黃芩苷通過調(diào)節(jié)miR?223?3p／NLRP3 通路對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用

李長(zhǎng)力鄭喜勝賈明雅

（河南省南陽市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河南 南陽473000）

膿毒癥是導(dǎo)致危重病房患者死亡的常見原因之一，多發(fā)于休克、嚴(yán)重?zé)齻?、?chuàng)傷、感染和大手術(shù)后，可引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）［1］。肺部是因SIRS 最早受累的器官，急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是膿毒癥患者常見的并發(fā)癥之一［2］。ALI 與炎癥相關(guān)，其進(jìn)程伴隨促炎因子大量釋放，抗炎因子／促炎因子水平失衡是促進(jìn)ALI 發(fā)展的關(guān)鍵因素［3?4］。黃芩苷是一種從唇形科植物黃芩根中提取而來的黃酮類成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化等藥理作用［5?6］。NOD 樣受體蛋白3（NOD?like receptor protein 3，NLRP3）參與炎癥反應(yīng)，并在ALI 大鼠肺組織高表達(dá)［7］。微小RNA（microRNA，miRNA）可與靶基因3′?UTR 配對(duì)結(jié)合，參與機(jī)體生理進(jìn)程，miR?223?3p 過表達(dá)可抑制促炎癥因子表達(dá)［8］。本研究通過構(gòu)建膿毒癥ALI大鼠模型，使用不同劑量黃芩苷處理后，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，旨在從miR?223?3p／NLRP3 通路揭示黃芩苷對(duì)膿毒癥ALI 大鼠的保護(hù)作用，為黃芩苷在臨床上治療ALI 提供理論依據(jù)。

1 材料

黃芩苷（貨號(hào)B20570?100 mg，純度≥98%）、地塞米松（貨號(hào)B25793?100 mg，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；白細(xì)胞介素1β（interleukin?1β，IL?1β，貨號(hào)E?EL?R0012c）、白細(xì)胞介素 10（interleukin?10，IL?10，貨號(hào)E?EL?R0016c）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor?α，TNF?α，貨號(hào)E?EL?R0019c）ELISA 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠NLRP3 一抗（貨號(hào)orb319065）購自武漢博歐特生物科技有限公司；兔抗鼠內(nèi)參β?Actin（貨號(hào)AP0060）、羊抗兔IgG／HRP 二抗（貨號(hào)BD5003）均購自廈門研科生物技術(shù)有限公司；ZF?388 全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)購自深圳市三利化學(xué)品有限公司；XSP?9CA型生物顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠。SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量220～250 g，7 周齡，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（粵）2018?0001。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后根據(jù)文獻(xiàn)采用盲腸結(jié)扎穿孔法（CLP）建立膿毒癥ALI大鼠模型［9］。大鼠術(shù)前不需禁食，以1.25 g／kg 劑量烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位固定，備皮，75%乙醇消毒，用手術(shù)剪沿腹正中線剪開約2 cm長(zhǎng)的切口，分離腸系膜，暴露盲腸，用絲線結(jié)扎回盲腸瓣下方盲腸根部位置，用18號(hào)針頭穿透結(jié)扎端盲腸，擠出糞便及腸內(nèi)容物于腹腔內(nèi)，隨后將腸管收回腹腔，縫合，消毒。大鼠造模后6 h 出現(xiàn)豎毛、呼吸困難、腹瀉、躁動(dòng)、爪趾青紫、萎靡等癥狀，說明造模成功。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組（手術(shù)開腹后，僅暴露盲腸，隨后縫合）、模型組、地塞米松組（0.27 mg／kg）［10］、低劑量黃芩苷組（10 mg／kg）、中劑量黃芩苷組（50 mg／kg）、高劑量黃芩苷組（100 mg／kg）［11］，每組18 只。造模6 h后，腹腔注射給藥（給藥量2 mL／kg），假手術(shù)組和模型組注射等量生理鹽水。

2.2 ELISA 測(cè)定大鼠血清TNF?α、IL?1β、IL?10水平 給藥24 h 后，鼠尾抽血，離心后分離血清，置于－20 ℃冰箱中保存。從－20 ℃冰箱中取出各組大鼠血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定各組大鼠血清TNF?α、IL?1β、IL?10 水平，測(cè)定步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3 大鼠肺組織病理學(xué)觀察 各組任意選取6 只大鼠立刻脫頸處死，左肺組織用4% 多聚甲醛固定，將固定后的左肺組織用石蠟常規(guī)包埋，制成厚度4～6 μm 切片，行HE 染色，封片后在光學(xué)顯微鏡下參考王寶家等［12］改良版肺組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（見表1），觀察各組大鼠肺組織病理改變情況并進(jìn)行肺組織病理評(píng)分。

表1 肺組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Criteria for scoring of pulmonary pathology

2.4 大鼠肺組織含水量測(cè)定 取右肺組織用于測(cè)定肺組織含水量，用天平稱量左肺組織濕質(zhì)量（wet weight，WW），然后放入60 ℃烘箱烘干，稱定其干質(zhì)量（dry weight，DW），計(jì)算WW／DW比值以表示肺組織含水量。WW／DW比值＝（WWDW）／DW。

2.5 大鼠AFC值測(cè)定 各組任意選取6 只大鼠脫頸處死，分離出全部氣管、肺臟及心臟用于測(cè)定肺泡液體清除率（alveolar fluid clearance，AFC）。將氣管導(dǎo)管插入右下肺，以4 mL／kg 劑量將5%白蛋白（0.15 mg 伊文思藍(lán)標(biāo)記）等滲生理鹽水灌注液經(jīng)氣管導(dǎo)管滴入右肺下葉，隨后給予2 mL 氧氣，以確保灌注液順利到達(dá)肺部。保持全氧，維持氣道壓在650～700 Pa 之間，持續(xù)通氣1 h。最后取0.2 mL右下肺液體，測(cè)定620 nm 處吸光度值并根據(jù)公式計(jì)算AFC。AFC% ＝（灌入肺泡內(nèi)液體量－肺泡內(nèi)剩余液體量）；泡內(nèi)剩余液體量＝灌入肺泡內(nèi)液體量×最初蛋白濃度／最終蛋白濃度。

2.6 RT?qPCR 測(cè)定大鼠肺組織miR?223?3p表達(dá)剩余6 只大鼠脫頸處死，分離左肺組織，用于測(cè)定miR?223?3p表達(dá)。取左肺組織，加入勻漿液，充分勻漿，離心后取上清，用RNA 提取試劑盒提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，反應(yīng)體系為5×AMV buffer 2.0 μL，RNA（1.0 μg／μL）1.0 μL，DEPC water 2.0 μL，reverse primer（50 pmol／μL）0.5 μL，2.5 mmol／L each dNTP mixture 4.0 μL，AMV enzyme 0.5 μL。行RT?qPCR 反應(yīng)，體系共20 μL為正反向引物各0.5 μL，去離子水4.0 μL，cDNA

5.0 μL，2 × SYBR Green PCR Master Mix 10.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃5 min，95 ℃15 s、60 ℃34 s，40個(gè)循環(huán)，75 ℃5 min。miR?223?3p正向引物序列5′?GGGGTGTCAGTTTGTCAAA?3′，反向引物序列5′?CAGTGCGTGTCGTGGAGT?3′；內(nèi)參U6 正向引物序列5′?ATTGGAACGATACAGAGAAGATT?3′，反向引物序列5′?GGAACGCTTCACGAATTTG?3′。采 用2－ΔΔCT法對(duì)miR?223?3p 表達(dá)行定量分析。

2.7 蛋白印跡法測(cè)定大鼠肺組織NLRP3 表達(dá) 取右肺組織測(cè)定NLRP3 表達(dá)，加入蛋白裂解液充分裂解，離心后取上清，提取總蛋白并測(cè)定濃度。電泳分離目標(biāo)蛋白，轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，用5%BSA 封閉，分別加入相應(yīng)兔抗鼠NLRP3、β?actin 一抗（1∶1 000）孵育24 h，加入羊抗兔IgG／HRP 二抗孵育2 h，顯色，測(cè)定條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)＝目標(biāo)蛋白灰度值／內(nèi)參蛋白灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組比較采用單因素方差分析，2組間比較采用SNK?q 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血清IL?1β、IL?10、TNF?α 水平 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平升高（P＜0.05），IL?10 水平降低（P＜0.05）；經(jīng)黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，IL?1β、TNF?α 水平依次降低（P＜0.05），IL?10 水平依次升高（P＜0.05）；高劑量黃芩苷組IL?1β、IL?10、TNF?α水平與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清IL?1β、IL?10、TNF?α 水平比較（， n＝18）Tab.2 Comparison of serum levels of IL?1 β， IL?10 and TNF ?α in rats of each group（， n＝18）

表2 各組大鼠血清IL?1β、IL?10、TNF?α 水平比較（， n＝18）Tab.2 Comparison of serum levels of IL?1 β， IL?10 and TNF ?α in rats of each group（， n＝18）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與低劑量黃芩苷組比較，▲▲P＜0.01；與中劑量黃芩苷組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.2 大鼠肺組織病理學(xué)變化 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺泡完整性破壞，可見大部分肺泡萎陷，肺間質(zhì)增厚，可見明顯水腫，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織病理得分升高（P＜0.01）。經(jīng)黃芩苷治療后，大鼠肺泡結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，肺間質(zhì)水腫緩解，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，且呈劑量依賴性，肺組織病理得分隨劑量升高依次降低（P＜0.01）。高劑量黃芩苷組大鼠肺組織病理改變情況與地塞米松組相當(dāng)，肺組織病理得分與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

圖1 各組大鼠肺組織HE 染色（×100）Fig.1 Pulmonary morphology of rats in each group by HE staining（×100）

表3 各組大鼠肺組織病理評(píng)分比較（， n＝6）Tab.3 Comparison of pulmonary pathological scores of rats in each group（， n＝6）

表3 各組大鼠肺組織病理評(píng)分比較（， n＝6）Tab.3 Comparison of pulmonary pathological scores of rats in each group（， n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與低劑量黃芩苷組比較，▲▲P ＜0.01；與中劑量黃芩苷組比較，△△P＜0.01。

3.3 大鼠肺組織含水量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠WW／DW比值升高（P＜0.01）；經(jīng)黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，WW／DW比值依次降低（P＜0.01）；高劑量黃芩苷組WW／DW比值與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠肺組織WW／DW 比值比較（， n＝6）Tab.4 Comparison of pulmonary WW／DW ratio of rats in each group（， n＝6）

表4 各組大鼠肺組織WW／DW 比值比較（， n＝6）Tab.4 Comparison of pulmonary WW／DW ratio of rats in each group（， n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與低劑量黃芩苷組比較，▲▲P ＜0.01；與中劑量黃芩苷組比較，△△P＜0.01。

3.4 大鼠AFC值 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠AFC值降低（P＜0.01）；經(jīng)黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，AFC值依次升高（P＜0.01）；高劑量黃芩苷組AFC值與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠AFC值比較（%， x ±s， n＝6）Tab.5 Comparison of AFC values of rats in each group（%， x ±s， n＝6）

3.5 大鼠肺組織miR?223?3p、NLRP3 表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織miR?223?3p表達(dá)降低，NLRP3 表達(dá)升高（P＜0.05）；經(jīng)黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，miR?223?3p表達(dá)依次升高，NLRP3 表達(dá)依次降低（P＜0.05，P＜0.01）；高劑量黃芩苷組miR?223?3p、NLRP3 表達(dá)與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表6。

圖2 各組大鼠肺組織NLRP3 表達(dá)比較Fig.2 Comparison of pulmonary NLRP3 expressions of rats in each group

表6 各組大鼠肺組織miR?223?3p、NLRP3 表達(dá)比較（， n＝6）Tab.6 Comparison of pulmonary miR?223?3p and NLRP3 expressions of rats in each group（， n＝6）

表6 各組大鼠肺組織miR?223?3p、NLRP3 表達(dá)比較（， n＝6）Tab.6 Comparison of pulmonary miR?223?3p and NLRP3 expressions of rats in each group（， n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與低劑量黃芩苷組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與中劑量黃芩苷組比較，△△P＜0.01。

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為ALI 屬于“外感熱病”，符合“溫?zé)岵　钡姆懂牐?3］。近年來，中草藥的藥理作用受到廣泛關(guān)注，黃芩苷因具有抗炎作用而有望成為治療ALI 的候選藥物，因此本研究通過構(gòu)建膿毒癥ALI 大鼠模型，探究黃芩苷治療ALI 的作用機(jī)制。大鼠造模后6 h 出現(xiàn)豎毛、呼吸困難、腹瀉、躁動(dòng)、爪趾青紫、萎靡等癥狀，表明造模成功可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

炎癥反應(yīng)伴隨ALI 進(jìn)程，研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可下調(diào)NLRP3 水平及促炎因子IL?1β、IL?6 水平，以緩解輕度抑郁癥大鼠腦皮層炎癥反應(yīng)［14］。此外，黃芩苷對(duì)急性損傷器官具有保護(hù)作用，可顯著減少馬兜鈴酸誘導(dǎo)的小鼠腎臟細(xì)胞凋亡并緩解腎臟損傷［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芩苷治療后，膿毒癥ALI 大鼠肺泡結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，肺間質(zhì)水腫緩解，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺組織病理評(píng)分降低，且呈劑量依賴性。AFC 是由肺泡內(nèi)的腎上腺素受體控制，是反應(yīng)肺組織間質(zhì)穩(wěn)態(tài)的指標(biāo)，亦可反映肺間質(zhì)水腫情況，與肺功能聯(lián)系緊密［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可減少膿毒癥ALI 大鼠肺組織含水量，提升AFC值，提示黃芩苷可改善膿毒癥ALI 大鼠癥狀，改善肺損傷，恢復(fù)肺功能。IL?1β 和TNF?α 是常見的促炎癥因子，TNF?α 主要表達(dá)在中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞胞漿中，能夠引起炎癥細(xì)胞聚集，合成并釋放IL?1β，參與炎癥反應(yīng)，IL?10 釋放可抑制促炎癥因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)［17?18］。Yang 等［18］發(fā)現(xiàn)IL?1β 和TNF?α 在膿毒癥ALI 大鼠肺組織表達(dá)上調(diào)，可用于反映病情程度。另外，上調(diào)抑炎因子IL?10 水平，下調(diào)促炎因子IL?6 水平可抑制肺泡巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞聚集，可有效控制肺部炎癥反應(yīng)［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平升高，IL?10 水平降低，說明膿毒癥ALI 模型大鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)，可能造成炎癥損傷。經(jīng)黃芩苷治療后，IL?1β、TNF?α 水平降低，IL?10 水平升高，提示黃芩苷可調(diào)整促炎因子／抑炎因子平衡，緩解膿毒癥ALI 模型大鼠炎癥反應(yīng)。但是黃芩苷通過何種信號(hào)通路緩解炎癥反應(yīng)還需進(jìn)一步探究。

NLRP3 炎癥小體通路參與炎癥調(diào)控進(jìn)程，Luo等［20］發(fā)現(xiàn)血紅素加氧酶?1 可抑制肺組織NLRP3、NF?κB 活性，減弱肺組織和血清IL?1β 和IL?18分泌，可用于治療膿毒癥ALI 大鼠。Yin 等［21］發(fā)現(xiàn)，異氟烷以活性氧依賴性方式降低NLRP3 活性，下調(diào)IL?1β、IL?18 mRNA 表達(dá)，以減輕脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥ALI 大鼠肺組織病理學(xué)損傷、水腫和血管通透性。經(jīng)黃芩苷治療后，大鼠肺組織NLRP3 水平降低，提示黃芩苷可能通過抑制NLRP3 炎癥小體活性，以緩解炎癥損傷。miRNA 可靶向調(diào)控靶基因，而NLRP3 是miR?223?3p 的直接靶標(biāo)，上調(diào)miR?223?3p 水平，可抑制NLRP3 活性［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芩苷治療后，大鼠肺組織miR?223?3p升高，提示黃芩苷可能通過上調(diào)miR?223?3p 表達(dá)，抑制NLRP3 活性，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，黃芩苷可通過下調(diào)促炎因子IL?1β、TNF?α 水平，上調(diào)抑炎因子IL?10 水平，以緩解膿毒癥ALI 大鼠肺損傷，可能與miR?223?3p／NLRP3 通路有關(guān)。