慈菇消脂丸含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞脂性凋亡的影響

毛舒婷尹 碩霍瑞琦馬燕花

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000）

流行病學(xué)調(diào)查顯示，近20年來(lái)，伴隨肥胖流行及生活方式改變，世界范圍內(nèi)非酒精性脂肪性肝?。∟on?Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）的平均患病率已為24%。亞洲地區(qū)NAFLD 總患病率也呈明顯上升趨勢(shì)，高達(dá)27.4%［1］。NAFLD 發(fā)生及發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果，其中脂毒性引起的肝細(xì)胞損傷對(duì)非酒精性脂肪性肝炎（Non?Alcoholic Steatohepatitis，NASH）進(jìn)展發(fā)揮重要作用，這種凋亡類型也稱為脂性凋亡［2?3］。脂肪酸可上調(diào)細(xì)胞死亡受體，NASH 患者死亡受體Fas 的表達(dá)較單純性脂肪變性患者更明顯。Fas 表達(dá)上調(diào)可激活外源性肝細(xì)胞凋亡通路［4］。過(guò)多脂肪酸堆積也可導(dǎo)致線粒體功能障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活c?Jun 氨基末端激酶（c?Jun N?terminal Kinase，JNK）信號(hào)通路，啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡途徑［5］，脂性凋亡與相關(guān)因素共同作用引起肝細(xì)胞壞死。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)豐富的酶蛋白釋放，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine Aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨 酶（Aspartate Transaminase，AST）。也有學(xué)者提出ALT 和AST 升高是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化產(chǎn)物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的作用［6］，因此超氧 化物歧化 酶（Superoxide Dismutase，SOD）抗氧化作用也至關(guān)重要［7］。單純性脂肪變性在肝細(xì)胞損傷與免疫因素交互作用下發(fā)展為NASH［8］，最終進(jìn)展為臨床終末期肝病如肝硬化及肝癌。

2016年第28 屆脾胃病學(xué)術(shù)年會(huì)中，中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)就NAFLD 中醫(yī)診療達(dá)成專家共識(shí)意見(jiàn)，提出NAFLD 辨證分型為濕濁內(nèi)停，肝郁脾虛等證型，主要病機(jī)為肝體用失調(diào)，濕濁痰瘀內(nèi)生［9］。課題組自擬處方慈菇消脂丸以山慈菇為君藥，用以清熱解毒、消癰散結(jié)，配伍法半夏化痰祛濕，茯苓、薏苡仁健脾滲濕，柴胡疏肝解郁，丹參活血化瘀，土鱉蟲(chóng)散結(jié)消癥，加用黃芩清熱解毒，澤瀉利水滲濕，佐以枸杞、生首烏、決明子補(bǔ)益肝腎以固本，生山楂健脾兼消瘀，合用炙甘草調(diào)和諸藥，同時(shí)顧護(hù)中焦脾胃。諸藥合用，共奏解毒化痰、消降濁脂之功效。本實(shí)驗(yàn)用慈菇消脂丸含藥學(xué)清干預(yù)HepG2細(xì)胞脂肪變性模型，通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase?8、Fas?L、p?JNK 表達(dá)，ELISA 技術(shù)檢測(cè)SOD、MDA、ALT、AST 水平，并結(jié)合電鏡觀察細(xì)胞微觀形態(tài)學(xué)變化，以期為慈菇消脂丸改善脂性凋亡提供細(xì)胞形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)證據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 HepG2（貨號(hào)HYC3112）購(gòu)自上海和元生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 動(dòng)物 8 周齡SPF 級(jí)雄性健康SD 大鼠50 只，體質(zhì)量180～220 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（甘）2015?0002。飼養(yǎng)室溫度控制在20～22 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h／12 h 明暗交替照明。本實(shí)驗(yàn)遵循甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理規(guī)定，并通過(guò)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)2015?036）。

1.3 藥物 慈菇消脂丸組方由山慈菇、法半夏、茯苓、柴胡、丹參、土鱉蟲(chóng)、薏苡仁、黃芩、澤瀉、枸杞、生山楂、生首烏、決明子、炙甘草各味中藥材組成，藥材均購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心，委托甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心王曉莉主任藥師鑒定為正品。油酸（OA，貨號(hào)O1008）、棕桐酸（PA，貨號(hào)P0500）、JNK 抑制劑（SP600125，貨號(hào)S5567）、二甲基亞砜（DMSO，貨號(hào)D2650）、4′，6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI，貨號(hào)DUO82040）均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；人天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，貨號(hào)C010?2）、谷丙轉(zhuǎn)氨 酶（ALT，貨號(hào)C009?2）、超氧化物歧化酶（SOD，貨號(hào)A001?3）、丙二醛（MDA，貨號(hào)A003?1）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；p?JNK 抗體（批號(hào)ab47337）、caspase?8 抗體（批號(hào)ab25901）、Fas?L 抗體（批號(hào)ab15285）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號(hào)A0562）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；油紅O 工作液（貨號(hào)G1262）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 儀器 熒光顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss 公司）；微孔板分光光度計(jì)（美國(guó)Bio?Rad 公司）；透射電鏡（HS500，日本日立公司）。

2 方法

2.1 含藥血清制備 煎鍋中混勻各味中藥材，加8 倍量自來(lái)水浸泡5 h，電磁爐加熱煮沸，開(kāi)始用強(qiáng)火，沸騰后文火保持微沸40 min，紗布濾出藥液，藥渣繼續(xù)加藥物干重6倍量自來(lái)水煮沸重復(fù)上述操作。合并2 次所得到濾液放置過(guò)夜，棄去沉淀，電磁爐上中火根據(jù)比例濃縮至適量，濃縮后的藥液裝在滅菌容器中，最終制備的慈菇消脂丸藥液濃度為0.225 g／mL，于?4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩D 大鼠隨機(jī)分為慈菇消脂丸含藥血清組（20 只）和空白組（10只）。給藥劑量＝臨床常用量×動(dòng)物等效面積系數(shù)×5。慈菇消脂丸含藥血清組給予慈菇消脂丸藥液（2 mL／100 g）灌胃，空白組給予等劑量生理鹽水，2 次／d，早晚各1 次，持續(xù)1 周，末次給藥1 h 后心臟取全血。全血于4 ℃靜置2 h，低溫離心機(jī)3 500 r／min 離心15 min，分離血清。分離的血清同組混合，經(jīng)56 ℃水浴滅活30 min，超凈臺(tái)上用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，配制慈菇消脂丸含藥血清低劑量（2%含藥血清）和慈菇消脂丸含藥血清高劑量（6%含藥血清）培養(yǎng)液各10 mL，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 用含10% 胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)至80 %時(shí)制備細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在細(xì)胞計(jì)數(shù)儀下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／ mL，接種至24 孔培養(yǎng)板，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 分組細(xì)胞于24 孔培養(yǎng)板貼壁生長(zhǎng)至80%左右，隨機(jī)分為空白對(duì)照組；模型組，添加油酸?棕櫚酸（2∶1）配制的濃度為500 μmol／L 游離脂肪酸（Free Fatty Acid，F(xiàn)FA）培養(yǎng)液；慈菇消脂丸含藥血清組，添加500 μmol／L FFA 和不同濃度的慈菇消脂丸含藥血清；JNK 抑制劑組，以20 μmol／L SP600125（JNK 抑制劑）預(yù)先干預(yù)1 h，再加500 μmol／L FFA 培養(yǎng)液。24 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液檢測(cè)SOD、MDA、ALT、AST，并做細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色和電鏡觀察。

2.4 電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴 待24 孔板細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右，分組誘導(dǎo)干預(yù)24 h，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集于離心管中，1 000 r／min，離心5 min，棄上清，彈指法混勻細(xì)胞。沿管壁加入2.5%電鏡用冷戊二醛500 μL 固定，切勿吹懸，置于室溫1 h，4 ℃冰箱3 h 后，去除戊二醛加滿PBS 送檢。

2.5 檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、MDA、ALT、AST 水平 用收集到的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，ELISA 法檢測(cè)ALT、AST，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA。

2.6 免疫熒光 染色檢測(cè)caspase?8、Fas?L、p?JNK 的 表達(dá) 將分組干預(yù)后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，將爬片置于4%多聚甲醛中固定30 min，0.5% PBST 緩沖液室溫孵育20 min，0.05% PBST 洗3 次，5 min／次，滴加5% BSA 封閉液置于室溫下20 min，甩去多余液體，滴加一抗50 μL（1∶200），37 ℃孵育1 h，4 ℃過(guò)夜。次日，0.05% PBST洗3 次，5 min／次，滴加Alexa Flour 488 標(biāo)記的山羊抗兔二抗40～50 μL（1∶400），37 ℃孵育1 h，用0.05% PBST 洗3 次，5 min／次，滴入1 滴DAPI 染液（藍(lán)色）染色15 min使細(xì)胞核著色，PBS 清洗3 次，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以（）表示，W 檢驗(yàn)和矩法檢驗(yàn)判斷正態(tài)分布性，Levene 檢驗(yàn)判斷方差齊性，組間采用 單因素方差分析（one?way ANOVA），多重比較采用最小二乘法（LSD 檢驗(yàn)），以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 電鏡下細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu) 空白對(duì)照組HepG2細(xì)胞大小均一，核型如常，核漿比例正常，核仁清晰，胞漿內(nèi)未見(jiàn)到脂滴。FFA 刺激后細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量的大小不一的卵圓形或圓形脂滴沉積，并可見(jiàn)細(xì)胞核受擠壓而變形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器受損，并且清晰可見(jiàn)許多含有內(nèi)容物的自噬小體，偶見(jiàn)凋亡體。慈菇消脂丸含藥血清組細(xì)胞內(nèi)脂滴、自噬小體均減少，其中高劑量藥物血清組脂滴、自噬小體減少更明顯。JNK 抑制劑組細(xì)胞內(nèi)脂滴亦減少，自噬小體明顯減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組電鏡下細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)（×10 000）

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、MDA、ALT、AST 水平 與空白對(duì)照組比較，模型組SOD 水平降低，MDA、ALT、AST 水平增高（P＜0.05）；與模型組比較，慈菇消脂丸含藥血清各劑量組及JNK 抑制劑組SOD 水平升高，MDA、ALT、AST 水平降低（P＜0.05）；與JNK 抑制劑組比較，慈菇消脂丸含藥血清組SOD 水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液酶學(xué)指標(biāo)（， n＝10）

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液酶學(xué)指標(biāo)（， n＝10）

注：與空白對(duì)照組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與JNK 抑制劑組比較，▲▲P＜0.01。

3.3 細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)caspase?8、Fas?L、p?JNK 表 達(dá)caspase?8分布在細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞核中。與空白對(duì)照組比較，模型組caspase?8 表達(dá)增高（P＜0.01），慈菇消脂丸含藥血清組caspase?8 表達(dá)較模型組降低（P＜0.01），但沒(méi)有恢復(fù)到正常組水平，見(jiàn)圖2。Fas?L 蛋白主要分布于細(xì)胞膜、胞漿和細(xì)胞核。與空白對(duì)照組比較，單純經(jīng)游離脂肪酸處理后Fas?L 表達(dá)增加（P＜0.01），慈菇消脂丸含藥血清組Fas?L 表達(dá)較模型組下降（P＜0.01），且較JNK 抑制劑組降低更明顯（P＜0.01），見(jiàn)圖3。p?JNK 主要分布在胞漿，也分布于細(xì)胞。p?JNK 在正常對(duì)照組中表達(dá)很低，在模型組表達(dá)量增高（P＜0.01），JNK 抑制劑組較模型組明顯降低（P＜0.01），中藥各劑量組較模型組沒(méi)有明顯變化，見(jiàn)圖4。各組蛋白的表達(dá)量如表2 所示。

圖3 Fas?L 熒光染色（×200， 綠色熒光為Fas?L 蛋白，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核）

圖4 p?JNK 熒光染色（×200， 綠色熒光為p?JNK 蛋白，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核）

表2 各組細(xì)胞中caspase?8， FasL， p?JNK 表達(dá)（， n＝10）

表2 各組細(xì)胞中caspase?8， FasL， p?JNK 表達(dá)（， n＝10）

注：與空白對(duì)照組相比，※※P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與JNK 抑制劑組比較，▲▲P＜0.01。

圖2 caspase?8 熒光染色（×200， 綠色熒光為caspase?8 蛋白， 藍(lán)色熒光為細(xì)胞核）

4 討論

盡管大多數(shù)NAFLD 患者僅表現(xiàn)為單純性脂肪變性，但近1／3 患者會(huì)進(jìn)展為NASH，這種壞死性炎癥性疾病增加了患者患肝纖維化、肝硬化、肝癌的危險(xiǎn)因素［10］。雖然NAFLD 發(fā)病重在預(yù)防，對(duì)于已經(jīng)患有單純性脂肪變性的患者來(lái)說(shuō)，為防治其進(jìn)展為NASH，研究游離脂肪酸堆積引起的肝細(xì)胞損傷至關(guān)重要。

當(dāng)大量脂肪酸涌入肝細(xì)胞，超過(guò)細(xì)胞自身降解脂肪酸能力，會(huì)堆積引起脂毒性，進(jìn)而導(dǎo)致反應(yīng)氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）產(chǎn)生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和肝細(xì)胞功能障礙［11］。ROS 中的超氧自由基（O2－）在SOD 作用下才能正常降解［12］。所以SOD 是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化物。但當(dāng)ROS 產(chǎn)生超過(guò)細(xì)胞正常抗氧化機(jī)制時(shí)，會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激在NASH 始動(dòng)階段發(fā)揮重要作用。堆積的脂質(zhì)進(jìn)一步發(fā)生β?氧化和ω?氧化，多不飽和脂肪酸過(guò)氧化產(chǎn)生的毒性物質(zhì)包括MDA 和羥基壬烯酸（Hydroxynonenal，HNE），也可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。所以MDA 增多是肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的標(biāo)志。脂肪酸還可上調(diào)位于肝細(xì)胞膜上的死亡受體Fas、腫瘤壞死因 子（Tumor Necrosis Factor，TNF）和TNF 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF Related Apoptosis Inducing Ligand，TRAIL）。Fas 可與Fas?L 結(jié)合，通過(guò)肝細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)蛋白Fas 相關(guān)死亡域蛋白（Fas?Associated Protein with Death Domain，F(xiàn)ADD）［14］激活caspase?8［15］，caspase?8執(zhí)行細(xì)胞凋亡命令，這一過(guò)程稱為外源性細(xì)胞凋亡通路。所以在肝細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)，F(xiàn)as 和caspase?8 表達(dá)都會(huì)上調(diào)。脂肪酸堆積也可導(dǎo)致線粒體障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，感受態(tài)JNK 被激活，磷酸化c?Jun 調(diào)控內(nèi)源性相關(guān)凋亡基因表達(dá)，如c?Jun 會(huì)上調(diào)Bax 和Bak 表達(dá)［16］，導(dǎo)致線粒體通透性增加，細(xì)胞色素?c 釋放入細(xì)胞質(zhì)，與凋亡酶激活因子（Apoptotic Protease Activating Factor?1，APAF?1）和caspase?9 形成凋亡體。因此，p?JNK 表達(dá)上調(diào)是內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路激活的重要標(biāo)志。凋亡作為一種程序性細(xì)胞死亡形式，產(chǎn)生的凋亡小體在沒(méi)有吞噬細(xì)胞存在時(shí)，內(nèi)容物會(huì)釋放入細(xì)胞外液，所以本實(shí)驗(yàn)中代表肝細(xì)胞膜損傷的酶蛋白AST和ALT 水平也會(huì)上升。然而，AST 也大量存在于腦、胰腺、心臟、骨骼肌等組織中，這些組織損傷后也會(huì)導(dǎo)致血液中AST 水平上升，因此在實(shí)際臨床應(yīng)用中AST 并不能作為肝組織損傷的特征性標(biāo)志。相反，ALT 主要存在于肝臟中，其水平在血液中的升高是肝組織損傷的直接證據(jù)。

本細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)研究將血清藥理學(xué)研究方法和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合，旨在證明內(nèi)外源性凋亡通路在NAFLD細(xì)胞模型中的作用，闡明慈菇消脂丸治療NAFLD機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中，模型組中凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)caspase?8，F(xiàn)as?L，p?JNK 表達(dá)顯著上調(diào)及肝細(xì)胞酶學(xué)指標(biāo)ALT、AST分泌增加為肝細(xì)胞損傷提供了佐證；脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA增加及抗氧化產(chǎn)物SOD 降低為細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化提供了佐證。不同濃度中藥劑量組中上述相關(guān)指標(biāo)均有不同程度減輕，證實(shí)慈菇消脂丸可以抑制脂毒性引起的肝細(xì)胞凋亡。之前的實(shí)驗(yàn)證明慈菇消脂丸可通過(guò)調(diào)控JNK?Jun 內(nèi)源性凋亡通路抑制肝細(xì)胞凋亡，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，可發(fā)現(xiàn)其對(duì)外源性凋亡通路FasL?Fas 也會(huì)產(chǎn)生影響。因兩條凋亡通路最終發(fā)生交聯(lián)，對(duì)于慈菇消脂丸是通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性凋亡通路進(jìn)一步調(diào)節(jié)外源性凋亡通路，還是直接影響外源性凋亡通路有待進(jìn)一步研究。自噬小體是細(xì)胞在極端環(huán)境下的一種保護(hù)性機(jī)制，通過(guò)電鏡觀察到模型組細(xì)胞中自噬小體含量明顯較藥物干預(yù)組多，說(shuō)明藥物在抑制細(xì)胞凋亡同時(shí)也抑制了細(xì)胞自噬。JNK 可以感知細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的變化，肝細(xì)胞中

主要有JNK1 和JNK2 兩種亞型，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)JNK1 主要通過(guò)影響B(tài)eclin1 表達(dá)促進(jìn)自噬［15］。進(jìn)一步說(shuō)明游離脂肪酸可通過(guò)JNK2 促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，而游離脂肪酸是否通過(guò)JNK1 通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬則需更充分的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。