duì)接作為對(duì)照。

3 結(jié)果

3.1 基于UPLC?Q?TOF／MS 的化學(xué)成分鑒別 甘草干姜湯的基峰離子流圖（BPI）見圖1。在甘草干姜湯供試品溶液中共檢測(cè)到116個(gè)化合物（見表1），其中95個(gè)歸屬于炙甘草，19個(gè)歸屬于炮姜，2個(gè)為炙甘草、炮姜共有成分。所測(cè)成分主要包括黃酮類、生物堿類、皂苷類等，其中24個(gè)化合物經(jīng)與對(duì)照品確認(rèn)。以新甘草苷（化合物28）為例，準(zhǔn)分子離子峰為［M?H］－m／z417.119 2，化合物28 脫去一個(gè)C6H10O5中性片段得到M1［M?H?162］－m／z255.066 3 的碎片離子，M1 進(jìn)一步脫去C8H8O 中性片段得到M2［M?H?120］－m／z135.008 4 的碎片離子，準(zhǔn)分子離子脫 去C13H14O8中性片段得到M3［M?H?298］－m／z119.049 9 的碎片離子，可推斷該化合物為新甘草苷，該化合物在負(fù)離子模式下的高能裂解質(zhì)譜圖和裂解途徑見圖2。

表1 甘草干姜湯化學(xué)成分鑒定結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

圖1 甘草干姜湯的基峰離子流圖

圖2 新甘草苷的質(zhì)譜圖和裂解途徑

3.2 甘草干姜湯成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)分析 檢測(cè)得到的甘草干姜湯116種成分中，40個(gè)成分滿足OB≥30%和DL≥0.18，12種成分通過文獻(xiàn)檢索確認(rèn)具有較強(qiáng)的藥理活性［11?18］，共得到甘草干姜湯候選成分52種。通過TCMSP和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫得到甘草干姜湯成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)837個(gè)。通過GAD、TTD、Gene Cards 等數(shù)據(jù)庫檢索得到肺纖維化相關(guān)靶標(biāo)37個(gè)、間質(zhì)性肺疾病相關(guān)靶標(biāo)12個(gè)、慢性阻塞性肺疾病相關(guān)靶標(biāo)444個(gè)，哮喘相關(guān)靶標(biāo)714個(gè)。經(jīng)與成分靶標(biāo)匹配后得到共有靶點(diǎn)211個(gè)。

3.3 KEGG 代謝通路富集和GO 生物功能過程分析 將甘草干姜湯成分與呼吸系統(tǒng)疾病共有的211個(gè)靶點(diǎn)輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫，得到KEGG 通路83 條（P＜0.05），篩選與疾病相關(guān)排名前20 的通路條目見圖3A。GO 富集分析得到BP、CC、MF 各405、52、108 條，排名前20 的條目分別見圖3B～3D。通過富集分析可知，甘草干姜湯治療呼吸系統(tǒng)疾病的靶點(diǎn)主要富集與神經(jīng)活性配體?受體相互作用、鈣離子信號(hào)通路、乙型肝炎、PI3K?Akt 信號(hào)通路等；生物過程主要涉及藥物反應(yīng)、胞質(zhì)鈣離子濃度正調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、凋亡過程負(fù)調(diào)控、對(duì)抗生素的反應(yīng)等；這些靶點(diǎn)在細(xì)胞組分中與質(zhì)膜、胞質(zhì)、細(xì)胞器膜等較為相關(guān)；在分子功能中與藥物結(jié)合、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合等高度相關(guān)。

圖3 甘草干姜湯KEGG 通路（A）、BP（B）、CC（C）、MF（D） 富集分析

3.4 甘草干姜湯成分?疾病?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 采用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建甘草干姜湯“成分?靶點(diǎn)?疾病”網(wǎng)絡(luò)（圖4）。為尋找成分?靶點(diǎn)?疾病網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用的靶標(biāo)，進(jìn)一步對(duì)導(dǎo)出拓?fù)鋽?shù)據(jù)excel 文件分析，設(shè)置度值＞14 進(jìn)行核心網(wǎng)絡(luò)篩選（圖5）。由圖5 可知，篩選得到鱗葉甘草素A（MOL004828）、毛蕊異黃酮（MOL000417）、異甘草黃酮醇（MOL004949）、紅車軸草素（MOL003398）等核心成分共40種，PPARG、ESR2、PTGS2 等核心靶標(biāo)36個(gè)。

圖4 甘草干姜湯的成分?疾病?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖5 甘草干姜湯的成分?疾病?靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)

3.5 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果 通過甘草干姜湯核心成分?疾病?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，將度值前4 的靶點(diǎn)ESR1（PDB ID：5GS4）、ESR2（PDB ID：5AAU）、PPARG（PDB ID：5U41）、PTGS2（PDB ID：4OTY）分別與40種核心成分進(jìn)行分子對(duì)接。其中，Total Score 表示配體分子與蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)的結(jié)合作用分?jǐn)?shù)，分值越高，配體分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用越好；Crash 為碰撞分?jǐn)?shù)，值越高表示配體與蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)空腔形成的能量匹配情況越好；Polar值表示配體分子與活性位點(diǎn)氨基酸殘基間的氫鍵鍵合能力，分?jǐn)?shù)越高，鍵能越強(qiáng)［19］。40種核心成分與4個(gè)靶點(diǎn)的主要對(duì)接結(jié)果（Total Score ≥5）見 表 2。結(jié)果顯示，6?姜辣素（MOL002467）、甘草黃酮C（MM0002）等12種成分與ESR1 有較強(qiáng)相互作用；刺果甘草查爾酮（MOL004835）、甘草皂苷A3（MM0005）等21種成分與ESR2 存在較強(qiáng)的相互作用；10?姜辣素（MOL002459）、甘草黃酮 C（MM0002）等37種成分與PPARG 存在較強(qiáng)的相互作用；6?姜辣素（MOL002467）、異甘草黃酮醇（MOL004949）等24種成分與PTGS2 有較強(qiáng)相互作用。其中，與ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2 對(duì)接結(jié)果最強(qiáng)的化合物分別為甘草黃酮C（MM0002）、6?姜辣素（MOL002467）、10?姜辣素（MOL002459）和6?姜辣素。通過DrugBank 和文獻(xiàn)等查閱得到作用于ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2 的臨床常用藥分別為己烯雌酚、雷洛昔芬、孟魯斯特和奧沙普嗪。甘草黃酮C（MM0002）、6?姜辣素（MOL002467）、10?姜辣素（MOL002459）和6?姜辣素及臨床常用藥己烯雌酚、雷洛昔芬、孟魯斯特和奧沙普嗪與ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2的對(duì)接結(jié)果見表3 和圖6。結(jié)果顯示，甘草干姜湯中成分與ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2 靶標(biāo)的對(duì)接結(jié)果不弱于現(xiàn)有臨床常用藥物的結(jié)合作用。

圖6 ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2分子對(duì)接模型

表2 甘草干姜湯活性成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

表3 ESR1、ESR2、PPARG、PTGS2分子對(duì)接結(jié)果

4 討論

通過比較甘草干姜湯正離子和負(fù)離子2種檢測(cè)模式，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下峰容量和響應(yīng)強(qiáng)度均優(yōu)于正離子模式［20］，故本研究?jī)H采用負(fù)離子模式進(jìn)行分析，共鑒定得到116個(gè)化合物，包括黃酮類、生物堿類、皂苷類等多種成分。進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建甘草干姜湯“核心成分?靶標(biāo)?疾病”網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)degree值篩選得到柚皮素、甘草素、6?姜辣素、光甘草寧、毛蕊異黃酮、姜酮等40種關(guān)鍵成分，ESR2、PPARG、PTGS2、ESR1 等36個(gè)核心靶標(biāo)，癌癥通路（Pathways in cancer）、PI3K?Akt 信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體?受體相互作用（Neuroactive ligand?receptor interaction）、乙型肝炎（Hepatitis B）等83 條信號(hào)通路。分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果顯示，甘草黃酮C（MM0002）、甘草皂苷A3（MM0005）、短葉松素（MM0006）、10?姜辣素（MOL002459）、6?姜辣素（MOL002467）、姜 酮（MOL002516）、異甘草黃酮醇（MOL004949）與核心靶點(diǎn)ESR2、PPARG、PTGS2、ESR1 均具有較強(qiáng)相互作用，顯示了甘草干姜湯多成分?多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。分子對(duì)接驗(yàn)證選擇度值較高靶標(biāo)分別與甘草干姜湯中核心成分及能夠作用于關(guān)鍵靶標(biāo)的臨床常用藥物分別進(jìn)行分子對(duì)接進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，甘草干姜湯中活性成分（甘草黃酮C、6?姜辣素、10?姜辣素和6?姜辣素）與ESR1、ESR2、PPARG 和PTGS2的結(jié)合能力均強(qiáng)于臨床藥物己烯雌酚、雷洛昔芬、孟魯斯特和奧沙普嗪，提示網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。

ESR1 和ESR2 是雌激素受體，雌激素受體在大鼠、小鼠以及人的肺組織中均有表達(dá)，且參與肺泡分化及保證肺正常彈性收縮［21］，此外有研究表明雌激素受體可加重膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)，對(duì)肺組織造成破壞［22］。PPARG 是肺成纖維細(xì)胞活化的重要調(diào)節(jié)因子，在控制細(xì)胞分化中有較強(qiáng)作用，可調(diào)節(jié)炎癥和纖維化反應(yīng)［23］。在慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）發(fā)病過程中，PPARG 表達(dá)下調(diào)減弱了其抗炎、抗氧化作用，激活了氧化應(yīng)激反應(yīng)活性并引起氣道炎癥［24］。而PTGS2 活性的增加則會(huì)引起支氣管黏膜水腫，增加氣道炎癥，從而加重患者的氣流阻塞［25］。

李曉紅等［26］研究發(fā)現(xiàn)，甘草皂苷類可通過抑制環(huán)氧合酶?2 的表達(dá)而降低前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）合成，從而具有顯著的抗炎作用。有實(shí)驗(yàn)表明異甘草黃酮醇能夠顯著誘導(dǎo)Nrf2 及其反向基因GR、GPX和NQO1，從而具有對(duì)百草枯引起的急性肺損傷的抗氧化和解毒作用，減輕肺水腫和纖維化［27］。6?姜辣素（MOL002467）的體外實(shí)驗(yàn)顯示，該成分能夠抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并導(dǎo)致G1 期細(xì)胞周期停滯，并且阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF 的反應(yīng)形成毛細(xì)血管樣管，強(qiáng)烈抑制大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的萌發(fā)和小鼠角膜對(duì)VEGF 的反應(yīng)形成新血管，表明6?姜辣素能夠抑制血管生成，可能在腫瘤和其他血管生成依賴性疾病的治療中起作用［28］。在氨基甲酸誘導(dǎo)的肺癌模型中，6?姜辣素也可以作為精氨酸酶抑制劑，對(duì)支持腫瘤 的巨噬細(xì) 胞有重編程作用［29］。姜 酮（MOL002516）具有抗氧化和抗炎作用，有研究表明，姜酮在體內(nèi)外均能顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，阻斷ERK、p38／MAPK 和IκBα、NF?κB／P65 的磷酸化，減弱絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子kappa B（NF?κB）信號(hào)通路，這些結(jié)果提示姜酮對(duì)LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷具有保護(hù)作用［30］。

PI3K?Akt 通路是肺纖維化過程中一個(gè)重要的信號(hào)調(diào)控系統(tǒng)，主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡及血管生成，能通過調(diào)控下游中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、缺氧誘導(dǎo)因子?1α（hypoxia inducible factor?1，HIF?1α）及活性氧類（Reactive oxygen species，ROS）系 統(tǒng)等參與肺纖維化［31］，且與NF?κB 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等關(guān)系密切。神經(jīng)活性配體?受體相互作用通路信號(hào)的改變可能引發(fā)肺部癌癥、炎癥性疾?。?2］。呼吸系統(tǒng)疾病患者常伴隨有肝損害，如小兒支原體感染性肺炎常合并肝損傷［33］，甘草干姜湯對(duì)乙型肝炎通路的作用可能對(duì)肝損傷的治療起到一定的治療效果。

綜上，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC?Q?TOF／MS 技術(shù)，快速、準(zhǔn)確地從整體系統(tǒng)闡釋甘草干姜湯中的化學(xué)成分，從中鑒定得到116個(gè)化合物，以期為其質(zhì)量標(biāo)志物的篩選奠定前期基礎(chǔ)。進(jìn)一步結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)對(duì)甘草干姜湯治療呼吸系統(tǒng)疾病的化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)、代謝通路方面進(jìn)行研究，初步探討了甘草干姜湯治療呼吸系統(tǒng)疾病的作用機(jī)制，為今后對(duì)甘草干姜湯進(jìn)一步開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。