蘿卜硫素對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、增殖和遷移的影響研究

謝金芳，曹春雨，任 雪，田家俊，呂亞豐，黃曉飛

1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，湖北 宜昌 443002；

2.三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002

乳腺癌是導(dǎo)致全球婦女癌癥相關(guān)死亡的主要原因，目前隨著乳腺癌發(fā)病的低齡化，其發(fā)病率和死亡率顯著增加［1-2］。表觀遺傳調(diào)控（包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA和染色質(zhì)重塑）的異常改變在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［3］。其中，組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）主要催化組蛋白H3的N端第9位賴氨酸殘基和非組蛋白賴氨酸殘基的去乙?；磻?yīng)，由此導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)呈壓縮狀態(tài)，進(jìn)而抑制基因轉(zhuǎn)錄［4-5］。HDAC被分為Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ和Ⅳ類，HDAC的異常高表達(dá)已成為抗腫瘤研究的重要靶點(diǎn)［6-8］。既往研究［9-11］證實(shí)，Ⅱa類HDAC5能通過下調(diào)組蛋白H3K9乙?；种埔职┗虮磉_(dá)，參與多種腫瘤的發(fā)生，其還能夠去乙?；疨53促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和拮抗細(xì)胞凋亡的發(fā)生［12］。HDAC5在乳腺癌組織中異常高表達(dá)，其表達(dá)水平與乳腺癌惡性程度呈正相關(guān)，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。HDAC5通過穩(wěn)定LSD1蛋白水平，與LSD1形成基因表達(dá)調(diào)控軸，協(xié)同抑制多種抑癌基因表達(dá)，在三陰性乳腺癌和ER陽性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，是潛在的抗乳腺癌治療靶點(diǎn)［13］。蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）是提取自西蘭花、芥藍(lán)等十字花科植物的一種含硫小分子化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化及抗癌作用［14-16］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。SFN對7,12-二甲基苯并蒽誘發(fā)的大鼠乳腺癌具有顯著的抑制效應(yīng)［17］。此外，SFN可顯著提高乳腺癌細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性，與單一化療藥物相比，可顯著降低癌細(xì)胞的存活率（P＜0.05）［18］。SFN聯(lián)合氯法拉濱可通過解除乳腺癌細(xì)胞抑癌基因的DNA甲基化而使抑癌基因復(fù)活，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［19］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，SFN能夠通過阻斷HDAC5的轉(zhuǎn)錄因子USF1，下調(diào)HDAC5表達(dá)，抑制人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231和BT-474細(xì)胞的增殖［20］。本研究通過建立HDAC5過表達(dá)的小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞系和4T1細(xì)胞的BALB/c小鼠移植瘤模型，研究SFN處理對4T1細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、增殖、侵襲和遷移的影響，并進(jìn)一步驗(yàn)證HDAC5作為抗三陰性乳腺癌治療靶點(diǎn)和SFN用于抗三陰性乳腺癌治療的潛在價值。

圖1 SFN的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of SFN

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。SFN購自美國Sigma-Aldrich公司，胎牛血清購自以色列Biological Industries公司，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基粉末購自美國Gibco公司，Turbofect轉(zhuǎn)染試劑、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒購自美國Thermo Fisher Sciencific公司，小鼠抗人上皮鈣黏著蛋白（E-cadherin）抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗體和小鼠抗人波形蛋白（vimentin）抗體購自英國Abcam公司，兔抗人β-actin、HDAC5抗體購自美國Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗/山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，pcDNA(3.1+)-FLAG-HDAC5質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）和乳酸脫氫酶檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購自日本Takara公司，SYBR-Green購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，實(shí)時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL（4.0×103個細(xì)胞/孔），將培養(yǎng)板置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。分別用含終濃度為0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μmol/L SFN的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24、48 h。向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育4 h。用酶標(biāo)儀測定每孔在450 nm波長處的吸光度（D）值。計(jì)算細(xì)胞存活率（%）=（D實(shí)驗(yàn)組-D空白組）/（D陰性對照組-D空白組）×100%。藥物的半數(shù)抑制濃度（half inhibition concentration，IC50）由Graphpad Prism 8.0軟件計(jì)算得出。

1.2.2 乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)檢測藥物毒性

將1×104個4T1細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，分別用含終濃度為0.0、7.5、15.0、25.0、50.0 μmol/L SFN的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。將培養(yǎng)細(xì)胞分為空白對照組（無細(xì)胞）、細(xì)胞對照組（無藥物處理）、細(xì)胞最大酶活性對照組（無藥物處理）、藥物處理細(xì)胞組，每組3個復(fù)孔，加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照試劑盒說明書進(jìn)行處理并測定每孔在490 nm波長處的D值。計(jì)算藥物毒性（%）=（D藥物處理組-D細(xì)胞對照組）/（D細(xì)胞最大酶活性組-D細(xì)胞對照組）×100%。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白水平

收集細(xì)胞，使用放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）全細(xì)胞裂解液［50 mmol/L羥乙基呱嗪乙硫磺酸（pH=7.5），150 mmol/L氯化鈉，2 mmol/L乙二胺四乙酸，2 mmol/L乙二醇雙2-氨基乙醚四乙酸，1%聚乙二醇辛基苯基醚，50 mmol/L氟化鈉，5 mmol/L焦磷酸鈉，50 mmol/L甘油磷酸鈉，使用前加入蛋白酶抑制劑Cocktail］重懸細(xì)胞后于4 ℃下混懸15 min，于4 ℃下以10000 r/min離心15 min，收集上清液。用BCA法測定上清液的蛋白濃度后，取40 μg總蛋白的上清液準(zhǔn)備樣品，以10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）膠分離，再經(jīng)電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PⅤDF）膜上。然后用5%脫脂牛奶封閉2 h后，洗膜緩沖液（tris-buffered saline Tween，TBST）洗膜3次，每次8 min，加一抗4 ℃溫育過夜，TBST洗膜3次，每次8 min；再加二抗溫育2 h，TBST洗膜3次，每次8 min，最后用電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）法顯影并記錄結(jié)果。

1.2.4 RTFQ-PCR

用1 mL/孔TRIzol裂解培養(yǎng)于6孔板中的細(xì)胞，并將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至Ependorf試管中，每管加入氯仿300 μL，渦旋振蕩15 s，冰置5 min，然后于4 ℃下以12000 r/min離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的Ependorf試管中，每管加入異丙醇300 μL，混勻。置冰上10 min，再于4 ℃下以12000 r/min離心10 min。棄去上清液，用75%乙醇（1‰焦碳酸二乙酯水配置）600 μL潤洗沉淀，于4 ℃下以12000 r/min離心10 min。在無菌臺內(nèi)待乙醇完全揮發(fā)，每管加入20 μL 1‰焦碳酸二乙酯水溶解沉淀。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將樣品中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以此單鏈cDNA為模板進(jìn)行RTFQ-PCR，反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR 10 μL，10×cDNA 1 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，去離子水8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。小鼠HDAC5上游引物序列：5’-CGCAACA AGGAGAAGAGCAAAG-3’；下游引物序列：5’-TCTCGGCTACCTTCTGTTTTAG-3’。小鼠β-actin上游引物序列：5’-AGAGGGAAATCGTG CGTGAC-3’；下游引物序列：5’-CAATAGTGA TGACCTGGCCGT-3’。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測4T1細(xì)胞遷移和侵襲

遷移實(shí)驗(yàn)：以不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸4T1細(xì)胞，計(jì)數(shù)4×104個細(xì)胞、體積150 μL加入transwell小室，并將小室置于加有800 μL含15%血清培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育24 h。將transwell小室取出，棄去小室內(nèi)培養(yǎng)基，用1×磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗滌3次，加入4%多聚甲醛溶液固定30 min，潤洗后加入800 μL結(jié)晶紫溶液染色30 min，再潤洗3次；用棉簽拭去小室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞，于倒置顯微鏡下觀察，并隨機(jī)選取3個視野、取圖保存。

侵襲實(shí)驗(yàn)：將50 μL Matrigel基質(zhì)膠原液用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶8稀釋后加入小室中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下靜置12 h待其凝固。然后收取不同濃度藥物處理的4T1細(xì)胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)4×104個細(xì)胞、體積150 μL緩慢加入transwell小室中，余下操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)

分別用含0.0、7.5 μmol/L SFN的RPMI-1640培養(yǎng)基（含1%小牛血清）培養(yǎng)vector組、HDAC5-OE組4T1細(xì)胞24 h，用200 μL移液器吸嘴在每孔中劃十字形劃痕，再以1×PBS洗滌2次；分別在0、6、12 h時用倒置顯微鏡觀察藥物對4T1細(xì)胞遷移能力的影響，拍照取圖。

1.2.7 HDAC5穩(wěn)定過表達(dá)4T1細(xì)胞系的建立

使用pcDNA(3.1+)-Flag-HDAC5質(zhì)粒及對照質(zhì)粒載體pcDNA(3.1+)-Flag轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞48 h，以400 μg/mL G418處理轉(zhuǎn)染后4T1細(xì)胞5 d，再更換為含200 μg/mL G418的RPMI-1640培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)3周。挑取單個克隆細(xì)胞放入24孔板并以含100 μg/mL G418的RPMI-1640培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)，然后采用Western blot鑒定穩(wěn)定過表達(dá)HDAC5的單克隆4T1細(xì)胞系。

1.2.8 動物實(shí)驗(yàn)

雌性7周齡SPF級BALB/c小鼠共24只，于SPF屏障動物實(shí)驗(yàn)中心內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。以隨機(jī)數(shù)字法將小鼠分為4T1/vector、4T1/vector+SFN、4T1/HDAC5-OE和4T1/HDAC5-OE+SFN 4組，每組6只。胰酶消化處理4T1/vector和4T1/HDAC5-OE細(xì)胞，以1000 r/min、室溫離心3 min收集細(xì)胞，冰預(yù)冷PBS重懸后細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2.5×106個/mL；用1 mL無菌注射器分別在每只小鼠皮下第二乳腺脂肪墊接種上述細(xì)胞懸液100 μL。5 d后觀察成瘤，并經(jīng)小鼠腹腔給藥，SFN劑量為30 mg/kg，對照組注射等體積的溶劑［50%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）水溶液］。每周持續(xù)給藥5 d，間隔2 d不給藥，共給藥4周。26 d后，用CO2法處死小鼠，對小鼠荷瘤部位脫毛后拍照，然后解剖小鼠取瘤進(jìn)行瘤組織稱重和拍照記錄。同時，取出小鼠心、肝、腎、肺拍照記錄并做H-E染色、免疫組織化學(xué)檢測。所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)三峽大學(xué)動物福利與倫理委員會審核并批準(zhǔn)。動物許可證號：SCXK（鄂）2017-0012；三峽大學(xué)動物福利與倫理審查編號：2020030M。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)組間比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFN對4T1細(xì)胞增殖的影響及細(xì)胞毒性評價

不同濃度SFN（0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μmol/L）處理4T1細(xì)胞24、48 h，以CCK-8法分析SFN對細(xì)胞增殖的影響，每組3個復(fù)孔。結(jié)果顯示，與0.0 μmol/L比較，2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μmol/L SFN對4T1細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用，細(xì)胞存活率呈濃度依賴性下降（圖2A）。經(jīng)Graphpad Prism 8.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，SFN處理4T1細(xì)胞的IC50（95% CI）值為：24 h組，32.19 μmol/L（19.66～52.68 μmol/L）；48 h組，17.60 μmol/L（10.59～29.28 μmol/L）。本課題組前期研究［20］表明，SFN可下調(diào)人乳腺癌MDAMB-231和MCF-7細(xì)胞中HDAC5的基因表達(dá)。為研究SFN抑制HDAC5表達(dá)對高侵襲性小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞增殖、遷移和EMT的影響，需選擇對4T1細(xì)胞無顯著細(xì)胞毒性的作用濃度。乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，與0.0 μmol/L比較，7.5、15.0 μmol/L SFN對4T1細(xì)胞均無顯著細(xì)胞毒性（圖2B，P>0.05）。由于7.5 μmol/L SFN顯著抑制4T1細(xì)胞增殖，選取該濃度SFN用于后續(xù)研究。

圖2 SFN對4T1細(xì)胞增殖的影響與細(xì)胞毒性作用Fig.2 The effects of SFN on 4T1 cell proliferation and toxicity

2.2 SFN對4T1細(xì)胞HDAC5、EMT相關(guān)分子表達(dá)和體外侵襲、遷移的影響

為觀察SFN對4T1細(xì)胞中HDAC5和EMT相關(guān)分子表達(dá)以及細(xì)胞侵襲、遷移的影響，在4T1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA-Flag-HDAC5及其載體pcDNA-Flag，24 h后以7.5 μmol/L SFN繼續(xù)處理24 h，然后收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測內(nèi)源性和外源性HDAC5的蛋白水平。結(jié)果表明，該濃度SFN能夠顯著下調(diào)4T1細(xì)胞中內(nèi)源性HDAC5的蛋白水平，但對外源性過表達(dá)的HDAC5蛋白水平無顯著影響；同時，SFN能夠顯著下調(diào)EMT相關(guān)分子vimentin、MMP-9、神經(jīng)鈣黏著蛋白（N-cadherin）的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，但HDAC5過表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)SFN對EMT相關(guān)分子表達(dá)的影響（圖3A）。進(jìn)一步以細(xì)胞劃痕、transwell和transwell-Matrigel實(shí)驗(yàn)分析該濃度SFN對4T1細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，7.5 μmol/L SFN處理24 h顯著抑制乳腺癌4T1細(xì)胞遷移（圖3B～3D）和侵襲（圖3E），且HDAC5過表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)SFN對乳腺癌4T1細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。

圖3 SFN抑制HDAC5表達(dá)對4T1細(xì)胞EMT相關(guān)分子表達(dá)和細(xì)胞侵襲、遷移的影響Fig.3 Effects of SFN-induced HDAC5 expression inhibition on the expression of EMT relative molecule and migration and invasion of 4T1 cells

2.3 HDAC5穩(wěn)定過表達(dá)4T1細(xì)胞系的鑒定

為觀察SFN處理及HDAC5過表達(dá)對4T1細(xì)胞體內(nèi)增殖和轉(zhuǎn)移的影響，使用pcDNA-Flag-HDAC5質(zhì)粒及對照質(zhì)粒載體pcDNA-Flag轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞結(jié)合G418篩選，通過Western blot鑒定穩(wěn)定過表達(dá)HDAC5的單克隆4T1細(xì)胞系4T1/HDAC5。結(jié)果表明，與對照細(xì)胞系相比，穩(wěn)定過表達(dá)HDAC5的4T1細(xì)胞系其HDAC5蛋白和mRNA水平顯著增加，且細(xì)胞組蛋白的總體H3K9乙?；斤@著下降（圖4）。

圖4 HDAC5穩(wěn)定高表達(dá)4T1細(xì)胞系鑒定Fig.4 The identification of HDAC5 stablely high-expressed 4T1 cell lines

2.4 SFN對移植瘤小鼠體內(nèi)4T1細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響

接種了4T1/HDAC5細(xì)胞及其對照細(xì)胞4T1/vector的BALB/c小鼠，分別接受SFN及其溶劑對照處理并觀察腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)增殖、遷移。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與4T1/vector細(xì)胞相比，4T1/HDAC5細(xì)胞接種小鼠體內(nèi)腫瘤的體積和平均重量顯著增加。兩組4T1/vector細(xì)胞移植瘤小鼠比較，SFN處理可顯著抑制腫瘤組織生長，SFN處理組小鼠剝離后的腫瘤體積和重量均顯著小于DMSO給藥組；但在兩組4T1/HDAC5細(xì)胞荷瘤小鼠中，與DMSO組相比，SFN處理對于腫瘤組織生長、腫瘤體積和重量均無顯著影響（圖5A～5C）。

圖5 SFN對小鼠體內(nèi)4T1細(xì)胞移植瘤增殖的影響Fig.5 Effects of SFN on proliferation of 4T1 cell transplanted tumor in mice

解剖小鼠，取雙肺拍照并作肺部組織H-E染色觀察腫瘤肺轉(zhuǎn)移，結(jié)果顯示，兩組4T1/vector荷瘤小鼠中，DMSO處理組小鼠雙肺均發(fā)現(xiàn)多個轉(zhuǎn)移瘤，而SFN處理組小鼠雙肺未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤；但兩組4T1/HDAC5-OE荷瘤小鼠雙肺均發(fā)現(xiàn)多個轉(zhuǎn)移瘤，且SFN處理對4T1/HDAC5-OE荷瘤小鼠的肺部腫瘤轉(zhuǎn)移無顯著影響（圖6A、6B）。Ki-67增殖指數(shù)可反映腫瘤細(xì)胞增殖能力。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果表明，SFN處理導(dǎo)致小鼠腫瘤組織中Ki-67增殖指數(shù)顯著下降，但4T1/HDAC5-OE組小鼠腫瘤組織和肺部轉(zhuǎn)移瘤組織中的Ki-67增殖指數(shù)無明顯變化，4T1/HDAC5-OE組小鼠腫瘤組織的Ki-67增殖指數(shù)較4T1/vector組顯著增高（圖6C～6F）。

圖6 HDAC5過表達(dá)對BALB/c荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移的影響Fig.6 The effects of HDAC5 over-expression on tumor metastasis in tumor-bearing BALB/c mice

2.5 SFN對4T1荷瘤小鼠的毒性作用

為評價SFN處理對實(shí)驗(yàn)小鼠的慢性毒性作用，本研究比較了實(shí)驗(yàn)期間各組荷瘤小鼠的體重變化，并在給藥完成后取各組小鼠的心、肝、腎組織進(jìn)行H-E染色，觀察其細(xì)胞和組織形態(tài)。小鼠體重變化和心、肝、腎的組織形態(tài)顯示，與對照組小鼠相比，SFN處理組小鼠的體重未出現(xiàn)顯著變化，心肌纖維紋路清晰，肝小葉、腎小球結(jié)構(gòu)清楚，未見細(xì)胞變性等病變引起的組織結(jié)構(gòu)異常（圖7）。

圖7 SFN對BALB/c荷瘤小鼠心肝腎的毒性影響Fig.7 Effect of SFN on heart,liver and kidney of tumor-bearing BALB/c mice

3 討 論

癌細(xì)胞遷移和侵襲是造成患者死亡的主要原因，因此尋找低毒、有效的藥物抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲是抗腫瘤研究的重點(diǎn)［21］。而乳腺癌病理學(xué)分型復(fù)雜，其中三陰性乳腺癌由于缺乏雌激素受體、孕激素受體和人類表皮生長因子受體2，對雌激素阻斷治療不敏感，且易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者5年生存率顯著低于其他類型乳腺癌［22］。因此，研究抗三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)及藥物具有重要的臨床意義。

EMT是上皮細(xì)胞逐步喪失上皮分子標(biāo)志和表型而呈現(xiàn)出間充質(zhì)細(xì)胞表型的過程，其分子機(jī)制為細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)分子通路激活使細(xì)胞獲得增殖、遷移和侵襲的能力［23］。EMT過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)下降至消失，同時間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白vimentin、N-cadherin的表達(dá)水平顯著增加［24-27］。本研究中，SFN處理顯著上調(diào)4T1細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)vimentin和N-cadherin的表達(dá)，并抑制4T1細(xì)胞侵襲和遷移。這一結(jié)果表明，SFN能夠抑制4T1細(xì)胞發(fā)生EMT，并由此抑制4T1細(xì)胞侵襲和遷移。盡管SFN能夠下調(diào)HDAC5基因轉(zhuǎn)錄，但外源性過表達(dá)的HDAC5基因由CMⅤ啟動子控制轉(zhuǎn)錄，而不受SFN抑制。使用SFN處理HDAC5穩(wěn)定過表達(dá)的4T1細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，外源性過表達(dá)HDAC5可部分逆轉(zhuǎn)SFN對EMT相關(guān)分子表達(dá)和對4T1細(xì)胞侵襲、遷移的抑制效應(yīng)，提示HDAC5在4T1細(xì)胞侵襲、遷移和EMT中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)也表明，SFN處理能夠顯著抑制4T1細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的增殖和肺轉(zhuǎn)移，但對HDAC5穩(wěn)定過表達(dá)的4T1細(xì)胞則無顯著抑制作用。上述結(jié)果表明，SFN能夠抑制4T1細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制與下調(diào)HDAC5表達(dá)和通過下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin、N-cadherin的表達(dá)、上調(diào)E-cadherin的表達(dá)并由此阻止4T1細(xì)胞的EMT過程有關(guān)。我們前期研究［13］表明，HDAC5能夠與LSD1協(xié)同促進(jìn)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展，而SFN能夠通過下調(diào)HDAC5表達(dá)，阻斷其與LSD1的協(xié)同作用，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)阻斷HDAC5與LSD1的協(xié)同作用，能夠顯著抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。SFN作為一種天然產(chǎn)物，安全性較好，不良反應(yīng)較輕，可作為腫瘤化療的輔助用藥［28-29］。

綜上所述，鑒于SFN具有下調(diào)4T1細(xì)胞中HDAC5表達(dá)、阻斷4T1細(xì)胞EMT和抑制其侵襲、遷移的作用，SFN有望用于抗乳腺癌轉(zhuǎn)移治療。本研究評價了HDAC5作為抗三陰性乳腺癌治療靶點(diǎn)和SFN用于抗三陰性乳腺癌治療的潛在價值，為抗三陰性乳腺癌研究提供了新思路。