藍(lán)舌病病毒群特異性RT-LAMP檢測方法的建立與初步應(yīng)用

李占鴻，朱 沛，宋子昂，李卓然，楊振興，李華春，楊 恒*，廖德芳*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明 650201)

藍(lán)舌病病毒(bluetongue virus, BTV)感染引起的動物藍(lán)舌病(bluetongue, BT)是一種侵害反芻動物的烈性蟲媒傳染病，綿羊感染后臨床癥狀最為典型，表現(xiàn)為高熱、消瘦、口唇充血腫脹及糜爛、鼻腔和胃腸黏膜出血潰瘍、蹄冠脫落引起跛行等[1-2]。當(dāng)新血清型BTV傳入時(shí)，感染綿羊的發(fā)病率可達(dá)80%，死亡率高達(dá)40%，嚴(yán)重影響牛羊畜產(chǎn)品的正常國際貿(mào)易，給牛羊養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。世界動物衛(wèi)生組織(Office International des Epizooties, OIE)將BT列為法定報(bào)告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[4]。目前，已在世界范圍確認(rèn)了27種BTV血清型(BTV-1～BTV-27)[5-6]，我國存在12種血清型BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-5、 -7、-9、-12、-15、-16、-21與-24)的流行，主要分布于云南、廣東、廣西、江蘇、湖南和新疆等地區(qū)[[7-10]。

BTV為呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)成員，病毒基因組大小約20 kb，由10個(gè)節(jié)段(Seg-1～Seg-10)的雙鏈RNA(double stranded RNA, dsRNA)組成，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)和5種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3a與NS4)[11-12]。Seg-5編碼的NS1蛋白是高度保守的微管形成蛋白，可促進(jìn)BTV編碼蛋白的表達(dá)[13]。遺傳進(jìn)化分析表明，BTV的Seg-5/NS1序列在不同血清型毒株之間高度保守[14]，可作為BTV群特異性核酸檢測的靶基因[15-16]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)是Notomi等[17]在2000年發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增方法。該方法針對靶基因的6個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，利用BstDNA聚合酶的鏈置換活性，在64 ℃恒溫條件下反應(yīng)約1 h 即可完成擴(kuò)增，加入環(huán)引物后還可大大縮短反應(yīng)時(shí)間，僅需30 min左右即可完成擴(kuò)增過程[18]。LAMP與其他病原檢測技術(shù)相比，無需昂貴的儀器設(shè)備，反應(yīng)過程在恒溫水浴鍋中即可完成，檢測速度快，肉眼即可判定結(jié)果，非常適合病原的現(xiàn)場快速檢測，目前已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的檢測[19-21]。當(dāng)前，關(guān)于BTV的LAMP檢測方法的報(bào)道較少，尚未建立針對所有BTV血清型毒株的群特異性LAMP檢測方法，國內(nèi)也未建立針對中國流行的12種BTV血清型毒株的LAMP檢測方法。

本研究根據(jù)中國分離的12種BTV血清型毒株的Seg-5序列，選擇高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)RT-LAMP檢測引物，建立了針對中國BTV毒株的群特異性RT-LAMP檢測方法，該方法具有良好的靈敏度和特異性，45 min即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，為我國BTV的檢測診斷提供了一種方便快捷的方法。

1 材料與方法

1.1 病毒株、血液樣品與核酸樣品

本實(shí)驗(yàn)室1996—2020年分離的12種血清型BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21與-24)代表毒株，病毒信息見表1，病毒的血清型通過RT-PCR與測序確認(rèn)；動物流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV)血清10型毒株[22]、中山病病毒(Chuzan disease virus, CHUV)[23]、阿卡斑病毒(Akabane disease virus, AKAV)由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus, FMDV)滅活疫苗購自乾元浩生物股份有限公司保山生物公司；非洲馬瘟病毒(African horse sickness virus，AHSV)滅活疫苗引自世界動物衛(wèi)生組織(OIE)參考實(shí)驗(yàn)室(Onderstepoort Veterinary Institute: South Africa)。12種血清型BTV感染動物的陽性血液樣本共計(jì)120份(從對應(yīng)陽性血液中分離出BTV毒株)，于2013—2020年采集自云南省設(shè)立的哨兵?；蛏窖?；2020年采集自云南景洪及師宗監(jiān)控牛和羊的EDTA 抗凝血液樣品各30份；拷貝數(shù)為(1.48×1012拷貝·μL-1)的BTVSeg-10 ssRNA由本實(shí)驗(yàn)室制備[24]并保存。

表1 中國分離的12種血清型BTV代表毒株分離信息

1.2 主要試劑

WarmStart?LAMP 變色預(yù)混液購自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)公司(北京)；實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR試劑盒、DL5000 DNA marker購自寶生物工程(大連)有限公司；磁珠法病毒核酸提取試劑盒購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)。

1.3 核酸準(zhǔn)備

取50 μL病毒液或者血液樣品，使用MagMax磁珠法病毒核酸提取試劑盒，按操作說明書在MagMaX Express96核酸自動提取儀(ABI)上進(jìn)行病毒核酸的提取。將提取的核酸于94 ℃變性3 min，立即冰浴，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)、合成與篩選

從GenBank中下載不同血清型BTV的Seg-5序列，與本課題組前期獲取的中國流行的12種BTV血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、 -21與-24)毒株的Seg-5全長序列(共75條)進(jìn)行序列比對分析，選擇Seg-5的高度保守區(qū)域，利用Primer Exporer V4在線軟件設(shè)計(jì)4組LAMP引物，各組引物均包括2條外引物BTV-F3/B3，2條內(nèi)引物BTV-FIP/BIP和2條環(huán)引物BTV-LF/LB(表2)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以BTV1/V143 變性核酸為模板，參照“WarmStart LAMP預(yù)混液”試劑盒說明書，進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，反應(yīng)體系為：WarmStart LAMP 2× Master Mix 12.5 μL、BTV-FIP/BIP 引物(40 μmol·L-1)各1 μL、BTV-F3/B3引物 (20 μmol·L-1) 各1 μL、 BTV-LF/LB (20 μmol·L-1) 各1 μL，核酸模板2 μL，加入無RNA酶H2O補(bǔ)足至25 μL，設(shè)ddH2O為陰性對照；反應(yīng)條件初步設(shè)置為60 ℃，反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)反應(yīng)液顏色變化判定結(jié)果，溶液保存紅色不變，表示檢測結(jié)果為陰性；由紅色變?yōu)辄S色表示結(jié)果為陽性，同時(shí)取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，選取最佳引物組合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

表2 研究所用引物信息

1.5 BTV群特異性RT-LAMP檢測方法的建立

1.5.1 反應(yīng)條件優(yōu)化 為摸索RT-LAMP最佳反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間，以BTV1/V143毒株核酸為檢測模板，設(shè)置5個(gè)溫度梯度：58、60、62、64、66 ℃，按照“1.4”中的反應(yīng)體系配制反應(yīng)液，反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為20、30、45、60和75 min。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)反應(yīng)溶液顏色變化判定結(jié)果，同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測，確定RT-LAMP的最佳反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間。

1.5.2 引物濃度及比例優(yōu)化 在最佳反應(yīng)條件下，以BTV1/V143毒株核酸為檢測模板，分別設(shè)置5組不同的引物濃度比(表3)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)完成后，根據(jù)反應(yīng)溶液顏色變化判定結(jié)果，同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測，確定最佳引物濃度及比例。

1.6 RT-LAMP反應(yīng)特異性和靈敏度試驗(yàn)

1.6.1 RT-LAMP反應(yīng)特異性試驗(yàn) 根據(jù)“1.5”確定的最佳反應(yīng)條件，分別取“1.3”準(zhǔn)備的12種BTV血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、 -21與-24)代表毒株、EHDV、CHUV、AKAV毒株以及FMDV和AHSV疫苗毒株變性核酸為模板，同時(shí)以滅菌ddH2O為陰性對照，進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，驗(yàn)證BTV RT-LAMP檢測方法的特異性。

表3 引物濃度及比例優(yōu)化

1.6.2 RT-LAMP反應(yīng)靈敏度試驗(yàn) 取BTV1/V143毒株的變性核酸為模板，以BTVSeg-10 ssRNA為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的BTV 群特異性qRT-PCR方法[24]進(jìn)行絕對定量。根據(jù)核酸定量結(jié)果，適當(dāng)調(diào)整BTV1/V143核酸濃度，梯度稀釋至4.5×105～4.5×100拷貝·μL-1，以不同濃度的BTV1/V143核酸為模板，按照“1.5”確定的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行BTV qRT-PCR檢測[24]，分析RT-LAMP檢測方法的靈敏度及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.7 RT-LAMP檢測范圍覆蓋度分析

1.7.1 對中國分離BTV毒株的檢測 為分析建立的RT-LAMP檢測方法是否可以準(zhǔn)確檢測中國分離BTV毒株的血清型，提取1996—2020年分離自云南、廣西、廣地及江蘇等省市的12種血清型BTV毒株核酸共計(jì)46份，按照“1.5”確定的最優(yōu)反應(yīng)條件進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。

1.7.2 對BTV陽性血液樣品的檢測 為分析建立的BTV RT-LAMP檢測方法對于牛羊血液樣品中BTV核酸的檢測效果，取2013—2020年采集自12種血清型BTV感染的牛羊監(jiān)控動物的血液樣品核酸各10份，分別進(jìn)行BTV的群特異性RT-LAMP檢測和qRT-PCR檢測[24]，比較二者的檢出率及檢測結(jié)果的吻合程度。

1.8 臨床血液樣品的檢測

取“1.3”提取的2020年采集自云南景洪及師宗的哨兵牛和羊EDTA抗凝血液樣品核酸共計(jì)60份，以4 μL 變性核酸為模板，同步進(jìn)行BTV RT-LAMP檢測和qRT-PCR[24]檢測，比較兩種方法對于臨床血液樣品的實(shí)際檢測效果。

2 結(jié) 果

2.1 BTV RT-LAMP最佳引物的篩選

選擇中國BTV毒株Seg-5序列高度保守區(qū)，設(shè)計(jì)出4組LAMP引物，以提取的BTV1/ V143毒株核酸為檢測模板，對引物進(jìn)行初步篩選。反應(yīng)結(jié)果顯示，第1、2、3組引物對應(yīng)的反應(yīng)液顏色均由紅色變?yōu)辄S色，而第4組引物的反應(yīng)液顏色保持紅色不變；擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，第4組引物無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，第1、2、3組引物均擴(kuò)增出梯度條帶，其中第2組引物的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶最亮，且陰性對照成立，因此選擇第2組進(jìn)行BTV RT-LAMP檢測方法的建立(圖1)，其序列：5′-TGGAGCGCTTTTTGAGAA-3′ (BTV-F3)，5′-ATGGATTTCTTGTTGGGATTAT-3′(BTV-B3)，5′-TGACTRCAAG TCCATTGAGGTGATA-ATCAGTGGGGATTA TGCTAA-3′(BTV-FIP)，5′-AATGGGATGTGTGTCAAACAAAATT- GGYTCCTCAGCATCAG TTG-3′ (BTV-BIP)， 5′- GCCAAAAAAGTTCT CGTGGCA-3′ (BTV-LF)，5′- GAAAGAGCAATGATTGCAG-3′ (BTV-LB)。

2.2 RT-LAMP檢測方法的建立

2.2.1 反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果 以BTV1/V143毒株核酸為模板，進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化，結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度為58 ℃時(shí)，反應(yīng)液顏色變化不明顯，僅產(chǎn)生微弱的擴(kuò)增條帶；反應(yīng)溫度為60～64 ℃時(shí)，反應(yīng)液顏色由紅色變?yōu)辄S色，電泳結(jié)果顯示64 ℃條件下，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶最強(qiáng)，說明此溫度下，LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增效率最高，因此確定最佳反應(yīng)溫度為64 ℃(圖2)。

A. 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳；B. 反應(yīng)結(jié)束反應(yīng)液顏色變化。M. DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2. 第1組引物陽性擴(kuò)增結(jié)果及陰性對照；3～4.第2組引物陽性擴(kuò)增結(jié)果及陰性對照；5～6.第3組引物陽性擴(kuò)增結(jié)果及陰性對照；7～8.第4組引物陽性擴(kuò)增結(jié)果及陰性對照A. Electrophoresis analysis of the amplified products; B. Color of the reaction mixture after the amplification. M. DL5000 DNA marker; 1-2. Positive result and negative control of the group 1 primer; 3-4.Positive result and negative control of the group 2 primer; 5-6.Positive result and negative control of the group 3 primer; 7-8.Positive result and negative control of the group 4 primer圖1 BTV RT-LAMP引物篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of the RT-LAMP primers for BTV

A. 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳；B. 反應(yīng)結(jié)束反應(yīng)液顏色變化。M. DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5.反應(yīng)溫度分別為66, 64, 62, 60和58 ℃A. Electrophoresis analysis of the amplified products; B. Color of the reaction mixture after the amplification. M. DL5000 DNA marker; 1-5.RT-LAMP carried out at 66, 64, 62, 60 and 58 ℃, respectively圖2 BTV LAMP反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Determination of the optimal temperature for BTV RT-LAMP

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果表明，64 ℃條件下擴(kuò)增30 min，反應(yīng)液顏色即出現(xiàn)改變，但擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶較弱；延長擴(kuò)增時(shí)間至45、60和75 min，反應(yīng)液顏色變化顯著，產(chǎn)物電泳條帶強(qiáng)度無明顯差異(圖3)，因此綜合考慮擴(kuò)增效果及反應(yīng)時(shí)間，確定最佳擴(kuò)增時(shí)間為45 min。綜上，本研究建立的BTV RT-LAMP檢測方法的最佳反應(yīng)條件為64 ℃，反應(yīng)45 min。

2.2.3 引物濃度及比例優(yōu)化結(jié)果 引物濃度及比例優(yōu)化結(jié)果顯示，在最佳反應(yīng)條件下，當(dāng)外引物：內(nèi)引物：環(huán)引物濃度比為0.2 μmol·L-1∶0.6 μmol·L-1∶0.4 μmol·L-1時(shí)，RT-LAMP 反應(yīng)液顏色變化顯著，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶最強(qiáng)(圖4)，表明此時(shí)的反應(yīng)效率最高，因此確定BTV RT-LAMP反應(yīng)中外引物：內(nèi)引物：環(huán)引物濃度的最佳引物濃度及比例為0.2 μmol·L-1∶0.6 μmol·L-1∶0.4 μmol·L-1。

2.3 RT-LAMP反應(yīng)特異性試驗(yàn)

采用建立的RT-LAMP檢測方法，分別以12種BTV血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21與-24)代表毒株、EHDV、CHUV、BEFV、AKAV毒株以及FMDV和AHSV疫苗毒株變性核酸為模板，驗(yàn)證RT-LAMP檢測方法的特異性。結(jié)果以12種BTV血清型毒株核酸為模板均可產(chǎn)生明顯梯度狀條帶，反應(yīng)液由紅色變?yōu)辄S色，而其他病毒及陰性對照的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性(圖5)，表明建立的RT-LAMP檢測方法具有良好的特異性。

2.4 RT-LAMP反應(yīng)靈敏度試驗(yàn)

對提取的BTV1/V143核酸進(jìn)行絕對定量，結(jié)果表明該毒株的核酸量為4.5×1010拷貝·μL-1。以梯度稀釋至4.5×105～4.5×100拷貝·μL-1的病毒核酸為模板分別進(jìn)行RT-LAMP檢測和BTVqRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，本研究建立的RT-LAMP檢測方法對BTV1/V143核酸的檢測下限為4.5拷貝·μL-1(圖6)，與BTV qRT-PCR檢測靈敏度一致，表明建立的RT-LAMP檢測方法具有較高的靈敏度，且檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

A.擴(kuò)增產(chǎn)物電泳；B.反應(yīng)結(jié)束反應(yīng)液顏色變化。M. DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5.BTV LAMP外引物∶內(nèi)引物∶環(huán)引物濃度分別為0.2∶0.4∶0.2 μmol·L-1，0.2∶0.6∶0.4 μmol·L-1，0.2∶0.8∶0.6 μmol·L-1，0.2∶ 1.6∶0.8 μmol·L-1，0.2∶2.0∶1.0 μmol·L-1A. Electrophoresis analysis of the amplified products; B. Color of the reaction mixture after the amplification. M. DL5000 DNA Marker; 1-5.Concentration of the outer primers: inner primers: loop primers were 0.2∶ 0.4∶ 0.2 μmol·L-1, 0.2∶ 0.6∶ 0.4 μmol·L-1, 0.2∶0.8∶0.6 μmol·L-1, 0.2∶1.6∶0.8 μmol·L-1 and 0.2∶2.0∶1.0 μmol·L-1圖4 BTV LAMP反應(yīng)引物濃度及比例優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimization results of primer concentration and ratio for BTV RT-LAMP

2.5 RT-LAMP檢測范圍覆蓋度分析

以提取的1996—2020年分離自云南、廣西、廣東及江蘇等省的不同BTV血清型毒株核酸為模板，進(jìn)行BTV RT-LAMP檢測，結(jié)果46份核酸均為陽性，表明本研究建立的BTV RT-LAMP檢測方法對于中國不同時(shí)間、不同地域分離的BTV毒株具有良好的檢測效果。

對12種血清型BTV感染的牛羊監(jiān)控動物血液樣品共計(jì)120份進(jìn)行qRT-PCR及RT-LAMP檢測，其中RT-LAMP檢出BTV核酸陽性樣品數(shù)為106份，陽性率為88.33%(106/120)，而qRT-PCR共檢出108份BTV核酸陽性樣品，陽性率為90.00%(108/120)，樣品Ct值為30.5～37.0，兩種方法的檢測結(jié)果符合率為95.0% (表4)，根據(jù)McNemar檢驗(yàn)，P>0.05，說明兩種方法在BTV陽性檢出率上無顯著差別，表明本研究建立的RT-LAMP方法對于BTV核酸陽性血液樣品的檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

A. 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳；B. 反應(yīng)結(jié)束反應(yīng)液顏色變化。M. DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～12. 分別為BTV-1、-2、-3、-4、-5、 -7、-9、-12、-15、-16、-21、-24毒株核酸擴(kuò)增結(jié)果；13～17.分別為EHDV、CHUV、AKAV、FMDV、AHSV毒株核酸擴(kuò)增結(jié)果；18.陰性對照A. Electrophoresis analysis of the amplified products; B. Color of the reaction mixture after the amplification. M. DL5000 DNA marker; 1-12. Amplification results of BTV-1, -2, -3, -4, -5, -7, -9, -12, -15, -16, -21 and -24; 13-17.Amplification results of EHDV, CHUV, AKAV, FMDV and AHSV; 18.Negative control圖5 BTV LAMP特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Specificity test results of BTV RT-LAMP

2.6 臨床樣品的檢測

對2020年采集的60份哨兵牛羊血液分別進(jìn)行BTV RT-LAMP檢測和qRT-PCR檢測，兩種方法均檢出15份BTV陽性樣品(5份牛血液陽性，10份羊血液陽性)，且檢出的陽性樣品吻合率為100%，進(jìn)一步表明建立的BTV RT-LAMP對于臨床血液樣品具有良好的檢測效果，可用于牛羊血液樣品中BTV核酸的檢測。

A. 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳；B. 反應(yīng)結(jié)束反應(yīng)液顏色變化；C. qRT-PCR檢測結(jié)果Ct值。M. DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對照；2～7.分別為以4.5×100～4.5×105拷貝·μL-1的BTV1/V143核酸為模板的擴(kuò)增結(jié)果A. Electrophoresis analysis of the amplified products; B. Color of the reaction mixture after the amplification; C. Ct value of the BTV qRT-PCR. M. DL5000 DNA marker; 1.Negative control; 2-7.Concentrations of BTV1/V143 dsRNA ranged from 4.5×100-4.5×105 copies ·μL-1, respectively圖6 BTV RT-LAMP靈敏度驗(yàn)證結(jié)果Fig.6 Sensitivity test results of BTV RT-LAMP

表4 BTV核酸陽性動物血液樣品RT-LAMP和qRT-PCR檢測結(jié)果的比較

3 討 論

普通RT-PCR[25]、巢氏PCR[16]和實(shí)時(shí)熒光定量PCR[15]等常用的BTV核酸檢測方法，需要使用PCR儀、電泳儀等較為昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，無法進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測。本研究建立的針對中國毒株的RT-LAMP檢測方法，使用恒溫水浴鍋，在45 min內(nèi)即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)使用WarmStart?LAMP 變色預(yù)混液作為反應(yīng)試劑，陽性結(jié)果的反應(yīng)液顏色由紅色變?yōu)辄S色，肉眼即可區(qū)別陰性和陽性檢測結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的現(xiàn)場可視化。

雖然Mohandas等[26]及Maan等[27]都分別報(bào)道了BTV 群特異性RT-LAMP檢測方法，但是他們建立的方法主要是針對印度流行的BTV血清型毒株開發(fā)的，其中Mohandas等[26]建立的方法針對BTV-1、-2、-9、-10、-16、-21和-23等7種BTV血清型毒株，Maan等[27]建立的方法則針對BTV-1、-2、-3、 -5、-9、-10、-16、-21、-23和-24等10種BTV血清型毒株，兩種方法均未涵蓋中國流行的所有BTV血清型毒株。因此，本研究根據(jù)中國流行的BTV血清型毒株開發(fā)了相應(yīng)的RT-LAMP檢測方法。為保證建立方法對中國毒株具有良好的檢出效果，我們選擇中國毒株Seg-5序列的高度保守區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，同時(shí)，為驗(yàn)證建立方法對于中國毒株的實(shí)際檢測效果，分別對中國不同地域、不同時(shí)間分離的12種BTV血清型代表毒株進(jìn)行了驗(yàn)證，檢出率為100%，表明建立的方法對于中國毒株具有很好的檢測效果。

由于BTV為RNA病毒，所以在驗(yàn)證BTV核酸檢測方法的靈敏度時(shí)，以確定核酸拷貝的病毒RNA為檢測樣品，比使用含有檢測靶基因的重組質(zhì)粒更為準(zhǔn)確可靠。因此，本研究使用體外轉(zhuǎn)錄的ssRNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，對BTV1/V143毒株核酸進(jìn)行了絕對定量，再以梯度稀釋的BTV1/V143核酸為模板進(jìn)行RT-LAMP靈敏度測試。試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的BTV RT-LAMP檢測方法靈敏度可到4.5拷貝·μL-1，與本實(shí)驗(yàn)室前期建立的BTV qRT-PCR檢測方法靈敏度相當(dāng)[24]。

RT-LAMP檢出BTV核酸陽性樣品數(shù)為106份，而qRT-PCR共檢出108份BTV核酸陽性樣品，檢測結(jié)果的符合率為95.0%(表4)。其中4份樣品qRT-PCR檢測結(jié)果為陽性而RT-LAMP結(jié)果為陰性，該4份樣品的Ct值在36.7～36.9，已接近qRT-PCR陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)(Ct值≤37)，說明樣品中的病毒核酸量已很低，因此檢測過程中輕微的加樣誤差都會導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。作者分析這幾份樣品的保存時(shí)間都在5～8年，很可能是因?yàn)楸４鏁r(shí)間過長導(dǎo)致BTV核酸部分降解。兩種方法對2020年采集樣品的檢測結(jié)果完全一致，說明兩種方法對于保存時(shí)間較短的樣品均具有很好的檢測效果。

4 結(jié) 論

建立的BTV RT-LAMP檢測方法具有反應(yīng)快速、結(jié)果可視化、特異性強(qiáng)和敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，為我國開展BTV檢測診斷與流行病學(xué)研究提供了技術(shù)支持。