甜葉菊綠原酸增強(qiáng)大腸桿菌感染蛋雛雞免疫力研究

卓春柳，王方方，鐘翠紅，王 斌，石玉祥，徐美利，武亞南，張永英*

(1.河北工程大學(xué)，邯鄲 056000； 2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，邯鄲 056000)

大腸桿菌病是家禽養(yǎng)殖業(yè)十分常見的疾病，飼養(yǎng)密度大、環(huán)境條件差、飼養(yǎng)管理不當(dāng)均可導(dǎo)致家禽機(jī)體免疫力急劇下降，誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，往往還會(huì)造成大腸桿菌等條件病原菌易感性增加[1]。大腸桿菌是正常機(jī)體內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)的共生菌，但機(jī)體內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)失調(diào)時(shí)，可引起機(jī)體發(fā)病[2]，其中，腸外致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli, APEC)可引起家禽多種病癥，例如臍炎、卵黃囊感染、蜂窩織炎等。APEC雖是腸外致病菌，但APEC與腸道致病性大腸桿菌具有同源性，同樣具有腸道致病性[3]。APEC侵襲會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生，增加IL-1β、IL-2和TNF-α等表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致上皮屏障功能受損，誘發(fā)大腸桿菌病[4]。機(jī)體早期腸道微生物群的變化會(huì)影響腸道細(xì)菌與腸黏膜宿主細(xì)胞之間的相互作用[5]，腸道結(jié)構(gòu)在正常狀態(tài)下保持相對(duì)穩(wěn)定，但在病理狀態(tài)下，病原微生物及其代謝產(chǎn)物作用于腸道黏膜，其完整性會(huì)被破壞，尤其是細(xì)胞與細(xì)胞間的緊密連接受到損傷時(shí)，就會(huì)引起病原微生物的侵入[6]。因此，增強(qiáng)腸道上皮屏障功能，維持腸道菌群穩(wěn)定，抑制APEC黏附定植是抑制APEC致病的關(guān)鍵。

目前，飼料端禁抗、畜禽養(yǎng)殖端“減抗限抗”，APEC對(duì)抗生素呈現(xiàn)多種耐藥[7]，因此，急需開發(fā)低成本且綠色安全有效的抗生素替代品以預(yù)防大腸桿菌病等細(xì)菌性疾病。綠原酸(chlorogenic acid, CGA)是一種天然植物抗菌、抗氧化劑，可提自咖啡豆、水果、蔬菜、杜仲科、菊科及忍冬科等多種植物，具有抗炎抑菌、抗氧化、抗糖尿病、抗癌等生理功能[8-9]，其參與機(jī)體物質(zhì)代謝、免疫調(diào)控，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫能力和體液免疫能力，促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)育。研究資料表明，攝入CGA可降低多種疾病的風(fēng)險(xiǎn)。畜牧生產(chǎn)中有關(guān)CGA在斷奶仔豬[10-14]、魚[15-16]和鼠[17-19]的應(yīng)用研究已取得一定進(jìn)展，結(jié)果表明，CGA可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，維持腸道微生物菌群穩(wěn)定[20]，抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，降低腸道通透性，修復(fù)腸道結(jié)構(gòu)損傷，調(diào)節(jié)腸道組織炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)腸道屏障功能[19]，提高斷奶仔豬[12]和鼠[21]機(jī)體免疫力，但CGA對(duì)蛋雛雞有何影響卻未見報(bào)道。

本研究通過(guò)腹氣囊感染大腸桿菌O78構(gòu)建蛋雛雞大腸桿菌感染模型，根據(jù)機(jī)體抗氧化力、免疫力指標(biāo)和緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)以及通過(guò)對(duì)盲腸內(nèi)容物微生物種類進(jìn)行高通量測(cè)序，探究甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染蛋雛雞免疫功能和腸道屏障結(jié)構(gòu)的影響，旨在研究甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染大腸桿菌O78蛋雛雞免疫力的作用機(jī)制，為甜葉菊綠原酸用作新型抗生素替代品提供基礎(chǔ)參數(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料

甜葉菊綠原酸(純度為60%綠原酸)和杜仲素(8%綠原酸)由晨光生物科技集團(tuán)提供；大腸桿菌O78來(lái)自河北工程大學(xué)預(yù)防實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

隨機(jī)將1日齡、體重?zé)o顯著差異的360只健康海蘭蛋雞分為6組，分組見表1，空白對(duì)照組(C)、大腸桿菌O78處理組(EC0)、1.0 g·L-1杜仲素+大腸桿菌O78處理組(ED1)、1.0 g·L-1CGA+大腸桿菌O78處理組(EC1)、2.0 g·L-1CGA+大腸桿菌O78處理組(EC2)、4.0 g·L-1CGA+大腸桿菌O78處理組(EC4)，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只雞，公母各半。預(yù)飼7 d后開始正式試驗(yàn)，在蛋雛雞7日齡感時(shí)染大腸桿菌O78：腹氣囊注射1.21×108cfu·mL-1大腸桿菌O78懸液，0.5 mL·只-1，并對(duì)病死雛雞進(jìn)行剖檢和實(shí)驗(yàn)室檢查。同時(shí)按表1分別向試驗(yàn)組蛋雛雞飲水中添加不同藥物，每日1次，連用3 d，按飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)管理，試驗(yàn)動(dòng)物基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2，試驗(yàn)周期10 d，飼養(yǎng)試驗(yàn)于2019年在河北省邯鄲市河北工程大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行。

表1 試驗(yàn)分組

1.3 ELISA檢測(cè)血清免疫相關(guān)指標(biāo)

每組隨機(jī)取4只雞，心臟取血，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液并分裝，獲得血清樣品，于-20 ℃冰箱凍存待測(cè)。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒(南京建成生物工程有限公司)說(shuō)明書檢測(cè)血清IL-1β、 IL-2、IL-6、IgM、IgA、TNF-α水平。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)腸道因子表達(dá)量

每組隨機(jī)取4只雞，解剖后取其空腸和回腸，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。嚴(yán)格按照試劑盒(普洛麥格公司)說(shuō)明書提取RNA，將經(jīng)過(guò)質(zhì)檢后合格的RNA制備成cDNA，以β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)NCBI-Gene所收錄基因CDS序列，利用Primer5.0、Primer Plus和DNAMAN等軟件，設(shè)計(jì)基因引物，引物序列見表3，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司天津分公司合成。以上述合成的cDNA作為模板，利用熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增。反應(yīng)體系：模板cDNA溶液1.0 μL，Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，總計(jì)25 μL。利用2-△Ct相對(duì)定量法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式：△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.5 盲腸食糜微生物菌群16S rDNA測(cè)序

每組隨機(jī)取4只雞，解剖后無(wú)菌采集盲腸組織，置于-80 ℃儲(chǔ)存，隨后進(jìn)行高通量測(cè)序分析。文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

表3 引物序列

1.6 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS 20.0 進(jìn)行處理分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用方差分析，不同字母標(biāo)注表示差異顯著(P<0.05)。柱狀圖作圖軟件為GraphPad Prism5。

2 結(jié) 果

2.1 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染大腸桿菌蛋雛雞的保護(hù)

腹氣囊感染大腸桿菌數(shù)小時(shí)后，個(gè)別蛋雛雞出現(xiàn)精神頹靡、雙翅下垂(圖1)，并排有黃綠色或白色糞便。對(duì)病死雞進(jìn)行臨床檢查，可發(fā)現(xiàn)雞大腸桿菌病典型病理變化(圖2)：心包增厚并覆滿白色或黃色纖維性滲出物，肝腫大并覆有白色或淡黃色纖維性滲出物，腸道黏膜出血、脫落。臨床檢查后取病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查(圖3)：在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成桃紅色、圓形菌落，在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上形成紫黑色帶有金屬光澤的圓形菌落，染色、鏡檢確定其為兩端鈍圓的革蘭陰性短桿菌，后通過(guò)生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定，病料中分離的大腸桿菌和感染所用大腸桿菌為同一菌株，表明成功建立了大腸桿菌感染模型。圖4顯示，腹氣囊感染大腸桿菌O78顯著增加了蛋雛雞死亡率(P<0.05)，而在應(yīng)用甜葉菊綠原酸后，蛋雛雞死亡率明顯降低，且EC2和EC4組(2.0和4.0 g·L-1甜葉菊綠原酸)作用效果優(yōu)于ED1組(P<0.05)。

圖1 蛋雛雞精神頹靡、雙翅下垂Fig.1 The layers with depressed spirit and drooping wings

圖2 病死雞臨床檢查Fig.2 Clinical examination of sick layers

圖3 病死雞實(shí)驗(yàn)室檢查Fig.3 Laboratory examination of sick layers

所標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同Different letters mean significant difference among treatments(P<0.05), same letter means no significant difference among treatments(P>0.05). The same as below圖4 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染大腸桿菌蛋雛雞的保護(hù)率Fig.4 The protective effect of stevia chlorogenic acid on layers with abdominal air sac infection of E.coli

2.2 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染大腸桿菌蛋雛雞血清免疫指標(biāo)的影響

與C組相比，腹氣囊感染大腸桿菌O78蛋雛雞血清IgA和IgM含量顯著降低(P<0.05)，蛋雛雞血清炎性因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.05)。與EC0和ED1組相比，甜葉菊綠原酸添加組血清IgA和IgM含量有升高趨勢(shì)，其中EC4組蛋雛雞血清IgA和IgM含量顯著升高(P<0.05)。與EC0組相比，應(yīng)用杜仲素和甜葉菊綠原酸后，蛋雛雞血清炎性因子含量不同程度降低，其中ED1、EC1、EC2和EC4組血清TNF-α含量顯著降低(P<0.05)；與ED1相比，EC1組血清炎性因子含量無(wú)顯著性變化(P>0.05)，但EC2和EC4組血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α含量有所升高(圖5)。

圖5 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染大腸桿菌蛋雛雞血清免疫指標(biāo)影響結(jié)果Fig.5 Effect of stevia chlorogenic acid on serum immune indexes of layers infected with E.coli by abdominal air sac

2.3 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染大腸桿菌蛋雛雞回腸、空腸免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

與C組相比，腹氣囊感染大腸桿菌O78顯著增加蛋雛雞回腸炎性因子IL-1β、IL-2、TNF-α基因表達(dá)(P<0.05)，增加空腸炎性因子TNF-α基因表達(dá)(P>0.05)。與EC0組相比，ED1和甜葉菊綠原酸處理組(EC1、EC2、EC4)蛋雛雞回腸炎性因子IL-1β、TNF-α基因表達(dá)顯著降低(P<0.05)，ED1和EC2組蛋雛雞回腸炎性因子IL-2基因表達(dá)顯著降低(P<0.05)； 而空腸炎性因子基因表達(dá)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與ED1組相比，綠原酸添加組無(wú)顯著差異，但EC2組蛋雛雞回腸炎性因子IL-1β、TNF-α基因表達(dá)降低(P>0.05)，但甜葉菊綠原酸處理組(EC1、EC2、EC4)各組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)； 而空腸炎性因子基因表達(dá)均無(wú)顯著性差異(P>0.05，圖6、圖7)。

2.4 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染大腸桿菌蛋雛雞回腸、空腸緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響

與C組相比，腹氣囊感染大腸桿菌O78增加蛋雛雞回腸緊密連接蛋白Claudin-1(P<0.05)和ZO-1的基因表達(dá)(P>0.05)，而ED1和甜葉菊綠原酸處理組(EC1、EC2、EC4)可抑制大腸桿菌O78感染引起的蛋雛雞回腸緊密連接蛋白基因表達(dá)。與C組相比，腹氣囊感染大腸桿菌O78顯著降低空腸緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的基因表達(dá)(P<0.05)，而ED1和甜葉菊綠原酸處理組(EC1、EC2、EC4)可增加大腸桿菌O78感染蛋雛雞空腸緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的基因表達(dá)(P>0.05)，但各組之間差異不顯著(P>0.05，圖8、圖9)。

圖6 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染大腸桿菌蛋雛雞回腸免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of stevia chlorogenic acid on ileum immune-related gene expression of layers infected with E.coli by abdominal air sac

圖7 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染蛋雛雞空腸免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effect of stevia chlorogenic acid on jejunum immune-related gene expression of layers infected with E.coli by abdominal air sac

2.5 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染大腸桿菌蛋雛雞盲腸食糜微生物菌群的影響

2.5.1 腸道菌群豐度及多樣性分析 經(jīng)高通量測(cè)序結(jié)果分析，24個(gè)樣品測(cè)序通過(guò)剪切過(guò)濾，平均每樣品測(cè)得79 978條序列，經(jīng)質(zhì)控平均得到75 403條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效率達(dá)94.36%。對(duì)各組樣品OTU數(shù)量及多樣性指數(shù)Shannon進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表4，EC2組OTU、Chao1顯著高于C組(P<0.05)，EC2組OTU、Shannon均高于EC0組，但OTU、Shannon、Chao1均低于ED1組(P>0.05)。PCA分析發(fā)現(xiàn)，各組微生物群落結(jié)構(gòu)組內(nèi)和組間變異較大，可看出大腸桿菌O78感染組與對(duì)照組之間有明顯不同(圖10)。由圖11可知，大腸桿菌O78感染會(huì)導(dǎo)致雞特有OTUs增加，大腸桿菌O78可能會(huì)影響盲腸微生物菌群組成。

2.5.2 門分類水平上試驗(yàn)蛋雛雞腸道菌群分類學(xué)分析 結(jié)果如圖12所示，正常蛋雛雞盲腸微生物群落主要以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacterooidetes)及變形菌門(Proteobacteria)為主，這3種微生物含量占到99%以上。與C組相比，腹氣囊感染大腸桿菌O78(EC0組)增加了蛋雛雞擬桿菌門、變形菌門和梭桿菌門(Fusobacteria)的相對(duì)豐度，降低了蛋雛雞厚壁菌門的相對(duì)豐度。與EC0組相比，ED1組可提高大腸桿菌感染蛋雛雞盲腸厚壁菌門的相對(duì)豐度，降低大腸桿菌感染蛋雛雞盲腸變形菌門和梭桿菌門的相對(duì)豐度；EC2組可提高大腸桿菌感染蛋雛雞盲腸厚壁菌門的相對(duì)豐度，降低大腸桿菌感染蛋雛雞盲腸擬桿菌門、變形菌門和梭桿菌門的相對(duì)豐度，作用效果優(yōu)于ED1組。

3 討 論

3.1 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染大腸桿菌蛋雛雞的保護(hù)

大腸桿菌感染會(huì)導(dǎo)致蛋雛雞大量死亡，不僅給家禽養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，并且還會(huì)威脅到人類食品安全[2]。當(dāng)機(jī)體免疫力降低時(shí)，雞大腸桿菌病還會(huì)繼發(fā)于其他疾病引起極高死亡率。有研究報(bào)道，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(多酚類提取物)可抑制大腸桿菌O157:H7[22]；客家黃酒多酚(含有綠原酸)通過(guò)破壞細(xì)胞壁的完整性可抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)[23]。石榴和七葉樹中的多酚提取物具有抗炎作用，能提高大腸桿菌感染雞的存活率[24]；黃酮(多酚類提取物)能夠抑制大腸桿菌引起的炎癥反應(yīng)，并降低肉雞死亡率[25]。本試驗(yàn)結(jié)果與當(dāng)前研究報(bào)道一致，甜葉菊綠原酸(多酚類提取物)能夠抑制大腸桿菌引起的炎癥反應(yīng)，可有效降低大腸桿菌O78感染蛋雛雞的死亡率。

圖8 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染蛋雛雞回腸緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.8 Effect of stevia chlorogenic acid on expression of tight junction protein-related genes in ileum of layers infected with E.coli by abdominal air sac

圖9 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染蛋雛雞空腸緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.9 Effect of stevia chlorogenic acid on expression of tight junction protein-related genes in jejunum of layers infected with E.coli by abdominal air sac

表4 各組樣品的OTU數(shù)量及多樣性分析的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

橫縱坐標(biāo)百分比則表示主成分對(duì)樣本差異的貢獻(xiàn)值；圖中的每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣本，同一個(gè)組的樣本使用同一種圖形表示The percentage of the abscissa and ordinate indicates the contribution of the principal component to the sample difference; each point in the graph represents a sample, and the samples in the same group are represented by the same graph圖10 盲腸微生物相似性分析(n=4)Fig.10 Similarity analysis of cecum microbial community(n=4)

花瓣圖中每個(gè)花瓣代表一個(gè)組的樣本，中間的core數(shù)字代表的是所有樣本共有OTUs數(shù)目，花瓣上的數(shù)字代表該樣本組特有OTUs數(shù)目Each petal in the petal map represents a sample of a group， the core number in the middle represents the number of OTUs shared by all samples, and the number on the petal represents the number of unique OTUs in the sample group圖11 各組樣品的OTUs分布花瓣圖(n=4)Fig.11 Petal map of OTUs of samples in each group(n=4)

3.2 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染大腸桿菌蛋雛雞免疫功能的影響

大腸桿菌感染導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體免疫力急劇下降，抗病能力下降，而動(dòng)物機(jī)體在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中主要由免疫器官、免疫細(xì)胞及免疫分子來(lái)抵御病原微生物侵害[26]。研究報(bào)道稱，大腸桿菌侵襲上皮細(xì)胞屏障后導(dǎo)致促炎因子和趨化因子產(chǎn)生，誘導(dǎo)法氏囊、胸腺、脾及盲腸扁桃體淋巴細(xì)胞耗損，抑制機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，從而致使雞死亡[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，APEC感染會(huì)激活TLR2、TLR4信號(hào)通路，提高細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)[27]，而杜仲提取物可降低血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量，提高血清IgG含量，刺激空腸分泌IgA[11]，顯著提高肉兔血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量，可不同程度提高血清IgA含量；綠原酸可降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β等促炎因子的表達(dá)[28]。本試驗(yàn)結(jié)果與當(dāng)前報(bào)道一致，杜仲素和甜葉菊綠原酸均可通過(guò)提高大腸桿菌感染蛋雛雞血清免疫球蛋白水平，降低血清炎性因子水平，抑制腸道促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫及體液免疫，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞到受感染組織并消除病原體，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。另外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甜葉菊綠原酸對(duì)血清炎性因子的調(diào)節(jié)效果略差于杜仲素，但對(duì)腸道炎性因子表達(dá)調(diào)節(jié)效果優(yōu)于杜仲素，這可能與杜仲素除綠原酸外還含有黃酮、杜仲多糖等其他藥理成分發(fā)揮作用有關(guān)，有研究表明，杜仲黃酮可增強(qiáng)小鼠非特異性免疫功能，修復(fù)免疫器官損害，提高鉛中毒小鼠組織抗氧化酶活性；杜仲多糖可提高小鼠免疫器官指數(shù)，增加血清抗體含量和巨噬細(xì)胞吞噬能力。因此，甜葉菊綠原酸可能通過(guò)增加血清抗體含量、抑制血清和腸道炎性細(xì)胞因子表達(dá)，從而增強(qiáng)蛋雛雞機(jī)體免疫力，有效改善腹氣囊感染大腸桿菌O78對(duì)蛋雛雞的侵襲。

圖12 門水平上的物種相對(duì)豐度柱形圖(n=4)Fig.12 The relative abundance of main taxa in the cecum at phylum level (n=4)

3.3 甜葉菊綠原酸對(duì)腹氣囊感染大腸桿菌蛋雛雞腸道屏障功能的影響

腸道黏膜及結(jié)構(gòu)的完整性決定著腸道的正常吸收功能以及機(jī)體的正常免疫功能。機(jī)體健康狀態(tài)下，大分子化合物不能通過(guò)完整腸道屏障進(jìn)入血液，當(dāng)腸道緊密連接結(jié)構(gòu)受損時(shí)，腸道上皮結(jié)構(gòu)完整性被破壞，大分子化合物就會(huì)通過(guò)細(xì)胞間隙進(jìn)入血液。有研究報(bào)道，APEC黏附定植于上皮細(xì)胞，影響腸上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)，并通過(guò)分泌毒素誘導(dǎo)腸道水腫，從而導(dǎo)致腸道上皮屏障功能受損[29]。緊密連接蛋白對(duì)機(jī)體抵御病原菌入侵，發(fā)揮屏障功能十分重要。本研究顯示，甜葉菊綠原酸可通過(guò)增加空腸黏膜上皮緊密連接蛋白表達(dá)，降低蛋雛雞腸道通透性，從而修復(fù)腸道結(jié)構(gòu)損傷，調(diào)節(jié)腸道組織炎癥反應(yīng)，改善腸道屏障功能，這與目前報(bào)道一致[19,30]。

動(dòng)物腸道微生態(tài)系統(tǒng)十分復(fù)雜，棲居著大量微生物，國(guó)內(nèi)外大量研究表明，盲腸是畜禽腸道內(nèi)微生物種類和含量最多的部位，腸道環(huán)境相對(duì)封閉，僅有部分微生物可在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行分離培養(yǎng)，因此，本試驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)[31]比較并分析甜葉菊綠原酸對(duì)大腸桿菌O78感染蛋雛雞盲腸食糜微生物菌群的變化情況。李立佳[32]研究指出，雞腸道中主要優(yōu)勢(shì)菌是厚壁菌門，其次為擬桿菌門和變形菌門，本試驗(yàn)結(jié)果與其一致，蛋雛雞盲腸微生物群落主要以厚壁菌門、擬桿菌門及變形菌門為主，且這3種微生物含量占99%以上。腸道細(xì)菌群落中優(yōu)勢(shì)菌群起主導(dǎo)作用，機(jī)體早期腸道優(yōu)勢(shì)菌群的變化會(huì)影響腸道細(xì)菌與腸黏膜宿主細(xì)胞之間的相互作用。研究報(bào)道稱，早期使用益生菌和抗生素等進(jìn)行飲食干預(yù)會(huì)影響腸道菌群與宿主黏膜細(xì)胞之間的相互作用，從而引起免疫功能改變。益生菌和草藥可改善肉雞腸道健康，控制有害細(xì)菌生長(zhǎng)，其中多酚類物質(zhì)有利于維持腸道微生物菌群穩(wěn)定，抑制病原菌定植和促進(jìn)益生菌繁殖[33]。有研究報(bào)道，杜仲提取物可提高小鼠厚壁桿菌門和變形菌門相對(duì)豐度，降低擬桿菌門相對(duì)豐度；綠原酸可顯著抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌活性，顯著提高仔豬結(jié)腸乳桿菌數(shù)量并降低大腸桿菌數(shù)量，增加結(jié)腸微生物區(qū)系多樣性，保護(hù)腸道微生態(tài)平衡[34]。本研究結(jié)果與目前報(bào)道一致，腹氣囊感染大腸桿菌O78會(huì)增加蛋雛雞擬桿菌門、變形菌門和無(wú)壁菌門的相對(duì)豐度，降低蛋雛雞厚壁菌門的相對(duì)豐度，引起機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，而1 g·L-1杜仲素和2 g·L-1甜葉菊綠原酸可提高大腸桿菌O78感染蛋雛雞盲腸厚壁菌門的相對(duì)豐度，降低大腸桿菌O78感染蛋雛雞盲腸擬桿菌門和變形菌門的相對(duì)豐度，且甜葉菊綠原酸作用效果要優(yōu)于杜仲素。

大量研究證實(shí)，腸道變形菌門能反映腸道微生物菌落結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，預(yù)示腸道穩(wěn)態(tài)失調(diào)，健康動(dòng)物腸道含部分變形菌的共生細(xì)菌，當(dāng)這些細(xì)菌數(shù)量較少時(shí)，表現(xiàn)為良性，但在某種腸道環(huán)境下，它們則會(huì)發(fā)展成為引發(fā)炎癥的腸道微生物。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染雛雞的盲腸變形菌門相對(duì)豐度有所增加，預(yù)示此時(shí)腸道微生態(tài)失調(diào)。而諸多研究表明，中藥會(huì)影響腸道細(xì)菌與腸黏膜宿主細(xì)胞之間的相互作用，顯著改善腸道菌群的數(shù)量和結(jié)構(gòu)，并通過(guò)增加有益菌數(shù)量、降低有害菌數(shù)量來(lái)預(yù)防和治療疾病。甜葉菊綠原酸確實(shí)會(huì)影響腸道菌群穩(wěn)定，增加有益菌數(shù)量、降低有害菌數(shù)量，有效改善感染帶來(lái)的損傷。但甜葉菊綠原酸抵御大腸桿菌感染侵襲的具體作用機(jī)制并不清晰。有文獻(xiàn)報(bào)道稱，腸道細(xì)菌可將宿主營(yíng)養(yǎng)成分代謝成多種產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸、吲哚。腸道菌代謝產(chǎn)物又調(diào)控各種生理病理反應(yīng)，在維持機(jī)體健康中起著重要作用，如短鏈脂肪酸可維持腸道和免疫穩(wěn)態(tài)；吲哚-3-丙酸可改善腸道炎癥反應(yīng)。作為雞腸道的主要優(yōu)勢(shì)菌，厚壁菌門中的柔嫩梭菌類和球狀梭菌類是宿主腸道丁酸鹽產(chǎn)生菌的主要來(lái)源，而丁酸鹽產(chǎn)生菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的發(fā)育具有重要作用。擬桿菌門作為腸道革蘭陰性菌中數(shù)量最大的一類細(xì)菌，產(chǎn)降解植物細(xì)胞壁的酶參與植物細(xì)胞壁降解，影響腸道消化吸收功能；還與機(jī)體免疫機(jī)能密切相關(guān)，腸道擬桿菌的增加會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生自身免疫性疾病。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，甜葉菊綠原酸可提高大腸桿菌O78感染蛋雛雞盲腸厚壁菌門的相對(duì)豐度，降低盲腸擬桿菌門的相對(duì)豐度。因此推測(cè)，甜葉菊綠原酸主要通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)，抑制病原菌定植，促進(jìn)益生菌增殖，從而影響腸道菌對(duì)宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝，影響腸道黏膜及結(jié)構(gòu)的完整性、腸道微生物菌群的正常狀態(tài)，來(lái)抵御腹氣囊感染大腸桿菌O78對(duì)蛋雛雞的侵襲。

4 結(jié) 論

腹氣囊感染大腸桿菌O78后，蛋雛雞腸道緊密連接功能受損，盲腸微生物菌群發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋雛雞免疫功能紊亂、機(jī)體免疫力下降；而甜葉菊綠原酸可通過(guò)抑制腸道促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)，激活宿主細(xì)胞免疫及體液免疫，并通過(guò)增加腸道緊密連接蛋白基因表達(dá)和優(yōu)化腸道食糜微生物菌群，從而抑制腸道組織炎癥反應(yīng)，改善腸道屏障功能，增強(qiáng)蛋雛雞機(jī)體免疫力，阻止大腸桿菌O78對(duì)蛋雛雞的侵襲，其中，應(yīng)用劑量為2 g·L-1的甜葉菊綠原酸效果較好。提示，甜葉菊綠原酸增強(qiáng)大腸桿菌感染蛋雛雞機(jī)體免疫力的積極作用可能是通過(guò)調(diào)控免疫相關(guān)基因，維持盲腸微生物菌群穩(wěn)態(tài)達(dá)到的，而其抵御大腸桿菌感染的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚，仍需更進(jìn)一步研究。