SPF大白豬和長白豬CIITA基因剪接突變體的鑒定分析及在不同組織中的表達(dá)模式

馬麗娜，劉英華，王有祺，高彩霞*，陳洪巖1,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150000； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 國家禽類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源庫，哈爾濱 150069)

豬主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)也叫豬白細(xì)胞抗原(swine lymphocyte antigen, SLA)，它包含3 個(gè)主要的基因簇(I類、II類和III類)，其中II類基因簇包含較多基因，但只有SLA-DQ和SLA-DR基因具有功能作用且具有高度的多態(tài)性[1-3]。SLA II類抗原主要表達(dá)在專職性抗原提呈細(xì)胞表面，主要負(fù)責(zé)提呈外源性抗原給CD4+輔助性T細(xì)胞從而引起機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[4-5]。SLA II類分子功能的實(shí)現(xiàn)需要其編碼基因按照嚴(yán)格的細(xì)胞特異性和定量調(diào)控模式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這個(gè)復(fù)雜的基因表達(dá)譜幾乎完全由一個(gè)主調(diào)控因子控制，稱為SLA II類分子的反式激活因子CIITA(major histocompatibility class II transactivator)[6-8]。它通過蛋白的羧基端結(jié)合到SLA II類分子啟動(dòng)子上的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子上相互作用，成為這些轉(zhuǎn)錄因子的支架，共同發(fā)揮對(duì)SLA II類分子表達(dá)的調(diào)控作用[9-11]。CIITA于1993年首次被發(fā)現(xiàn)，一名患者主要因?yàn)镃IITA基因的功能缺陷等原因?qū)е虏荒苷＞幋aMHC II類分子，致使該患者無法正常進(jìn)行免疫調(diào)控[12-13]。CIITA屬于NOD樣受體(NOD-like receptors, NLRs)蛋白家族的一員，其蛋白表達(dá)具有組織特異性，僅在胸腺上皮細(xì)胞、活化的細(xì)胞和專職的抗原提呈細(xì)胞中表達(dá)，也可進(jìn)行誘導(dǎo)性表達(dá)，在其他一些細(xì)胞中，可用IFN-γ來刺激CIITA的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，人CIITA的組成可分為N端富含酸性氨基酸區(qū)、脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸(P/S/T)的富集區(qū)、GTP結(jié)合域(GTP-binding domain, GBD)和末端富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域(leucine rich repeat, LRR)[14]，每一個(gè)區(qū)域都有特定的功能，前兩者主要起到轉(zhuǎn)錄激活功能[15]。豬CIITA組成與人類似，但失去了整個(gè)GTP綁定區(qū)。此外，豬CIITA在其自然轉(zhuǎn)錄過程中可發(fā)生可變剪接，這是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制，即通過不同的剪接方式使得一個(gè)mRNA前體產(chǎn)生不同mRNA突變體，造成CIITA基因核苷酸插入/缺失，從而使編碼的氨基酸序列提前終止或突變，由于這種CIITA基因剪接突變體的存在，使其蛋白功能受到影響，不能正確啟動(dòng)SLA II類分子的表達(dá)，致使宿主不能發(fā)揮正常的抗原提呈功能，從而可能會(huì)進(jìn)一步影響實(shí)驗(yàn)豬對(duì)疾病表現(xiàn)出的抗性或易感性。實(shí)驗(yàn)豬是畜禽疫病防控研究中重要的模式動(dòng)物，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存有遺傳背景清晰且已排除了14種病原微生物的SPF(specific pathogen free, SPF)大白豬和長白豬群體[16-18]，且在重大疫病防控研究中起到了至關(guān)重要的作用。目前，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所在我國非洲豬瘟疫苗研究中取得了關(guān)鍵性的進(jìn)展，其中標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)豬也是推進(jìn)研究工作的重要原因之一。

目前，國內(nèi)外關(guān)于CIITA基因的研究主要集中在人和斑馬魚上，對(duì)豬CIITA基因的研究較少，根據(jù)Ensemble數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)的搜索發(fā)現(xiàn)，豬CIITA基因可能存在多種剪接突變體，因此，本研究對(duì)SPF大白豬和長白豬CIITA基因進(jìn)行可變剪接分析，研究CIITA剪接突變體在不同豬組織中的表達(dá)情況，為深入探討豬CIITA基因的生物學(xué)功能及培育標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)豬提供遺傳學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

隨機(jī)采集中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存5周齡的8頭SPF大白豬和7頭SPF長白豬的肺組織(許可證號(hào)：SCXK(黑)2015-004)，樣本迅速放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要試劑 KOD-Plus-Neo購于東洋紡(上海)生物科技有限公司；pEASY-Blunt載體購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、膠回收試劑盒購于大連TaKaRa公司；RNA提取試劑盒購于博日科技有限公司。

1.2.2 主要儀器 DYY-6C型穩(wěn)壓電泳儀(六一儀器廠,北京)；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha Innotech,美國)；梯度PCR儀(Bio-Rad,美國)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(QuantStudioTM5)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肺組織總RNA的提取和cDNA的合成 取0.1 g肺組織加入少量液氮進(jìn)行研磨，研磨充分后，用博日RNA提取試劑盒提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測量其濃度及純度，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0范圍內(nèi)的總RNA用于后續(xù)研究。隨后，使用特異性引物CIITA-R，用PrimeScriptTMⅡ1 st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，寶生物(大連)有限公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2CIITA的擴(kuò)增和測序 以已知豬CIITA序列(GenBank登錄號(hào)：AY084053)為參考序列，用NCBI Primer-BLAST和Primer primer5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物CIITA-F/R(表1)，對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段包含CDS區(qū)，預(yù)期擴(kuò)增大小約1 698 bp。 引物由庫美生物科技公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL：KOD-Plus-Neo(1.0 U·μL-1) 1 μL， 10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs (2 mmol·L-1) 5 μL，MgSO4(25 mmol·L-1) 3 μL，上、下游引物各1 μL， cDNA 2 μL，滅菌蒸餾水32 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。 PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，用紫外分光光度計(jì)測定回收DNA的濃度，將其送庫美生物科技公司進(jìn)行測序。測序獲得雜合子后，將回收片段與pEASY-Blunt Cloning kit載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α培養(yǎng)，菌液PCR鑒定后，篩選陽性克隆送庫美生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.3.3CIITA基因序列的生物信息學(xué)分析 利用Chromas 2對(duì)測序獲得的原始序列進(jìn)行核對(duì)編輯，編輯后序列通過MEGA 7.0建立數(shù)據(jù)庫；MegAlign進(jìn)行核苷酸與氨基酸比對(duì)；采用MEGA 7.0對(duì)比人、鼠、牛、斑馬魚、斑點(diǎn)叉尾鮰、恒河猴、綿羊、雞CIITA基因編碼的氨基酸序列(表2)，分析序列同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；同時(shí)用Ensemble(http://asia.ensembl.org/index.html)比較8個(gè) 豬品種預(yù)測的CIITA不同剪切體的核苷酸序列相似性，構(gòu)建其氨基酸序列進(jìn)化樹，各個(gè)品種不同轉(zhuǎn)錄本的ID及GenBank登錄號(hào)見表3；運(yùn)用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；運(yùn)用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.3.4CIITA基因在SPF長白豬不同組織中的表達(dá)特性 根據(jù)獲得的CIITA序列，選取2頭攜帶CIITA-A/CIITA-C和CIITA-B/CIITA-C的SPF長白豬，頸動(dòng)脈放血致死后，迅速取心、肝、脾、肺、腎、甲狀腺、胸腺和脊髓樣本，用于總RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，利用qRT-PCR方法檢測各組織中CIITA剪接突變體的表達(dá)情況，引物信息見表1。反應(yīng)總體積為20 μL：上、下游引物(10 μmol·L-1) 各0.25 μL，cDNA 1 μL,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ROX 0.4 μL， RNAase Free ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95 ℃ 30 s制作熔解曲線。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

表1 引物信息

表2 不同物種CIITA序列信息

表3 不同品種豬CIITA不同轉(zhuǎn)錄本的ID及GenBank登錄號(hào)

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用2-ΔΔCT法分析qRT-PCR檢測結(jié)果，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用SPSS version 19.0軟件單因素方差分析比較CIITA基因在不同個(gè)體和不同組織中的表達(dá)差異，用Duncan’s法進(jìn)行多重比較；采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行分析；P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 豬CIITA基因可變剪接體的鑒定及特征分析

提取SPF大白豬和長白豬肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增后分別獲得1 700 bp左右的條帶(圖1A)，表明成功獲得CIITA基因。分析15頭SPF大白豬和長白豬CIITA基因測序結(jié)果(圖1B)，部分豬出現(xiàn)雜合子，克隆測序后，共獲得了豬CIITA基因CDS區(qū)的3種可變剪接體，分別命名為CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C，獲得GenBank登錄號(hào)為MN_814329、MN_814330和MN_814331，SPF豬CIITA的基因型見表4。比較3個(gè)剪接突變體的核苷酸(圖2A)和氨基酸序列(圖2B)，結(jié)果CIITA-C與參考序列相似性最高，核苷酸同源性為99.6%，氨基酸同源性為99.5%。相對(duì)于CIITA-C，CIITA-A和CIITA-B在Exon 11同一位置分別缺失了40 和199 bp，致使終止密碼子提前，從而導(dǎo)致編碼的氨基酸分別缺失253和238個(gè)氨基酸殘基。

2.2 CIITA基因序列的物種間保守性

將獲得的豬CIITA-C CDS序列與人、小白鼠、牛、斑馬魚、斑點(diǎn)叉尾鮰、恒河猴、綿羊和雞的CIITA核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)SPF大白豬和長白豬與綿羊具有較高的同源性，達(dá)到81.1%以上。與斑點(diǎn)叉尾鮰的同源性較小，僅為24.9%。利用MEGA7.0軟件使用Neighbor-Joining法對(duì)CIITA基因的編碼氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)于CIITA，豬與綿羊和牛具有較近的親緣關(guān)系(圖3)。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2. CIITA基因擴(kuò)增結(jié)果；A圖中，框內(nèi)為豬CIITA基因擴(kuò)增結(jié)果M. DNA marker; 1, 2. CIITA gene amplification results; the bands in box represents the amplification products of CIITA gene in figure A圖1 豬CIITA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果(A)和測序結(jié)果(B)Fig.1 PCR amplification results (A) and sequencing results (B) of porcine CIITA gene

表4 SPF大白豬和長白豬CIITA基因剪接突變體存在形式

2.3 不同豬品種CIITA不同剪接突變體的遺傳進(jìn)化樹分析

用MEGA7.0軟件對(duì)8個(gè)不同品種豬的CIITA不同轉(zhuǎn)錄本的CDS區(qū)進(jìn)行序列比對(duì)與遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)不同豬品種CIITA轉(zhuǎn)錄本具有一定的保守性，其同源性為65%～100%。SPF大白豬和長白豬中獲得的CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C與landrace-206、jinhua-206、pietrain-207、mei-shan-206、rongchang-206、bamei-206、pietrain-206和usmarc-201聚為一支，表明SPF大白豬和長白豬與usmarc、皮特蘭、巴美豬、榮昌豬、梅山豬和金華豬親緣關(guān)系較近(圖4)。

2.4 CIITA基因蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

運(yùn)用SOPMA在線預(yù)測豬CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，發(fā)現(xiàn)3個(gè)剪接突變體中α螺旋(alpha helix)、β折疊(beta turn)、無規(guī)則卷曲(random coil)和延長片段(extended strand)4種 二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例比較接近(表5)。但是利用DNA star軟件子程序Protean對(duì)CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)由于CIITA-A和CIITA-B中終止密碼子的提前致使編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域受到了剪接的影響，均缺失了末端富含亮氨酸的4個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRRs)(圖5)。利用SWISS-MODEL在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)，由于Exon 11部分核苷酸的缺失以及終止密碼子的提前，使得蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)了明顯的改變(圖6)。

2.5 CIITA基因剪接突變體在豬不同組織中的表達(dá)分析

利用qRT-PCR方法檢測豬各組織中CIITA剪接突變體的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C在各個(gè)主要組織中均有表達(dá)。在CIITA-A/CIITA-C豬的不同組織樣本中(圖7A)，CIITA-A與CIITA-C表達(dá)量趨勢一致，均在脾中表達(dá)量最高，其次是脊髓、腎、肺、甲狀腺、肝、胸腺，在心中表達(dá)最低。除了肺外，CIITA-C的表達(dá)量均高于CIITA-A，在肝中差異極顯著(P<0.001)。在CIITA-B/C豬不同組織樣本中(圖7B)，CIITA-B在肺中表達(dá)量最高，CIITA-C在脾中表達(dá)量最高，同樣在心中表達(dá)量最低；除了脊髓外，在其他組織中CIITA-B表達(dá)量高于CIITA-C，在脾、甲狀腺和胸腺中差異顯著(P<0.05)。

A. 豬CIITA核苷酸序列比對(duì)結(jié)果，陰影區(qū)域內(nèi)為缺失片段；B. 豬CIITA氨基酸比對(duì)結(jié)果A. The nucleotide sequence alignment result of porcine CIITA, and the shadow regions are the deletion fragments; B. The amino acid alignment result of porcine CIITA圖2 豬CIITA核苷酸與氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Aligning results of porcine CIITA nucleotide and amino acid sequences

圖3 不同物種CIITA基因遺傳進(jìn)化樹Fig.3 The genetic evolution tree of CIITA gene in different species

圖4 不同豬品種CIITA不同剪接突變體的遺傳進(jìn)化分析Fig.4 Genetic evolution analysis of different splicing mutants of CIITA in different pig breeds

表5 豬CIITA不同可變剪切體氨基酸序列預(yù)測信息

方框區(qū)域?yàn)镃IITA-A與CIITA-B共同缺失部分The box area is the common missing part of CIITA-A and CIITA-B圖5 CIITA與兩種突變體結(jié)構(gòu)與預(yù)測Fig.5 The structure and prediction of CIITA and two mutants

圖6 豬CIITA蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 The prediction of tertiary structure of CIITA protein

*、**、***分別表示在同一組織中CIITA-A、CIITA-B、CIITA-C的表達(dá)量差異達(dá)顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01，P<0.001)*, **, *** indicate the expression of CIITA-A, CIITA-B, CIITA-C in the same tissue was significantly different (P<0.05), extremely significantly different (P<0.01, P<0.001), respectively圖7 CIITA基因剪接突變體在豬不同組織中的表達(dá)Fig.7 Expression of splicing mutants of CIITA gene in different tissues of pigs

3 討 論

MHC II類分子提呈經(jīng)過加工的外來抗原給CD4+T細(xì)胞的抗原受體，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞激活和分化，從而在誘發(fā)免疫應(yīng)答中起重要的作用[19-22]。CIITA是MHC II類分子重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，其研究價(jià)值也變得十分重要[23-24]。CIITA作為非DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子，是調(diào)控MHC II類分子表達(dá)最主要的轉(zhuǎn)錄分子之一，決定了MHC II類分子表達(dá)的高低[25-26]。CIITA基因前體mRNA存在選擇性剪切，不同的選擇性剪切體形式編碼不同分子量的蛋白，致使CIITA蛋白具有多樣性，從而功能也產(chǎn)生差異，有些剪切體將不能正確啟動(dòng)MHC II類分子的表達(dá)，使宿主不能發(fā)揮正常的抗原提呈功能。CIITA的剪接突變可引起機(jī)體產(chǎn)生一系列的癥狀，例如，裸淋巴細(xì)胞綜合征(bare lymphocyte syndrome, BLS)主要是由于CIITA基因發(fā)生了剪接突變，終止密碼子提前，導(dǎo)致后續(xù)所編碼的蛋白質(zhì)縮短，不能正常發(fā)揮功能，使患者發(fā)生感染，并引發(fā)一系列的并發(fā)癥[27]。也有研究表明，人CIITA LRR丙氨酸突變既消除了CIITA的反式激活能力，又消除了具有N端缺失的CIITA突變體的顯性陰性表型[28]。此外，目前異種器官移植研究已成為醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)之一。由于人與豬的基因同源性和遺傳特征較為相似，使其成為理想的動(dòng)物模型，所以現(xiàn)在研究多集中于人與豬之間異種器官移植[29]，突變后的人CIITA(缺少N端的基因序列)可以跨越種間屏障，用該突變體搶先結(jié)合豬SLA II類分子從而可抑制其轉(zhuǎn)錄[30]。對(duì)于病原體會(huì)通過使用各種策略來避免宿主發(fā)出的保護(hù)性免疫反應(yīng)。為了抑制MHC II類分子的表達(dá)和建立CD4+T細(xì)胞的依賴性免疫應(yīng)答，許多病原體已經(jīng)開發(fā)出干擾CIITA功能或表達(dá)的方法。例如人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)，HIV Tat蛋白通過與CIITA競爭結(jié)合從而干擾CIITA的正常功能[31]。以上的研究表明，CIITA的剪接突變在自身免疫病與移植反應(yīng)中起到了十分重要的作用。

CIITA不同剪接突變體與豬品種和群體中個(gè)體差異有關(guān)，已經(jīng)預(yù)測不同品種豬中均存在CIITA不同剪接突變體，蘇麗娟[32]從長白豬中擴(kuò)增獲得了2個(gè)CIITA突變體。本研究所用的SPF大白豬和長白豬是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存的一批優(yōu)良試驗(yàn)動(dòng)物，遺傳背景清晰，已排除14種病原微生物，與普通級(jí)豬相比，SPF豬更容易排除無關(guān)變量及試驗(yàn)之外最大化的未知干擾，也可排除病原微生物引起CIITA的誘導(dǎo)性表達(dá)。利用RT-PCR擴(kuò)增和測序共獲得了3種CIITA剪接突變體形式，其中CIITA-A和CIITA-B突變體分別缺失了40 和199 bp，使終止密碼子提前，從而導(dǎo)致編碼的氨基酸縮短。缺失40 bp的突變體序列與蘇麗娟[32]獲得的CIITA8一致。對(duì)CIITA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)剪接突變體中α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲和延長片段所占比例非常接近，進(jìn)一步分析三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，缺失核苷酸突變體的蛋白結(jié)構(gòu)也受到了剪接的影響，均缺失了末端富含亮氨酸的4個(gè)LRRs，使蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變?，F(xiàn)已證明，SLA基因是一個(gè)重要的抗病育種分子標(biāo)記[33]。不同SLA單倍型豬對(duì)疫病抗病性不同，因此CIITA作為調(diào)控SLA II類分子表達(dá)的反式激活因子，其剪接突變體的鑒定對(duì)抗病育種具有一定的指導(dǎo)意義，剪接突變體編碼蛋白結(jié)構(gòu)的缺失不能正確啟動(dòng)SLA II類分子的表達(dá)，致使宿主不能發(fā)揮正常的抗原提呈功能，從而可能會(huì)進(jìn)一步影響試驗(yàn)豬對(duì)疾病表現(xiàn)出抗性或易感性，在群體中表現(xiàn)出個(gè)體差異，由此可篩選出免疫功能較強(qiáng)的個(gè)體，提高豬的抗病力，從而有望培育出抗病力較強(qiáng)的品種或品系[34-35]。

與其他物種的CIITA相比較，發(fā)現(xiàn)豬與綿羊和牛具有較近的親緣關(guān)系，而在不同豬品種中進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)3種CIITA剪接突變體聚為一支，且SPF大白豬和長白豬與usmarc、皮特蘭、巴美豬、榮昌豬、梅山豬和金華豬具有共同的起源。針對(duì)單個(gè)基因來講，尤其是對(duì)被CIITA調(diào)控的SLA基因，權(quán)金強(qiáng)等[36]、江新杰等[37]利用來源相同的SPF大白豬和長白豬研究了SLA-1和SLA II類分子特征，系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果表明，SPF大白豬和長白豬與Yucatan、韓國本地豬和梅山豬等親緣關(guān)系較近，與本研究具有相似性，都與梅山豬親緣關(guān)系較近。推測某些地方豬種早期培育中可能引入了大白豬或長白豬的血緣，從而表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同的CIITA剪接突變體在所檢測的組織中均有表達(dá)，且表達(dá)量趨勢一致，均在脾或肺中表達(dá)量較高，其次是腎、脊髓、甲狀腺、肝、胸腺，在心組織中表達(dá)最低，這種表達(dá)差異主要是由于不同組織主要構(gòu)成細(xì)胞與功能不同引起的，CIITA蛋白可在胸腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，也可在活化的細(xì)胞和專職的抗原提呈細(xì)胞中表達(dá)，因此，在免疫器官中表達(dá)相對(duì)較高，其他器官中相對(duì)較低。但在本研究中，與胸腺相比，不同剪接突變體在肺中的表達(dá)量較高。CIITA是SLA II類分子的反式激活因子，而SLA II類分子主要表達(dá)在起抗原提呈作用的專職性抗原提呈細(xì)胞，而肺泡中主要含有肺泡巨噬細(xì)胞，該細(xì)胞屬于專職性抗原提呈細(xì)胞并會(huì)影響其表達(dá)量的提高。胸腺屬于人體淋巴系統(tǒng)中的重要器官，是T淋巴細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟的場所，由淋巴細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞組成，這可能是CIITA突變體在肺中表達(dá)量比胸腺中高的原因之一。此外，剪接突變可能會(huì)使功能性CIITA的表達(dá)量降低，導(dǎo)致其不能發(fā)揮正常功能。根據(jù)同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量可以區(qū)分亞型，表達(dá)量最高的轉(zhuǎn)錄本為主要亞型，表達(dá)量相對(duì)較低的轉(zhuǎn)錄本為次要亞型[38]。在CIITA-A/CIITA-C型個(gè)體同一組織中CIITA-C的表達(dá)量均高于CIITA-A，甚至在肝中達(dá)到極顯著，所以在此樣本中CIITA-C為主要亞型。在CIITA-B/CIITA-C型個(gè)體不同組織中，CIITA-B表達(dá)量高于CIITA-C，所以CIITA-B為主要亞型。CIITA剪接突變體在個(gè)體內(nèi)表達(dá)稍有差異，表現(xiàn)的主要亞型有所不同，可能會(huì)對(duì)后續(xù)的CIITA在自關(guān)聯(lián)、核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和MHC-II基因轉(zhuǎn)活化方面都會(huì)表現(xiàn)出一定功能上的影響，其后續(xù)影響還有待進(jìn)一步研究[39-40]。

4 結(jié) 論

本研究從SPF大白豬和長白豬中克隆測序共獲得了3個(gè)CIITA剪接突變體，其中兩個(gè)突變體由于終止密碼子的提前致使編碼CIITA蛋白的結(jié)構(gòu)域受到了剪接的影響，缺失了末端富含亮氨酸的4個(gè) 重復(fù)結(jié)構(gòu)域，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變，而且針對(duì)CIITA，豬與綿羊和牛具有較近的親緣關(guān)系，且在不同豬種中具有一定的保守性。CIITA不同剪接突變體在豬不同組織中均有表達(dá)，表達(dá)量稍有差異，本研究為進(jìn)一步研究豬CIITA功能及其在動(dòng)物體內(nèi)的相關(guān)調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。