云南省漢族人群TNF-α基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性

楊 佳，劉舒媛，王瑩瑩，李盈甫，馬千里，李 玙，王永蓉，李傳印，譚 芳

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118；

2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部醫(yī)療科，云南 昆明 650032；

3.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院胸外科，云南 昆明 650118

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤。國(guó)家癌癥中心發(fā)布的中國(guó)最新癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，2015年中國(guó)男性肺癌發(fā)病率為20.30%，是男性發(fā)病率第1位的惡性腫瘤；女性肺癌發(fā)病率為15.02%，是女性發(fā)病率第2位的惡性腫瘤［1］。2015年中國(guó)因肺癌死亡約63.1萬(wàn)例，占全國(guó)惡性腫瘤死亡人數(shù)的26.99%，死亡率在男性和女性惡性腫瘤患者中均排在第1位［1］。肺癌的病因多樣，至今尚不完全明確。持續(xù)的慢性炎癥在多種腫瘤（肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌等）的發(fā)生、發(fā)展以及癌癥患者的生存中具有重要作用［2］。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一種重要的多功能炎癥因子，最早因其能夠使多種腫瘤發(fā)生出血性壞死而被發(fā)現(xiàn)并命名［3］，TNF-α在腫瘤微環(huán)境中的促腫瘤作用已被廣泛研究，TNF-α是炎癥與惡性腫瘤相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)之一［4］。在體內(nèi)，TNF-α主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞分泌，其通過與腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）結(jié)合而進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并發(fā)揮效應(yīng)。研究［3］發(fā)現(xiàn)，TNF-α不僅可以誘導(dǎo)一些炎癥因子和蛋白酶對(duì)腫瘤產(chǎn)生直接的殺傷作用，還可以由腫瘤自身產(chǎn)生，作為一種內(nèi)源性生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。因此，TNF-α可能作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段，與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展均具有相關(guān)性［3，5］。在健康人血清中一般檢測(cè)不到TNF-α，然而在多種癌癥如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌等患者血清中卻?？蓹z測(cè)到很高的TNF-α水平［6］。腫瘤患者特別是預(yù)后較差的進(jìn)展性腫瘤患者血清中TNF-α水平明顯升高。Karayiannakis等［7］的研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者中有明顯轉(zhuǎn)移的患者血清中TNF-α水平顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移的患者。Yoshida等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，腎癌患者血清中TNF-α水平與腎癌的轉(zhuǎn)移也具有相關(guān)性，有明顯轉(zhuǎn)移的腎癌患者血清中TNF-α水平顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移的患者及健康對(duì)照者?；颊哐逯蠺NF-α水平與腫瘤大小也具有相關(guān)性。另外，TNF-α對(duì)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發(fā)生、發(fā)展及耐藥也起著十分重要的作用。Shang等［9］研究發(fā)現(xiàn)，血清高TNF-α水平與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。另有研究［10］發(fā)現(xiàn)，TNF-α可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)離子輻射的敏感性，抑制細(xì)胞遷移，肺癌患者中高TNF-α水平與肺癌進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。TNF-α基因位于人類6號(hào)染色體主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）基因的第三類基因區(qū)域，TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域存在大量的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)，例如-308G>A、-238G>A等，這些SNP位點(diǎn)可能會(huì)因堿基序列的改變影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合從而導(dǎo)致TNF-α基因表達(dá)量的變化，最終可能會(huì)影響腫瘤的易感性和嚴(yán)重程度。Xie等［11］的一項(xiàng)meta分析發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因-308G>A與亞洲人群的肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的增加相關(guān)，F(xiàn)lego等［12］研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α-238G>A的GG基因型可顯著促進(jìn)NSCLC的進(jìn)程。本研究通過比較TNF-α基因中啟動(dòng)子區(qū)域rs1799964（-1031T>C）、rs1800630（-863C>A）、rs1799724（-857C>T）、rs1800629（-308G>A）和rs361525（-238G>A）5個(gè)SNP位點(diǎn)在云南省漢族肺癌患者和健康對(duì)照者中的頻率差異，探討云南省漢族人群TNF-α基因SNP與肺癌的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2011—2019年在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院確診為NSCLC的云南戶籍患者425例作為病例組，根據(jù)世界衛(wèi)生組織肺癌組織類型劃分標(biāo)準(zhǔn)，病例組按病理學(xué)類型分為鱗癌、腺癌、腺鱗癌及其他類型肺癌；另外，采用國(guó)際肺癌臨床分期系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期，病例組臨床分期分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期。病例組的納入標(biāo)準(zhǔn)為：戶籍地為云南省的新確診肺癌病例，未接受過放化療等抗腫瘤治療，未患有其他惡性腫瘤，無(wú)其他系統(tǒng)性疾病。選取同期在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院進(jìn)行體檢的438名健康體檢者作為對(duì)照組。對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)為：戶籍地為云南省的個(gè)體，影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)肺部占位性病變，無(wú)刺激性干咳、血痰、胸痛等癥狀，未患其他惡性腫瘤，無(wú)其他系統(tǒng)性疾病。所有研究對(duì)象均為彼此無(wú)血緣關(guān)系的漢族個(gè)體，年齡15～88歲。本研究的研究方案和實(shí)驗(yàn)方法已獲昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)和昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有參與本研究的個(gè)體均已知曉并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集及基因組DNA提取

采集空腹靜脈血5 mL，用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）或肝素抗凝，使用全血基因組DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國(guó)QIAGEN公司）提取DNA。用超微量紫外可見分光光度計(jì)（NanoDrop 2000，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）檢測(cè)DNA的濃度和純度。

1.2.2 基因分型

本研究采用TaqMan探針分型法對(duì)TNF-α基因的5個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。TaqMan探針（TaqMan SNP Genotyping Assays）和基于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）的SNP分型試劑（TaqPath? ProAmp?Master Mix）購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，其中SNP位點(diǎn)rs1799964（分析序列號(hào)：C_7514871_10）、rs1799724（分析序列號(hào)：C_11918223_10）、rs1800629（分析序列號(hào)：C_7514879_10）、rs361525（分析序列號(hào)：C_2215707_10）為美國(guó)Applied Biosystems公司預(yù)設(shè)探針。SNP位點(diǎn)rs1800630為美國(guó)Applied Biosystems公司訂制探針，正向引物序列為5’-GGGCTATGGAAGTCGAGTATGG-3’，反向引物序列為5’-CCCTCTACATGGCCCTGTCT-3’。ⅤIC探針序列為ACCCCCACTTAACG，F(xiàn)AM探針序列為ACCCCCCCTTAACG（序列中字體帶下劃線標(biāo)記的堿基為rs1800630位點(diǎn)等位基因?qū)?yīng)的堿基）。使用美國(guó)Applied Biosystems公司QuantStudio 6 Flex RTFQ-PCR儀進(jìn)行SNP分型檢測(cè)。反應(yīng)體系為5.00 μL，包含SNP分型試劑2.50 μL、TaqMan探針0.25 μL、樣品DNA 1.00 μL、水1.25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 30 s預(yù)讀板，95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 1 min退火延伸，共40個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陰性對(duì)照（以水代替DNA模板樣本）。使用基因分型軟件TaqMan Genotyper Software進(jìn)行結(jié)果分析。同時(shí)，每個(gè)位點(diǎn)隨機(jī)挑取10個(gè)樣本進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，通過分型結(jié)果和測(cè)序結(jié)果的對(duì)比來(lái)判斷分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用t檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組的年齡差異，用χ2檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組的性別差異。使用Plink軟件（v1.07）［13］計(jì)算病例組和對(duì)照組中每個(gè)位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率及哈迪-溫伯格平衡，并用χ2檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組間等位基因和基因型頻率的差異。使用在線軟件SNPStats［14］對(duì)5個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行5種遺傳模式的分析：共顯性模式、顯性模式、隱性模式、超顯性模式和邏輯加性模式，根據(jù)赤池信息量準(zhǔn)則（Akaike Information Criterion，AIC）和貝葉斯信息準(zhǔn)則（Bayesian Information Criterion，BIC）的數(shù)值來(lái)確定每個(gè)位點(diǎn)的最優(yōu)遺傳模式，即AIC和BIC數(shù)值最小的遺傳模式為最優(yōu)的遺傳模式。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用在線軟件SHEsis［15］計(jì)算各SNP位點(diǎn)間的連鎖不平衡情況，用D’表示，D’=0時(shí)，表示SNP位點(diǎn)連鎖完全平衡，D’=1時(shí)，表示SNP位點(diǎn)連鎖完全不平衡，通常認(rèn)為D’＞0.8時(shí)，SNP位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖。構(gòu)建D’>0.8的SNP位點(diǎn)的單倍型，并用χ2檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組間單倍型頻率的差異。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基本特征

本研究共納入NSCLC患者425例，平均年齡（55.81±10.69）歲，男性293例，女性132例。病例組按病理學(xué)類型分為鱗癌患者153例，腺癌患者249例，腺鱗癌及其他類型肺癌患者23例；按臨床分期分為Ⅰ+Ⅱ期患者134例，Ⅲ+Ⅳ期患者291例。對(duì)照組438例，平均年齡（55.52±19.26）歲，男性312例，女性126例。病例組和對(duì)照組間的年齡和性別分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 TNF-α基因5個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因及基因型頻率分析

本研究除rs1800630位點(diǎn)外，其余SNP位點(diǎn)的基因型在總病例組和對(duì)照組中的分布均符合哈迪-溫伯格平衡定律（P＞0.05），說(shuō)明本研究的樣本是具有群體代表性的隨機(jī)樣本。

TNF-α基因啟動(dòng)子5個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率在NSCLC病例組和對(duì)照組間的比較見表1。結(jié)果顯示，TNF-α基因啟動(dòng)子5個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率在NSCLC病例組和對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。將病例組進(jìn)一步按病理學(xué)類型分為鱗癌組、腺癌組、腺鱗癌及其他類型肺癌組，按臨床分期分為Ⅰ+Ⅱ期組和Ⅲ+Ⅳ期組，分別分析各病例亞組與對(duì)照組間的等位基因和基因型頻率差異，結(jié)果見表2（部分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果未展示）。rs1799724位點(diǎn)的T等位基因在腺癌組中的頻率顯著高于對(duì)照組（P=0.010，OR=1.56，95%CI：1.11～2.19），其基因型頻率在腺癌病例組與對(duì)照組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026）。rs1800630（-863C>A）位點(diǎn)的A等位基因在腺鱗癌及其他類型肺癌組中的頻率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013，OR=2.15，95%CI：1.16～3.96）。其余位點(diǎn)在病例分層分析比較中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 TNF-α基因啟動(dòng)子5個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率在NSCLC病例組和對(duì)照組間的比較Tab.1 The distribution of the 5 SNP sites in TNF-α gene promoter in NSCLC group and control group

表2 NSCLC病例分層分析TNF-α基因啟動(dòng)子5個(gè)SNP位點(diǎn)與肺癌的相關(guān)性Tab.2 The stratified analysis of the association between the 5 SNP sites in TNF-α gene and NSCLC

2.3 遺傳模式分析TNF-α基因SNP位點(diǎn)與NSCLC的相關(guān)性

在NSCLC病例組和對(duì)照組的分析中發(fā)現(xiàn)，rs1799964位點(diǎn)的最優(yōu)遺傳模式為隱性模式，rs1800630位點(diǎn)的最優(yōu)遺傳模式為超顯性模式，rs1799724位點(diǎn)的最優(yōu)遺傳模式為顯性模式，rs1800629位點(diǎn)的最優(yōu)遺傳模式為隱性模式，rs361525位點(diǎn)因?yàn)橹挥?個(gè)基因型所以不能進(jìn)行遺傳模式分析。在上述最優(yōu)遺傳模式中，NSCLC病例組和對(duì)照組之間的基因型頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表3）。

表3 SNP位點(diǎn)在總NSCLC病例組和對(duì)照組中的遺傳模式分析Tab.3 The inheritance analysis of the SNP sites between total NSCLC group and control group

另外，對(duì)不同病例分層組與對(duì)照組間5個(gè)SNP的基因型頻率差異進(jìn)行遺傳模式分析，在腺癌組和對(duì)照組的比較分析中，rs1799724的最優(yōu)遺傳模式為顯性模式，在顯性模式下攜帶T等位基因的個(gè)體（TT+CT）患肺腺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高（P=0.007，OR=1.66，95% CI：1.146～2.417，表4）。在其他類型肺癌組和對(duì)照組的比較分析中，rs1800630的最優(yōu)遺傳模式為邏輯加性模式。在邏輯加性模式下，其他類型肺癌組和對(duì)照組之間的基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.036，OR=1.818，95% CI：1.064～3.125，表5）?；蛐?A/A-A/C可能與其他類型肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)。

表4 rs1799724在腺癌病例和對(duì)照組中的遺傳模式分析Tab.4 The inheritance analysis of rs1799724 between adenocarcinoma group and control group

表5 rs1800630在其他類型肺癌癥病例和對(duì)照組中的遺傳模式分析Tab.5 The inheritance analysis of rs1800630 between other pathological types and control group

2.4 TNF-α基因SNP位點(diǎn)連鎖不平衡分析

通過在線軟件SHEsis分析5個(gè)SNP位點(diǎn)在對(duì)照組中的連鎖不平衡，結(jié)果顯示，rs1799964分別與rs1799724、rs1800629、rs361525位點(diǎn)間存在連鎖不平衡，連鎖不平衡D’值分別為0.997、0.991、1.000。另外rs1799724與rs1800629位點(diǎn)間也存在連鎖不平衡，D’值為0.989（圖1）。

圖1 5個(gè)SNP位點(diǎn)在研究群體中的連鎖不平衡情況Fig.1 The linkage disequilibrium analysis of the 5 SNP sites

分別構(gòu)建單倍型rs1799964-rs1799724、rs1799964-rs1800629、rs1799964-rs361525、rs1799724-rs1800629，分別比較各單倍型（單倍型頻率>0.03）在總NSCLC病例組和對(duì)照組間的分布差異，結(jié)果顯示，各單倍型頻率在總NSCLC病例組和對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表6）。另外，分層分析不同病例亞組與對(duì)照組及不同病例亞組之間各單倍型的頻率差異，部分結(jié)果見表7，單倍型rs1799964Trs1800629G在Ⅰ+Ⅱ期NSCLC病例組中的頻率顯著高于對(duì)照組（P=0.02，OR=1.46，95%CI：1.06～2.02）和Ⅲ+Ⅳ期NSCLC病例組（P=0.038，OR=0.7，95% CI：0.50～0.98），而該單倍型頻率在Ⅲ+Ⅳ期NSCLC病例組和對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；單倍型rs1799964C-rs361525G在Ⅲ+Ⅳ期NSCLC 病例組中的頻率顯著高于Ⅰ+Ⅱ期NSCLC病例組（P=0.047，OR=1.45，95%CI：1.00～2.09），而單倍型rs1799964Trs361525G在Ⅲ+Ⅳ期NSCLC病例組中的頻率顯著低于Ⅰ+Ⅱ期NSCLC病例組（P=0.047，OR=0.69，95% CI：0.48～1.00）；單倍型rs1799724T-rs1800629G頻率在腺癌組和對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.048，OR=1.42，95% CI：1.00～2.01）。

表6 NSCLC病例組和對(duì)照組間的單倍型分布差異Tab.6 The haplotype analysis between NSCLC group and control group

表7 不同分期和不同類型的肺癌病例中的單倍型頻率比較（部分）Tab.7 The haplotype analysis between different clinical stages and pathological types and control groups (patial)

續(xù)表 7

3 討 論

慢性炎癥與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在相互作用，持續(xù)的慢性炎癥在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用［2］。在一些類型的癌癥中，炎癥狀況先于惡性腫瘤的發(fā)展，在某些情況下，癌癥的發(fā)展驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生腫瘤促炎癥微環(huán)境［16］。腫瘤的炎癥微環(huán)境主要是由新生血管、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及它們分泌產(chǎn)生的各種炎癥因子及細(xì)胞基質(zhì)等組成。腫瘤微環(huán)境中存在著大量的炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞等。這些細(xì)胞分泌的炎癥因子是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，影響腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程。TNF-α是腫瘤炎癥微環(huán)境中一種重要的細(xì)胞因子，也是細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要成員。研究［3］發(fā)現(xiàn)，TNF-α對(duì)腫瘤的作用有兩種截然不同的結(jié)局：不但可以殺傷腫瘤細(xì)胞，還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)，TNF-α不僅由巨噬細(xì)胞分泌，多種腫瘤細(xì)胞也會(huì)分泌，如B細(xì)胞淋巴瘤、卵巢上皮癌等。在腫瘤細(xì)胞中，TNF-α作為一種自分泌生長(zhǎng)因子可誘導(dǎo)其他生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、惡性轉(zhuǎn)化、血管生成等過程，從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程中發(fā)揮重要作用［3，17］。早期研究［18］發(fā)現(xiàn)，TNF-α在體內(nèi)外均能直接殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，TNF與其受體TNFR1結(jié)合后進(jìn)而結(jié)合TNFR相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TNFR-associated death domain protein，TRADD）可誘導(dǎo)兩種完全不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：①TNF與受體復(fù)合體識(shí)別并結(jié)合Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD），從而激活Caspase 8和Caspase 3，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；② TNF與TNFR配體復(fù)合物可結(jié)合多種TNFR相關(guān)因子（TNFR-associated factor，TRAF），進(jìn)而激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、Jun氨基末端激酶（Jun amino-terminal kinase，JNK）介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并促進(jìn)細(xì)胞增殖。

崔力方等［4］研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在腫瘤患者特別是預(yù)后較差的患者血清中含量明顯增高，并在多種癌癥組織中呈高表達(dá)。孫云暉等［19］發(fā)現(xiàn)，TNF-α在肺癌組織中的表達(dá)高于非肺癌組織，在Ⅲ～Ⅳ期中的表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期，可能是因?yàn)榘┌Y患者持續(xù)的應(yīng)激反應(yīng)造成TNF-α表達(dá)量持續(xù)升高，然后又與巨噬細(xì)胞作用產(chǎn)生更多的TNF-α［20］。高表達(dá)的TNF-α又通過促進(jìn)腫瘤血管生成和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［4，21］。

本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域5個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率在NSCLC組與正常對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步又對(duì)NSCLC病例組進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示，腺癌組中rs1799724-T等位基因的頻率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01，OR=1.56，95% CI：1.11～2.19），rs1799724的基因型頻率在腺癌組與對(duì)照組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026）。rs1800630-A等位基因在腺鱗癌及其他類型肺癌組中的頻率顯著高于對(duì)照組（P=0.013，OR=2.15，95% CI：1.16～3.96）。其余位點(diǎn)在病例分層分析比較中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明同一基因中的多態(tài)性在不同病理學(xué)類型的同種疾病中發(fā)揮的作用不同。本研究還將強(qiáng)連鎖位點(diǎn)構(gòu)建了單倍型，并分析了不同單倍型在對(duì)照組與總NSCLC病例組、各病例亞組間的頻率差異。結(jié)果顯示，rs1799724Trs1800629G單倍型在腺癌組與對(duì)照組間的分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.048，OR=1.42，95%CI：1.00～2.01），表明rs1799724-T可能是腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性因素。另外，單倍型rs1799964Trs1800629G在Ⅰ+Ⅱ期NSCLC病例組中的頻率顯著高于對(duì)照組（P=0.02，OR=1.46，95% CI：1.06～2.02）及Ⅲ+Ⅳ期NSCLC病例組（P=0.038，OR=0.70，95% CI：0.50～0.98），而在Ⅲ+Ⅳ期NSCLC病例組和對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單倍型rs1799964C-rs361525G在Ⅲ+Ⅳ期NSCLC病例組中的頻率顯著高于Ⅰ+Ⅱ期NSCLC病例組（P=0.047，OR=1.45，95% CI：1.00～2.09），而單倍型rs1799964T-rs361525G在Ⅲ+Ⅳ期NSCLC病例組中的頻率顯著低于Ⅰ+Ⅱ期NSCLC病例組（P=0.047，OR=0.69，95% CI：0.48～1.00），推測(cè)rs1799964T與其他位點(diǎn)的聯(lián)合作用可能與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

Shih等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)臺(tái)灣省人群中，rs1800629-AA/GA基因型的攜帶者較GG基因型攜帶者的NSCLC的患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增高（OR=3.75，95% CI：2.38～5.92，P＜0.0001）而rs361525-AA/GA基因型攜帶者的NSCLC的患病風(fēng)險(xiǎn)顯著低于GG基因型攜帶者（OR=0.26，95%CI：0.13～0.50，P＜0.0001）。Flego等［12］研究發(fā)現(xiàn)，rs361525-G等位基因和GG基因型與NSCLC相關(guān)。Kaabachi等［23］研究發(fā)現(xiàn)，在突尼斯人群中，rs1800629和rs361525可能與NSCLC的患病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)rs1800629及rs361525與NSCLC的關(guān)聯(lián)性，這可能是不同人群間遺傳背景的差異造成的。

有研究［24-25］顯示，TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域的一些SNP位點(diǎn)變異與TNF-α基因的轉(zhuǎn)錄起始相關(guān)，這些SNP位點(diǎn)的堿基差異可影響T N F-α 的表達(dá)水平改變。此外，有研究［26-27］顯示，rs1800629（-308G>A）和rs361525（-238G>A）堿基的改變與轉(zhuǎn)錄活性降低顯著相關(guān)。rs17999724（-857C>T）位點(diǎn)的C堿基變異為T堿基后，TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域可結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子OCT1從而導(dǎo)致TNF-α表達(dá)量的增加［28］。攜帶rs 17999724-T、rs1800630-A和rs1799964-C變異的TNF-α基因啟動(dòng)子活性均高于原本的啟動(dòng)子（rs1799724-C、rs1800630-C和rs1799964-T）活性［29］。另外，有研究［3，17］發(fā)現(xiàn)，這5個(gè)SNP位點(diǎn)與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，如乳腺癌、宮頸癌、口腔癌、肺癌及頭頸腫瘤等。還有研究［30］發(fā)現(xiàn)，rs1799724-T等位基因是宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素，rs1799724-TT基因型與胃癌的發(fā)生相關(guān)［31］；而Landi等［32］研究發(fā)現(xiàn)，rs1799724位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)腸癌無(wú)關(guān)；Danforth等［33］研究發(fā)現(xiàn)，rs1799724位點(diǎn)的多態(tài)性與前列腺癌無(wú)關(guān)。Xu等［34］研究發(fā)現(xiàn)，rs1800629位點(diǎn)與中國(guó)人群胃癌相關(guān)；Dantas研究［35］發(fā)現(xiàn)，rs1800629與巴西人群胃癌相關(guān)，表明TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域的多態(tài)性位點(diǎn)與癌癥的關(guān)聯(lián)性在不同群體中具有很強(qiáng)的異質(zhì)性。

還有研究［36］發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因rs1799724位點(diǎn)的T等位基因和MPO基因rs2333227位點(diǎn)的G等位基因單獨(dú)作用于人體時(shí)，可能與肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)，但它們相互作用時(shí)，這對(duì)“風(fēng)險(xiǎn)”組合與肺癌沒有產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，可能是因?yàn)閿y帶rs1799724位點(diǎn)T等位基因能表達(dá)較高的TNF-α，而攜帶rs2333227位點(diǎn)G等位基因會(huì)降低MPO基因的表達(dá)，因此，高產(chǎn)量的TNF-α可以抵消MPO高產(chǎn)的不利影響。另外，TNF-α基因1799724位點(diǎn)CT和TT基因型在吸煙人群中相比不吸煙人群有更高的肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)［36］，證明肺癌的發(fā)生、發(fā)展是多種因素共同作用的結(jié)果，既與吸煙、環(huán)境等因素有關(guān)，也與自身遺傳因素有關(guān)。然而自身遺傳因素復(fù)雜多樣，并且在不同種族、不同人群中也不一樣。本研究選取的5個(gè)SNP位點(diǎn)位于TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)子區(qū)域的SNP位點(diǎn)可能會(huì)通過影響TNF-α基因轉(zhuǎn)錄中和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控起到影響基因表達(dá)的作用，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但本研究未能對(duì)研究對(duì)象的血清TNF-α水平進(jìn)行檢測(cè)，從而分析TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域基因多態(tài)性與基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性，這是本研究的缺陷。今后要充分闡明TNF-α基因多態(tài)性位點(diǎn)與肺癌的相關(guān)性以及在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，還需要對(duì)基因多態(tài)性位點(diǎn)的功能進(jìn)行驗(yàn)證，并綜合不同人群樣本的研究結(jié)果及綜合多種影響因素進(jìn)行系統(tǒng)性分析。