枳實(shí)通降顆粒通過干預(yù)MK2 磷酸化抑制炎癥反應(yīng)防治術(shù)后炎性腸梗阻相關(guān)性肺損傷

莫 黎李 倩 王華帥 李 瑩 黃 麗 何永恒

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410005； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208； 3.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410006）

肺部感染是腹部手術(shù)后的常見并發(fā)癥之一［1］，直接影響患者的術(shù)后康復(fù)，甚至危及患者的生命安全［2］。術(shù)后炎性腸梗阻（postoperative ileus，POI）是腹部尤其是腸道手術(shù)后無法避免的一個(gè)特殊時(shí)期或并發(fā)癥，其持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短與術(shù)后患者肺部感染的發(fā)生具有一定的相關(guān)性［3?4］。手術(shù)創(chuàng)傷等導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)不但是POI 的主要原因，其激發(fā)的瀑布式炎癥反應(yīng)也是造成肺臟損傷的重要原因［5］。因此，有效地防治POI，促進(jìn)術(shù)后胃腸功能的早期恢復(fù)對(duì)預(yù)防術(shù)后肺部感染的發(fā)生，保障術(shù)后患者的順利康復(fù)具有重要的臨床意義［6］。

在前期的研究中證實(shí)，枳實(shí)通降顆粒不但能顯著地促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤術(shù)后胃腸功能的恢復(fù)，有效地預(yù)防術(shù)后早期炎性腸梗阻的發(fā)生，并且對(duì)肺部感染的發(fā)生也有一定的防治作用［7］。為進(jìn)一步論證及探明其可能的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以POI 模型大鼠為研究對(duì)象，觀察枳實(shí)通降顆粒對(duì)大鼠肺組織的MK2 磷酸化的影響，探討其保護(hù)POI 相關(guān)性肺損傷的作用及可能機(jī)制，以期為該藥的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 鼠齡6 周的SPF 級(jí)SD 大鼠84 只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2016?0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（湘）2019?0009，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物理論委員會(huì)批準(zhǔn)（LL2019092005）。

1.2 藥物 專利方枳實(shí)通降顆粒［8］由枳實(shí)10 g、烏藥10 g、大腹皮10 g、廣木香10 g、黃柏10 g、澤瀉12 g、三七6 g、西洋參6 g、川牛膝12 g、甘草6 g組成。中藥飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診中藥房（湖南新匯制藥廠生產(chǎn)），并由周平蘭教授鑒定合格，按照傳統(tǒng)法水煎濃縮成生藥含量為3.4 g／mL 的藥液，置于冰箱冷藏備用。琥珀酸普蘆卡必利片（意大利Janssen Cilag S.p.A.公司生產(chǎn)，2 mg×7 片／盒，批號(hào)JGL6E00），將其制備成含藥量為0.036 mg／mL 的混懸液。

1.3 試劑 IL?6、IL?8、TNF?α 試劑盒（上海晶天生 物，批號(hào)E20200103010、E20200103011、E20200103012）；彩色預(yù)染蛋白標(biāo)志物（美國(guó)Thermo 公司，貨號(hào)26616）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)CW0014S、CW0049）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（美國(guó)PROTEINTECH 公司，貨號(hào)SA00001?1、SA00001?2）；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（南京建成海浩生物科技有限公司，貨號(hào)A044?1?1）。引物［生工生物工程（上海）股份有限公司，221020117］；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR 試劑盒（美 國(guó)Promega 公 司，A3500、A6001）；Trizol（美國(guó)Invitrogen 公司，15596018）；Protein G Magnetic Beads（美國(guó)Cell Signaling 公司，9006S）；蛋白質(zhì)標(biāo)志 物（美國(guó) Thermo 公 司，26634）；HE 染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

1.4 儀器 紫外分光光度計(jì)（上?，F(xiàn)科儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能生命科學(xué)有限公司）；電泳儀、Real?time PCR 儀（美國(guó)BIO?RAD 公司）；灰度分析軟件（美國(guó)Alpha Innotech 公司）；液基薄層細(xì)胞制片儀（武漢宏翔惠康生物制品有限公司）。

2 方法

2.1 造模與分組 84 只SD 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為7組：空白組，假手術(shù)組，模型組，枳實(shí)通降顆粒低、中、高劑量組和普蘆卡必利組，每組各12 只，雌雄各半，分別于術(shù)后24 h 取材。所有大鼠于術(shù)前禁食24 h，禁水12 h，術(shù)后禁食不禁水。根據(jù)前期造模實(shí)驗(yàn)選擇最優(yōu)的造模方法為3%戊巴比妥鈉（3 mL／kg 體質(zhì)量腹腔注射麻醉大鼠）麻醉大鼠并固定，常規(guī)消毒鋪無菌單，逐層開腹，找到盲腸，沿盲腸根部結(jié)扎并切除結(jié)扎部分盲腸，用兩根鹽水棉簽自空腸起始部開始夾持并輕輕向遠(yuǎn)心端摩擦小腸壁，至回盲部為止，只處理1 次，然后回納小腸，分兩層關(guān)腹，整個(gè)手術(shù)過程約15 min左右；假手術(shù)組僅分層打開腹腔，然后用鹽水紗布覆蓋，15 min 后分兩層關(guān)腹。

2.2 給藥 造模術(shù)后6 h，所有大鼠均按5 mL／kg給藥量標(biāo)準(zhǔn)一次性灌胃給藥。根據(jù)大鼠體表面積換算確定給藥劑量，枳實(shí)通降顆粒低、中、高劑量組分別按照4.2、8.3、16.6 g／kg 的標(biāo)準(zhǔn)給予中藥濃縮藥液，普蘆卡必利組按照0.18 mg／kg 給藥［9］，空白組、假手術(shù)組、模型組則給予等量生理鹽水。

2.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 術(shù)后24 h 再次麻醉后心尖取血處死大鼠，打開腹腔及胸腔采集標(biāo)本后進(jìn)行分別檢測(cè)。

2.3.1 HE 染色觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變 取右肺下葉，固定、包埋、切片，蘇木精伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變情況，并采用美國(guó)胸科協(xié)會(huì)肺損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［5］進(jìn)行評(píng)分，主要指標(biāo)為肺泡上皮的損傷程度、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、肺泡隔的厚度等，總分?jǐn)?shù)為0～5分。見表1。

表1 肺損傷病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Pathology criteria for scoring of lung injury

2.3.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）肺泡中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)量計(jì)算 將大鼠胸腔和頸部打開，顯露氣管及雙側(cè)主支氣管，夾閉右主支氣管及近咽喉處遠(yuǎn)端氣管，將右肺標(biāo)本取下。于主支氣管夾閉處近端穿入的5＃頭皮針管，以5 mL 無熱原生理鹽水灌入左肺，保留9 s 后回收，再次注入并重復(fù)3 次，匯集3 次的肺泡灌洗液，立即以4 500 r／min 離心10 min，棄上清，用Hank’s 液洗細(xì)胞1 次，再離心，棄去上清液，HE 染色后，針對(duì)每份標(biāo)本，在光學(xué)顯微鏡下取10個(gè)高倍鏡視野統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)，并進(jìn)行細(xì)胞分類（吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）計(jì)數(shù)。

2.3.3 ELISA 法檢測(cè)肺組織IL?6、IL?8、TNF?α 的水平及MPO 活性 取出右中上肺葉標(biāo)本，－80 ℃冰箱保存，粉碎、勻漿、離心后取上清液，檢測(cè)肺組織中IL?6、IL?8、TNF?α 水平；參照過氧化物酶（MPO）試盒說明書操作檢測(cè)MPO 活性，MPO 活力（U／g）＝（測(cè)定OD值－對(duì)照OD值）／（11.3×參與反應(yīng)血清量）。

2.3.4 Western blot、RT?PCR 檢測(cè)肺組織MK2、p?MK2 蛋白及mRNA 表達(dá) 取各組大鼠右下肺葉標(biāo)本，按照以下步驟進(jìn)行檢測(cè)：提取組織總蛋白，BCA 法測(cè)蛋白濃度，SDS?PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，依次加入一抗及二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光并用顯影，定影試劑進(jìn)行顯影和定影，PhotoShop 整理去色，Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。觀察肺組織中MK2 及p?MK2 蛋白表達(dá)情況。按照PCR 劑盒說明書操作，提取所得肺組織中總的RNA，進(jìn)行擴(kuò)增后檢測(cè)并計(jì)算MK2、p?MK2 mRNA的表達(dá)情況。見表2。

表2 PCR 引物序列Tab.2 PCR primer sequences

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（）表示，如符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用單因素方差分析進(jìn)行多組比較，組間比較采用LSD 法分析；如不符合正態(tài)分布及方差齊性，則采用Kruskal?Wallis H 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肺組織病理形態(tài)學(xué)及評(píng)分 模型組肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺間質(zhì)和肺泡腔中有明顯的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間隔明顯增寬，偶見少量的蛋白質(zhì)殘留物組，枳實(shí)通降顆粒中、高劑量組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞減輕，肺間隔無明顯增寬，肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)中性粒細(xì)胞滲出減少。模型組與空白組及假手術(shù)組比較，評(píng)分升高（P＜0.01）；藥物干預(yù)各組與模型組比較，各干預(yù)組病理結(jié)構(gòu)改變相對(duì)較輕，以枳實(shí)通降顆粒高、中劑量為明顯（P＜0.05，P＜0.01），其次為低劑量組及普蘆卡必利組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

表3 各組大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分比較（， n＝12）Tab.3 Comparison of pulmonary histopathological scores of each group（， n＝12）

表3 各組大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分比較（， n＝12）Tab.3 Comparison of pulmonary histopathological scores of each group（， n＝12）

注：與空白組及假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與枳實(shí)通降顆粒低劑量組比較，☆☆P＜0.01；與普蘆卡必利組比較，△△P＜0.01。

圖1 枳實(shí)通降顆粒對(duì)大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變的影響（HE， ×100）Fig.1 Effects of Zhishi Tongjiang Granules on pulmonary pathomorphological changes of rats（HE， ×100）

3.2 枳實(shí)通降顆粒對(duì)模型大鼠肺組織IL?6、IL?8、TNF?α 水平的影響 與假手術(shù)組及空白組比較，模型組肺組織中炎性因子水平偏高（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物干預(yù)組炎性因子水平偏低（P＜0.01），以枳實(shí)通降顆粒中、高劑量效果最明顯，優(yōu)于其他藥物干預(yù)組（P＜0.05，P＜0.01），見表4。

表4 各組大鼠肺組織中炎癥因子IL?6、IL?8、TNF?α 水平比較（， n＝12）Tab.4 Comparison of pulmonary inflammatory factors IL?6， IL?8 and TNF?α in rats of each group（， n＝12）

表4 各組大鼠肺組織中炎癥因子IL?6、IL?8、TNF?α 水平比較（， n＝12）Tab.4 Comparison of pulmonary inflammatory factors IL?6， IL?8 and TNF?α in rats of each group（， n＝12）

注：與空白組及假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與枳實(shí)通降顆粒低劑量組比較，☆☆P＜0.01；與普蘆卡必利組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.3 枳實(shí)通降顆粒對(duì)模型大鼠肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 與假手術(shù)組及空白組比較，模型組肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)偏高（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物干預(yù)組炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)偏低（P＜0.01），以枳實(shí)通降顆粒中、高劑量效果最明顯，優(yōu)于其他藥物干預(yù)組（P＜0.05，P＜0.01），見表5。

表5 各組大鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（， n＝12）Tab.5 Comparison of inflammatory cell counts in BALF of rats in each group（， n＝12）

表5 各組大鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（， n＝12）Tab.5 Comparison of inflammatory cell counts in BALF of rats in each group（， n＝12）

注：與空白組及假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與枳實(shí)通降顆粒低劑量組比較，☆☆P＜0.01；與普蘆卡必利組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.4 枳實(shí)通降顆粒對(duì)各組大鼠肺組織中MK2、p?MK2 蛋白及mRNA 表達(dá)情況及MPO 活性的影響 與空白組及假手術(shù)組比較，模型組小腸組織p?MK2 蛋白及mRNA 的表達(dá)、MPO 活性偏高（P＜0.01）；各藥物干預(yù)組p?MK2 蛋白的表達(dá)水平、MPO 活性低于模型組（P＜0.01），以枳實(shí)通降顆粒中、高劑量組最明顯，與普蘆卡必利組及低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。各組MK2 蛋白及mRNA 的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見圖2、表6～7。

表6 各組大鼠肺組織中MK2 及p?MK2 蛋白表達(dá)情況及MPO 活性情況比較（， n＝12）Tab.6 Comparison of pulmonary MK2 and p?MK2 protein expression and MPO activity of rats in each group（， n＝12）

表6 各組大鼠肺組織中MK2 及p?MK2 蛋白表達(dá)情況及MPO 活性情況比較（， n＝12）Tab.6 Comparison of pulmonary MK2 and p?MK2 protein expression and MPO activity of rats in each group（， n＝12）

注：與空白組及假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與枳實(shí)通降顆粒低劑量組比較，☆☆P＜0.01；與普蘆卡必利組比較，△△P＜0.01。

圖2 枳實(shí)通降顆粒對(duì)各組大鼠肺組織中MK2、p?MK2蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of Zhishi Tongjiang Granules on the expression of pulmonary MK2 and p?Mk2 protein of rats in each group

4 討論

表7 各組大鼠肺組織中MK2 及p?MK2 mRNA 表達(dá)情況比較（， n＝12）Tab.7 Comparison of pulmonary MK2 and p?MK2 mRNA expression of rats in each group（， n＝12）

表7 各組大鼠肺組織中MK2 及p?MK2 mRNA 表達(dá)情況比較（， n＝12）Tab.7 Comparison of pulmonary MK2 and p?MK2 mRNA expression of rats in each group（， n＝12）

注：與空白組及假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與枳實(shí)通降顆粒低劑量組比較，☆☆P＜0.01；與普蘆卡必利組比較，△△P＜0.01。

《靈樞·本輸》曰：“肺合大腸，大腸者，傳導(dǎo)之府”，五臟之肺與六腑之大腸互為表里，關(guān)系密切，是中醫(yī)藏象學(xué)說的主要理論之一。肺與大腸不但在解剖上緊密聯(lián)系，在生理和病理上也很容易相互影響。如《靈樞·四時(shí)氣》有云，“腹中常鳴，氣上沖胸，喘不能久立，邪在大腸?！倍咴谏砩舷嗷ヒ来?，病理上相互傳變，治療上相互為用?！饵S帝內(nèi)經(jīng)靈樞集注》 云，“大腸為肺之腑而主大便，……故大腸之病，亦能上逆而反遺于肺。”臨床上當(dāng)大腸有病時(shí)，往往會(huì)影響到肺，導(dǎo)致肺臟出現(xiàn)相應(yīng)的病變，而腸道手術(shù)自然也會(huì)影響到肺，這也從中醫(yī)理論上闡明了臨床結(jié)直腸腫瘤手術(shù)后容易并發(fā)肺部感染的機(jī)理［10］。

研究證實(shí)［11?12］，肺與腸道關(guān)系密切，不但在組胚生理上具有共源性，病理生理上也相互影響。二者的黏膜上皮細(xì)胞均來自胚胎時(shí)期的內(nèi)胚層，且黏膜免疫因子具有同步性，通過淋巴系統(tǒng)歸巢等途徑相互聯(lián)系，共同發(fā)揮局部特異性免疫功能，是人體的黏膜免疫系統(tǒng)的主要構(gòu)成部分。腸道有病，腸源性有害因素可經(jīng)腸道和全身循環(huán)淋巴管、血管循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)肺部，導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)；同時(shí)，腸道功能的障礙，也會(huì)影響機(jī)體營(yíng)養(yǎng)的攝入，降低機(jī)體免疫力，容易造成術(shù)后肺部感染的易發(fā)。肺與大腸之間相互影響作用，形成了肺?腸軸聯(lián)動(dòng)學(xué)說的主要解剖和病理生理學(xué)基礎(chǔ)，這也是結(jié)直腸腫瘤手術(shù)后肺部感染易發(fā)性的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。而肺泡液中的一些炎癥因子也與肺部感染的發(fā)生密切相關(guān)，如檢測(cè)肺泡灌洗液中IL?6 水平及白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)對(duì)早期肺炎的臨床診斷就具有重要臨床意義，其敏感性要優(yōu)于血液降鈣素原檢測(cè)［13］。因此，抑制手術(shù)造成的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)胃腸功能恢復(fù)對(duì)防治腹部大手術(shù)后肺部感染具有重要意義。

手術(shù)操作誘發(fā)的炎癥反應(yīng)在術(shù)后24 h 達(dá)到最高峰，48 h 后逐步降低，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)術(shù)后24 h肺組織中的炎癥因子水平最高。引起POI 相關(guān)性炎癥反應(yīng)的機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路的共同作用［14］。P38 信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)中最重要的一條通路，其中關(guān)鍵性物質(zhì)MK2 激酶，參與并調(diào)控了炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過程。MK2 通過磷酸化而得以激活，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞遷移，調(diào)節(jié)促炎因子的釋放，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而介導(dǎo)POI 及其相關(guān)性肺損傷的重要途徑［15?16］。從實(shí)驗(yàn)中可得知，枳實(shí)通降顆粒能有效的抑制MK2 的磷酸化，具有較強(qiáng)的抗炎作用，并且與用藥劑量存在正相關(guān)。這可能正是枳實(shí)通降顆粒防治POI，進(jìn)而促進(jìn)術(shù)后胃腸功能的恢復(fù)和保護(hù)肺組織的作用機(jī)制所在。該機(jī)制的闡明，將為枳實(shí)通降顆粒的進(jìn)一步的深入研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，也為中藥復(fù)方在該領(lǐng)域的應(yīng)用研究拓展了思路。然而，中藥復(fù)方的有效成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多，枳實(shí)通降顆粒是否其還能通過其他通路產(chǎn)生作用，以及對(duì)肺?腸軸的影響作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。