蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)解析急性免疫應(yīng)激影響肉仔雞肉品質(zhì)的機(jī)理

張安榮，吳正可，陳志敏，常文環(huán)，蔡輝益,2，劉國(guó)華，鄭愛(ài)娟*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.生物飼料開(kāi)發(fā)國(guó)家工程研究中心，北京 100081)

在現(xiàn)代化畜牧業(yè)發(fā)展過(guò)程中，集約化養(yǎng)殖早已被視作高效生產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的保證，但大規(guī)模的集中飼養(yǎng)模式所暴露的問(wèn)題也日益突顯。集約化飼養(yǎng)導(dǎo)致肉雞長(zhǎng)期處于高密度、多因素應(yīng)激源的環(huán)境中，例如高溫、驚嚇、爭(zhēng)食、運(yùn)輸、季節(jié)變化、屠宰等諸多因素[1-2]，對(duì)動(dòng)物生理和心理健康都造成不同程度的影響。其中，免疫應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝消耗增加、生長(zhǎng)發(fā)育受阻以及肉品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)引發(fā)各種疾病，給家禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，LPS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激不但降低肉雞生產(chǎn)性能、改變血液指標(biāo)[3]、損害肉雞腸道結(jié)構(gòu)的完整性，還會(huì)促進(jìn)腸黏膜核因子κB、白介素IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α等促炎細(xì)胞因子積累，最終造成炎癥的發(fā)生[4-6]。同時(shí)，免疫應(yīng)激也會(huì)引起肉雞機(jī)體氧化損傷和抗氧化機(jī)能下降，進(jìn)而導(dǎo)致肉雞肉品質(zhì)顯著下降。無(wú)論是免疫亢進(jìn)還是免疫抑制，均會(huì)影響宰后雞肉的品質(zhì)[7]。目前，對(duì)肉雞抗免疫應(yīng)激的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控，主要是通過(guò)在日糧中添加硒[8]、維生素E[9]、丁酸鈉[10]、α-生育酚琥珀酸酯[11]和抗菌肽[12]來(lái)緩解損傷，但是其效果并不理想，其原因是，免疫應(yīng)激影響宰后雞肉品質(zhì)的分子機(jī)理仍不清楚。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)和生理功能的直接參與者和執(zhí)行者，生物機(jī)體的生理變化通常是由多個(gè)蛋白協(xié)同或是作為功能整體來(lái)完成[13]。蛋白質(zhì)組學(xué)是實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組所編碼的全部蛋白質(zhì)及其相互作用關(guān)系的研究，對(duì)有機(jī)體或細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行全方位研究，以整體的視角闡述生命現(xiàn)象的本質(zhì)和活動(dòng)規(guī)律。近年來(lái)，以質(zhì)譜和生物信息學(xué)為技術(shù)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)以其高分辨率、高靈敏度、高通量和規(guī)?；膬?yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)原理與分子調(diào)控機(jī)制的研究。尤其是在肉品質(zhì)研究方面，該技術(shù)主要用于研究肉品質(zhì)形成的機(jī)制、肉品質(zhì)的改善和肉質(zhì)檢測(cè)等方面。付睿琦[14]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了雞生長(zhǎng)期胸肌蛋白表達(dá)譜，結(jié)果證實(shí)，隨著周齡的增長(zhǎng)，差異蛋白數(shù)減少，但是與出雛時(shí)相比，差異蛋白數(shù)達(dá)總蛋白的2/3。劉志紅等[15]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)肉雞胸肌和腿肌進(jìn)行了蛋白質(zhì)鑒定和定量分析，發(fā)現(xiàn)胸肌與腿肌間共有98個(gè)差異表達(dá)蛋白，并且腿肌中高表達(dá)蛋白多富集于運(yùn)動(dòng)相關(guān)功能，而胸肌中高表達(dá)蛋白則富集于肌肉收縮相關(guān)功能。彭夢(mèng)玲等[16]研究了肉雞胚胎發(fā)育過(guò)程中肝組織中蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)14胚齡和出殼1日齡肉雞肝出現(xiàn)10個(gè)核心差異蛋白，分別調(diào)控脂肪酸降解和糖異生生物過(guò)程。鄒波等[17]研究了屠宰前不同驅(qū)趕方式對(duì)生豬造成應(yīng)激的影響，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與能量代謝和肌肉收縮相關(guān)的46個(gè)蛋白發(fā)生差異化表達(dá)。Jia等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在活體和新鮮屠宰后的牛胸部嫩肉中有大量蛋白質(zhì)Peroxiredoxin-6存在，并建議將此蛋白作為檢測(cè)肉質(zhì)嫩度的指標(biāo)蛋白。

因此，本試驗(yàn)采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究免疫應(yīng)激對(duì)肉仔雞胸肌肉品質(zhì)和蛋白質(zhì)組的影響，解析免疫應(yīng)激導(dǎo)致肉仔雞胸肌物質(zhì)代謝變化的分子機(jī)理，為合理制定緩解生產(chǎn)中免疫應(yīng)激措施和提高肉雞生產(chǎn)水平提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備和試劑

主要儀器設(shè)備：組織破碎儀、探頭超聲儀(中國(guó)南京電子計(jì)量?jī)x器公司)；納升級(jí)高效液相色譜系統(tǒng)(Q-Exactive，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；質(zhì)譜儀、蛋白定量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；臺(tái)式低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；低溫蒸發(fā)濃縮儀(德國(guó)Marin Christ公司)；Milli-QGradient超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；超低溫冰箱(日本SANYO公司)；pH計(jì)和電子分析天平(德國(guó)Mettler Toledo公司)。

主要試劑：尿素(Solarbio公司)；硫脲、CHAPS、Tris堿、二硫蘇糖醇(Amresco公司)；碘乙酰胺(Merk公司)；丙酮、三氟乙酸(J.T.Baker公司)；蛋白酶抑制劑(Roche Base公司)；Bradford法蛋白質(zhì)定量試劑盒(普利萊公司)；碳酸氫銨(Sigma Aldrich公司)；Trypsin酶(Promega)；甲酸(MREDA Technology公司)；乙腈(Fisher公司)；脂多糖(大腸桿菌血清型O55:B5，Sigma公司)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

健康1日齡AA肉公雞購(gòu)自北京正大有限公司，飼喂玉米-豆粕型飼糧(表1)，隨機(jī)分為兩組，即對(duì)照組和免疫應(yīng)激組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。對(duì)照組和免疫應(yīng)激組分別于36、38、40日齡，腹腔分別注射1 mL生理鹽水(對(duì)照組)或5.0 mg·kg-1體重的LPS溶液(免疫應(yīng)激組)。在42日齡，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取2只雞，采集胸肌組織樣本，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 蒸煮損失的測(cè)定 將樣品沿著與肌肉自然走向(肌肉的軸)垂直的方向切成2.5 cm厚的肉塊，并去除樣品表面的結(jié)締組織、脂肪和肌膜，使其表面平整。記錄肉樣的初始重量。將肉塊放入塑料蒸煮袋中，將溫度計(jì)探頭由上而下插入肉塊中心，記錄肉塊的初始溫度，將蒸煮袋口密封起來(lái)。將包裝的肉塊放入72 ℃水浴中，水浴液面需完全浸沒(méi)肉塊，袋口不得浸入水中。當(dāng)肉塊中心溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，立即取出肉樣，冷卻稱(chēng)重。肉塊蒸煮前后的質(zhì)量損失即為蒸煮損失。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3.2 pH測(cè)定 測(cè)定肌肉pH的樣品取自肉雞右胸肌。將校準(zhǔn)后的便攜式pH計(jì)金屬頭直接插入肉樣中，待pH計(jì)讀數(shù)穩(wěn)定后，讀取數(shù)值。每個(gè)樣品測(cè)3次，取平均值。在屠宰后45 min記錄初始pH(pHi)，于冷卻24 h后再次記錄pH(pH24 h)，于48 h 后記錄最終pH(pH48 h)[19]。

1.3.3 滴水損失的測(cè)定 測(cè)定肌肉滴水損失的樣品取自肉雞左胸肌。記錄肉樣的初始重量，然后將樣品放入密封的真空聚乙烯袋中，并在4 ℃下儲(chǔ)存。24 h后，將樣品從袋子中取出，用吸水紙吸干，并重新稱(chēng)重[20]。肉塊處理前后的質(zhì)量損失即為滴水損失。

1.3.4 IMP含量的測(cè)定 參照Li等[21]的方法，通過(guò)高效液相色譜(HLPC)測(cè)定肉雞胸肌IMP含量。

1.3.5 胸肌肌纖維橫截面周長(zhǎng)與面積的測(cè)定 在ImageJ分析軟件下，打開(kāi)已采集的不同處理胸肌肌纖維橫截面染色圖像。在image菜單中選擇Type為8bit，在plugins中選擇demos為inverter，在image下adjust中選擇threshed調(diào)節(jié)需要測(cè)量的區(qū)域，在analyze下的tools選項(xiàng)中選擇ROI manager，然后用選圖工具勾勒出測(cè)定區(qū)域并加入至ROI manager待測(cè)框中。將視野中的肌纖維橫截面選中后點(diǎn)擊measure選項(xiàng)獲得測(cè)定數(shù)據(jù)，測(cè)得胸肌肌纖維橫截面積與周長(zhǎng)。

1.4 胸肌組織蛋白質(zhì)的提取與酶解

1.4.1 胸肌組織蛋白質(zhì)提取 蛋白質(zhì)提取按照Z(yǔ)heng等[22]的方法，每30 mg胸肌樣品加入300 μL樣品裂解液(8 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，20 mmol·L-1Tris-堿，30 mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT))及蛋白酶抑制劑，冰浴充分研磨，超聲，使樣品完全溶解。4 ℃，15 000×g，離心20 min。 避開(kāi)脂肪層取上清液，加入3倍體積預(yù)冷的丙酮溶液，冰浴沉淀30 min。4 ℃，15 000×g，離心20 min。棄上清。開(kāi)口2～3 min讓丙酮揮發(fā)，然后將沉淀重新溶解于100 μL的5 mol·L-1尿素中，再加入400 μL 40 mmol·L-1NH4HCO3。采用Bradford方法測(cè)定所提取蛋白質(zhì)的濃度。

1.4.2 胸肌組織蛋白質(zhì)液內(nèi)酶解 每個(gè)樣品加入50 μL 100 mmol·L- 1DTT，4 ℃放置1 h，加入250 μL 100 mmol·L-1碘乙酰胺(IAA)，避光放置1 h。按照酶∶蛋白=1∶50(W/W)比例加入Trypsin胰蛋白酶，37 ℃下進(jìn)行消化反應(yīng)24 h，后加入1 μL甲酸終止酶切。4 ℃，14 000×g，離心15 min，取500 μL上清液轉(zhuǎn)移至新管，待測(cè)。

1.5 胸肌樣品質(zhì)譜分析

用100 μL 0.1%甲酸溶解干燥樣品，4 ℃，14 000×g離心15 min，取50 μL上清于上樣管中，同時(shí)避免有氣泡；將上樣管放入色譜儀樣品槽，每針上樣體積8 μL，每個(gè)樣品做3針重復(fù)。采用納升級(jí)液相色譜系統(tǒng)EASY-nLC 1000，通過(guò)納升電噴霧源與質(zhì)譜Q-Exactive串聯(lián)，通過(guò)納升ESI源將洗脫的肽段注入質(zhì)譜儀，上樣流速250 nL·min-1。流動(dòng)相A(0.1%甲酸和2%乙腈)，流動(dòng)相 B(0.1%甲酸 & 80% ACN)；梯度：3%～8% B 10 min，8%～12% B 100 min，12%～20% B 70 min，20%～30% B 30 min，30%～90% B 20 min和90% B 10 min。

參數(shù)設(shè)置如下：噴霧電壓：2.3 kV；毛細(xì)管溫度：250 ℃；S-lens：55%；碰撞能量：27% HCD；分辨率設(shè)置：一級(jí)70 000@m/z 200；二級(jí)17 500@m/z 200；母離子掃描范圍：m/z 300～2 000；子離子掃描范圍：從m/z 100開(kāi)始。通過(guò)Xcalibur軟件(版本2.2，Thermo Fisher Scientific)收集MS/MS數(shù)據(jù)并保存為Raw文件。

1.6 胸肌組織全蛋白質(zhì)組定性及定量分析

原始文件使用PEAKS軟件進(jìn)行Label-free定性和定量分析，搜索雞種屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Gallusgallusdatabase)。檢索結(jié)果通過(guò)嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選(peptide FDR & protein FDR≤1%)。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索時(shí)的參數(shù)設(shè)置：前體離子質(zhì)量偏差：15 ppm；碎片離子質(zhì)量偏差：20 mmu；固定修飾：半胱氨酸(Cysteine)烷基化(+57.021 u)；動(dòng)態(tài)修飾：甲硫氨酸(Methionine)氧化(+15.995 u)；天冬酰胺和谷氨酰胺(Asparagine & Glutamine)脫氨基化(+0.984 u)；酶：trypsin；漏切位點(diǎn)：2。

運(yùn)用PEAKS Q板塊對(duì)搜庫(kù)結(jié)果進(jìn)行定量，參數(shù)如下：保留時(shí)間(retentiontime shift tolerance)：0.5 min；質(zhì)量誤差范圍(mass error tolerance)：30 ppm； 特有肽段(unique peptide)≥1；電荷范圍(charge between)：2～8；不同處理間蛋白質(zhì)的表達(dá)量差異倍數(shù)(fold change)≥1.5，P≤0.05判定為差異顯著。

1.7 蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)分析

利用Cytoscape3.8.0軟件中的Cluego插件，分別用基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Ontology database，GO)和京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行功能富集分析和代謝通路富集分析。使用檢索相互作用基因/蛋白質(zhì)(STRING)軟件分析差異蛋白相互間的作用以篩選出核心差異因子。

1.8 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

肉雞胸肌肉品質(zhì)部分?jǐn)?shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示。采用SPSS 21.0軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。以P<0.05為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為差異極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 免疫應(yīng)激對(duì)肉仔雞胸肌肉品質(zhì)的影響

免疫應(yīng)激對(duì)肉雞胸肌滴水損失、蒸煮損失和肌苷酸(IMP)含量的影響如表2所示。與對(duì)照組相比，免疫應(yīng)激顯著增加了宰后肉雞胸肌的滴水損失及蒸煮損失(P<0.05)，并且免疫應(yīng)激組肉雞胸肌IMP含量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。表3顯示，屠宰后24和48 h的肉雞胸肌pH，與對(duì)照組相比，免疫應(yīng)激對(duì)屠宰后24和48 h的肉雞胸肌pH無(wú)顯著影響(P>0.05)。如表4顯示，與對(duì)照組相比，免疫應(yīng)激組肉雞胸肌纖維的橫截面周長(zhǎng)和面積均極顯著增加(P<0.01)。

表2 免疫應(yīng)激對(duì)肉雞胸肌蒸煮損失、滴水損失及肌苷酸含量的影響

表3 免疫應(yīng)激對(duì)宰后靜置不同時(shí)間肉雞胸肌pH的影響

表4 免疫應(yīng)激對(duì)肉雞胸肌肌纖維橫截面的周長(zhǎng)與面積的影響

2.2 肉雞胸肌蛋白質(zhì)組定性分析

2.2.1 肉雞胸肌蛋白質(zhì)鑒定 本試驗(yàn)在肉雞胸肌組織中共鑒定到1 163個(gè)蛋白質(zhì)，對(duì)照組表達(dá)702個(gè)蛋白質(zhì)(共468個(gè)組)，免疫應(yīng)激組表達(dá)975個(gè)蛋白質(zhì)(620組)，對(duì)照組和免疫應(yīng)激組共表達(dá)514個(gè)蛋白質(zhì)，如圖1所示。

圖1 對(duì)照組和免疫應(yīng)激組肉雞胸肌表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)目維恩圖Fig.1 Venn diagram of the number of proteins expressed in the PM muscle of broilers in control group and immunological stress group

2.2.2 對(duì)照組特異表達(dá)蛋白質(zhì)GO和KEGG分析 如圖2所示，對(duì)對(duì)照組中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了KEGG途徑分析，結(jié)果顯示，特異表達(dá)蛋白質(zhì)未富集到任何通路。

GO分析顯示，對(duì)照組特異表達(dá)蛋白質(zhì)主要富集到了能量產(chǎn)生和代謝相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程：細(xì)胞呼吸(cellular respiration)、有氧呼吸(aerobic respiration)、己糖代謝與生物合成過(guò)程(hexose metabolic and biosynthetic process)、單糖生物合成過(guò)程(monosaccharide biosynthetic process)、葡萄糖代謝過(guò)程(glucose metabolic process)、糖異生(gluconeogenesis)。

圖2 對(duì)照組肉雞胸肌特異表達(dá)蛋白質(zhì)GO功能注釋Fig.2 GO annotation of unique proteins specially expressed in the PM of broilers in the control group

2.2.3 免疫應(yīng)激組特異表達(dá)蛋白質(zhì)GO和KEGG分析 如圖3所示，KEGG分析結(jié)果顯示，免疫應(yīng)激組特異表達(dá)蛋白質(zhì)富集到了緊密連接(tight junction)通路。免疫應(yīng)激組差異表達(dá)蛋白GO富集分析結(jié)果顯示，所富集的GO條目主要涉及以下生物學(xué)過(guò)程：大分子復(fù)合物分解(macromolecular complex disassembly)、蛋白質(zhì)分解與解聚(cellular & protein complex disassembly, protein depolymerization)、核酸合成和代謝(purine nucleoside & ribonucleoside triphosphate metabolic process, ATP metabolic process, nucleoside metabolic process, purine nucleoside & ribonucleoside monophosphate biosynthetic and metabolic process等)、糖基化合物合成與代謝(glycosyl compound biosynthetic and metabolic process)、含堿基小分子物質(zhì)代謝(nucleobase-containing small molecule metabolic process)。

2.3 肉雞胸肌蛋白質(zhì)組定量分析

2.3.1 免疫應(yīng)激組肉雞胸肌差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)目 定量分析結(jié)果表明，免疫應(yīng)激組和對(duì)照組有21個(gè) 蛋白質(zhì)發(fā)生差異化表達(dá)，其中15個(gè)蛋白質(zhì)在免疫應(yīng)激組上調(diào)表達(dá)，6個(gè)蛋白質(zhì)在免疫應(yīng)激組下調(diào)表達(dá)，如表5所示。

免疫應(yīng)激組上調(diào)表達(dá)的蛋白有3類(lèi)。第一類(lèi)是參與碳水化合物代謝和能量產(chǎn)生相關(guān)的蛋白，包括:AMP脫氨酶1 X1亞型(AMPD1)、甘油-3-磷酸脫氫酶1樣蛋白(GPD1L2)、L-乳酸脫氫酶A鏈X1型(LDHA)、線粒體X2型細(xì)胞色素b-c1復(fù)合體亞基2(UQCRC2)；第二類(lèi)是肌肉收縮相關(guān)的蛋白，包括：肌球蛋白重鏈1C(MYH1C)、肌球蛋白重鏈1A(MYH1A)、鈣調(diào)素-2(CASQ2)、三聚體細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子通道A(TMEM38A)；第三類(lèi)是參與免疫反應(yīng)保護(hù)細(xì)胞免受損傷相關(guān)蛋白，包括：高遷移率蛋白B1X1亞型(HMGB1)、蛋白磷酸酶1調(diào)控亞基1A(PPP1R1A)、E3 sumo蛋白連接酶ranbp2(LOC101747971)、過(guò)氧化物酶1(PRDX1)和ATP結(jié)合盒亞家族F成員2 X1亞型(ABCF2)。

免疫應(yīng)激組下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)有：血紅蛋白β亞基(HBBA)、線粒體檸檬酸合成酶X3型(CS)、ATP合酶亞基α(ATP5A1WL)、熱激蛋白90(HSP90B1)、ATP結(jié)合盒B家族成員6(ABCB6)和X1型突觸小泡磷酸酶2(SYNJ2)。

2.3.2 免疫應(yīng)激組肉雞胸肌差異表達(dá)蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作分析 利用string在線分析軟件對(duì)免疫應(yīng)激組差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作功能分析，結(jié)果如圖4所示，有15個(gè)差異蛋白富集到網(wǎng)絡(luò)中。在網(wǎng)絡(luò)互作圖中，通過(guò)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，具有顯著互作關(guān)系的功能模塊主要為能量代謝(energy metabolism)和肌肉收縮(muscle contraction)子網(wǎng)絡(luò)。每個(gè)子網(wǎng)絡(luò)有多個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)互作，每個(gè)節(jié)點(diǎn)均代表關(guān)鍵差異蛋白，具體信息見(jiàn)表5。其中，涉及能量代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)主要有CS、LDHA、ATP5A1WL、UQCRC2。涉及肌肉收縮的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)主要有MYH1A、MYH1C、CASQ2、TMEM38A。

大寫(xiě)字母開(kāi)頭為KEGG注釋?zhuān)?xiě)字母開(kāi)頭為GO注釋Terms that begin with uppercase or lowercase letters are KEGG or GO annotation, respectively圖3 免疫應(yīng)激組肉雞胸肌特異表達(dá)蛋白質(zhì)GO和KEGG功能注釋Fig.3 GO and KEGG annotation of unique proteins specially expressed in the PM of broilers in the immunological stress group

3 討 論

國(guó)內(nèi)外報(bào)道均表明，蛋白質(zhì)組成的改變會(huì)引起肌肉品質(zhì)的變化[23-25]。本試驗(yàn)定性蛋白質(zhì)組結(jié)果顯示，免疫應(yīng)激組和對(duì)照組特異表達(dá)蛋白質(zhì)分別富集到了不同功能模塊，這表明免疫應(yīng)激導(dǎo)致肌肉中的蛋白質(zhì)表達(dá)種類(lèi)發(fā)生了變化。同時(shí)，定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，有21個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生了變化。因此，免疫應(yīng)激導(dǎo)致肉品質(zhì)下降的分子基礎(chǔ)是組成肌肉中與肉品質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)的質(zhì)與量的改變。

研究表明，肌肉纖維的直徑、類(lèi)型等因素對(duì)肌肉的嫩度有重要的影響，I型肌纖維直徑較細(xì)，密度較大，嫩度較高，而IIb型肌纖維則相反[26]。肌肉的總重量從出生到屠宰大約增長(zhǎng)50～100倍，這個(gè)差異主要由肌纖維的“肥大”造成的。研究發(fā)現(xiàn)，在肌肉肥大的過(guò)程中，收縮蛋白的合成速率大大高于其分解速率，從而導(dǎo)致肌纖維中粗、細(xì)肌絲數(shù)目增加。另外，提供能量的合成酶也顯著增加。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫應(yīng)激組肉雞胸肌肌纖維橫截面直徑和面積均顯著增加，顯著降低了肉的嫩度。其分子機(jī)制可能是肌肉收縮相關(guān)蛋白的高表達(dá)(包括MYH1C、MYH1A、CASQ2、TMEM38A)，同時(shí)與之相對(duì)應(yīng)的為其提供能量的蛋白質(zhì)的高表達(dá)共同作用的結(jié)果，這其中與能量產(chǎn)生相關(guān)的蛋白質(zhì)有AMPD1、GPD1L2、LDHA、UQCRC2。

pH是決定肉品質(zhì)好壞的重要因素[27]，宰后糖酵解代謝速率直接影響肌肉pH的下降程度。研究表明，LPS誘導(dǎo)的肉雞免疫應(yīng)激顯著降低了宰后24 h 胸肌的pH(P<0.05)[28]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫應(yīng)激組肌肉pH沒(méi)有顯著變化，但從數(shù)值上看，免疫應(yīng)激組pH下降程度大。宰后肌肉肌糖原和ATP被快速消耗，導(dǎo)致細(xì)胞由有氧呼吸向無(wú)氧呼吸轉(zhuǎn)變，肌肉內(nèi)乳酸累積導(dǎo)致pH下降[29]。Zheng等[30]研究證實(shí)，葡萄糖磷酸變位酶1、線粒體肌酸激酶、果糖-1,6-二磷酸酶、L-乳酸脫氫酶A鏈、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸變位酶1，磷酸甘油酸激酶的上調(diào)表達(dá)與宰后肌肉pH下降相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，免疫應(yīng)激導(dǎo)致L-乳酸脫氫酶A鏈表達(dá)量升高，可能會(huì)改變肌糖原的消耗速率，從而導(dǎo)致肌肉pH下降。

表5 免疫應(yīng)激組AA肉雞胸肌差異表達(dá)蛋白質(zhì)信息

每個(gè)球體代表節(jié)點(diǎn)蛋白，相同顏色的球體代表不同節(jié)點(diǎn)蛋白聚在同一個(gè)子網(wǎng)絡(luò)。圖中實(shí)線表示兩個(gè)蛋白間的互作得分大于0.5(虛線表示小于0.5)。不同顏色的實(shí)線代表蛋白間不同互作關(guān)系的證據(jù)：紅線表示融合證據(jù)，綠線表示鄰域證據(jù)，藍(lán)線表示共現(xiàn)證據(jù)，紫線表示試驗(yàn)證據(jù)，黃線表示數(shù)據(jù)挖掘證據(jù)，淺藍(lán)線表示數(shù)據(jù)庫(kù)證據(jù)，黑線表示共表達(dá)證據(jù)Each ball represents node protein, the same color balls represent node proteins are clustered in the same sub network. The solid line indicates that the interaction score between the two proteins is more than 0.5 (the dotted line indicates that the score is less than 0.5). Different color solid lines between proteins represent evidence of association: Red lines indicate fusion evidence, green lines indicate neighborhood evidence, blue lines indicate co-occurrence evidence, purple lines indicate experimental evidence, yellow lines indicate text mining evidence, light blue lines indicate database evidence, and black lines indicate co-expression evidence圖4 免疫應(yīng)激組肉雞胸肌差異表達(dá)蛋白質(zhì)及其相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.4 The interaction network of differentially expressed proteins in the PM of broiler chickens in the immunological stress group

持水力是肉品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，通過(guò)滴水損失和蒸煮損失來(lái)反映。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫應(yīng)激組肌肉滴水損失和蒸煮損失均顯著增加。這可能與免疫應(yīng)激導(dǎo)致的CS、ATP5A1WL、HSP90B1下調(diào)表達(dá)有關(guān)。線粒體檸檬酸合成酶X3型，催化來(lái)自糖酵解或其它異化反應(yīng)的乙酰CoA與草酰乙酸縮合合成檸檬酸反應(yīng)的酶。趨于生成檸檬酸的方向，控制三羧酸循環(huán)的入口，成為三羧酸循環(huán)的限速步驟。ATP合酶是線粒體氧化磷酸化的關(guān)鍵酶。這兩個(gè)酶的下調(diào)表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙。另外，熱休克蛋白表達(dá)增高，使動(dòng)物組織和細(xì)胞可以更有效的抵抗各種應(yīng)激反應(yīng)。在蛋白質(zhì)變性之初，熱休克蛋白與肌原纖維蛋白結(jié)合，能夠起到保護(hù)的作用，阻止各種酶類(lèi)分解肌原纖維。熱休克蛋白能夠有效延緩細(xì)胞膜的破裂，從而阻止內(nèi)源性蛋白酶的釋放，使得肌肉的水分損失減少[24]。本試驗(yàn)中，免疫應(yīng)激導(dǎo)致熱激蛋白90的下調(diào)表達(dá)，使蛋白質(zhì)無(wú)法維持其細(xì)胞的完整性和某些蛋白(如肌間線蛋白，肌漿和肌原纖維)的修復(fù)功能，從而引起細(xì)胞的持水力下降。Kristensen和Purslow[31]認(rèn)為，宰后骨架蛋白如肌動(dòng)蛋白等不降解，在肌肉發(fā)生僵直時(shí)會(huì)導(dǎo)致肌原纖維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)收縮形成汁液流失通道而增加汁液流失。在本試驗(yàn)中，免疫應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白肌球蛋白重鏈(MYH1C和MYH1A)高表達(dá)，可能與其降低持水力有關(guān)。因此，免疫應(yīng)激可能引起了細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，導(dǎo)致肌肉細(xì)胞的持水力下降，增加了滴水損失和蒸煮損失。

氨基酸含量和組成與肉的鮮味高度相關(guān)。其中,與鮮味有關(guān)的最主要氨基酸是谷氨酸，肌苷酸與谷氨酸鈉協(xié)同影響肉的鮮味[32]。國(guó)內(nèi)外研究表明，雞肉質(zhì)鮮味特性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)是由肌苷酸(IMP)決定的[33-35]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫應(yīng)激組肉雞肌肉中IMP含量極顯著降低，這可能是由于免疫應(yīng)激導(dǎo)致免疫相關(guān)蛋白高表達(dá)，而與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)的蛋白低表達(dá)所致。如HMGB1、PPP1R1A 和PRDX1等參與免疫反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷相關(guān)蛋白發(fā)生了高表達(dá)。高遷移率蛋白B1X1亞型(HMGB1)是多功能蛋白，促進(jìn)宿主對(duì)感染性信號(hào)的炎癥反應(yīng)，并參與先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的協(xié)調(diào)和整合。在組織損傷時(shí)，能夠放大免疫反應(yīng)信號(hào)，促進(jìn)LPS綁定因子的釋放，并激活細(xì)胞表面受體參與免疫反應(yīng)。蛋白磷酸酶1調(diào)控亞基1A(PPP1R1A)具有抗原蛋白的綁定分子功能，促進(jìn)微管相關(guān)蛋白TAU/MAPT的去磷酸化；過(guò)氧化物酶1(PRDX1)通過(guò)解毒過(guò)氧化物和作為過(guò)氧化氫介導(dǎo)的信號(hào)傳感器，在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。ATP結(jié)合盒亞家族F成員2 X1亞型在巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝和神經(jīng)發(fā)育中起作用。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)對(duì)比研究了對(duì)照組和免疫應(yīng)激組肉雞胸肌肉品質(zhì)和蛋白質(zhì)組的差異，發(fā)現(xiàn)免疫應(yīng)激組肉雞胸肌肉品質(zhì)下降的分子機(jī)理：1)免疫應(yīng)激可能通過(guò)提高肌肉收縮相關(guān)蛋白和與之相對(duì)應(yīng)的為其提供能量的蛋白質(zhì)的高表達(dá)，顯著增加肉雞胸肌肌纖維橫截面直徑和面積，顯著降低肉的嫩度；2)免疫應(yīng)激導(dǎo)致L-乳酸脫氫酶表達(dá)量升高，可能會(huì)改變肌糖元的消耗速率，從而導(dǎo)致肌肉pH下降。3)免疫應(yīng)激通過(guò)下調(diào)表達(dá)CS、ATP5A1WL、HSP90B1，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，導(dǎo)致肌肉細(xì)胞的持水力下降，增加滴水損失和蒸煮損失。4)免疫應(yīng)激可能通過(guò)提高免疫反應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低與風(fēng)味相關(guān)物質(zhì)的合成，降低肉質(zhì)風(fēng)味。