浮床水芹不同生長階段水體活性物質(zhì)代謝組學(xué)分析

孫林鶴， 常雅軍， 韓士群， 崔 鍵， 劉曉靜， 姚東瑞*

1.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014 2.江蘇省水生植物資源與水環(huán)境修復(fù)工程研究中心， 江蘇 南京 210014 3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所， 江蘇 南京 210014

水芹屬傘形科、水芹屬，多年水生宿根草本植物，在我國分布廣泛，栽培種植以長江流域較為集中. 早在3 000多年前《詩經(jīng)·魯頌·泮水》中記載，水芹兼具豐富的營養(yǎng)價值與良好的藥用保健功能. 同時，水芹因其生物量大、養(yǎng)分需求量高、耐低溫、多次收割、易于管理等特點，被作為浮床植物的優(yōu)勢種廣泛應(yīng)用于污染水體的生物修復(fù)[1-5]. 水體富營養(yǎng)化是國際社會共同關(guān)注的水環(huán)境問題[6]. 生態(tài)浮床又稱生態(tài)浮島或人工浮床，具有可移動、易維護(hù)、相兼生物修復(fù)與景觀打造等特點，廣泛應(yīng)用于富營養(yǎng)化水體修復(fù)[4-5,7-8]. 生態(tài)浮床主要以水生植物為天然“凈化器”，采用無土栽培技術(shù)充分利用富營養(yǎng)化水體空間生態(tài)位和營養(yǎng)生態(tài)位，以植物同化吸收、根際微生物降解以及植物與微生物相互協(xié)同等機(jī)制削減氮磷等污染負(fù)荷，抑制藻類滋生，提高水體透明度，達(dá)到改善水生態(tài)環(huán)境目的[9-10].

代謝物主要指分子量小于 1 000 的有機(jī)化合物. 植物能合成超過20萬種代謝物，在植物生長發(fā)育、與環(huán)境互作以及環(huán)境適應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[11]. 通常水生植物的浮床應(yīng)用以挺水經(jīng)濟(jì)植物為主，其種植方式、營養(yǎng)鹽吸收、富集量、根際微生物、植物-微生物協(xié)同機(jī)制，以及浮床植物的資源化利用等已有大量研究[12-15]，但對浮床植物釋放于水體中的活性代謝產(chǎn)物研究較少. 然而，水生植物根系分泌物介導(dǎo)的根際效應(yīng)以及釋放至水體中的活性代謝產(chǎn)物，不僅影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)[16-19]，而且在調(diào)控水體微生物群落結(jié)構(gòu)與抑制水華藻類滋生與暴發(fā)等方面至關(guān)重要[20-22].

植物代謝組學(xué)是以高通量、高靈敏度現(xiàn)代分析儀器為硬件基礎(chǔ)，全面定性定量植物體內(nèi)或環(huán)境中代謝物并研究其變化規(guī)律的學(xué)科. 近年來，植物代謝組學(xué)發(fā)展迅速，其中非靶向代謝組學(xué)是無偏向性地分析樣品中盡可能廣泛的代謝產(chǎn)物，已在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[22]，但在水環(huán)境生態(tài)修復(fù)領(lǐng)域應(yīng)用較少. 這不利于深入認(rèn)識浮床植物在修復(fù)和維持水生態(tài)系統(tǒng)中的作用，也不利于新型高效、安全生態(tài)的生物抑藻劑開發(fā). 為此，該研究基于水芹作為浮床優(yōu)勢種的廣泛應(yīng)用與其食用藥用價值，對浮床水芹無土莖端繁殖及其幼苗期、成熟期種植水中活性代謝物進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)檢測，挖掘不同階段種植水中代謝物種類、相對含量、主要代謝物和顯著差異代謝物，分析各代謝物在與環(huán)境微生物互作、化感抑藻功能發(fā)揮以及耐低溫等過程中的作用潛力. 研究結(jié)果不僅對水芹修復(fù)機(jī)制的深度挖掘與水芹抑藻劑的開發(fā)具有重要意義，也可為其他挺水經(jīng)濟(jì)植物的浮床應(yīng)用與資源化開發(fā)利用提供新思路.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1植物材料

于2019年11月12日，將生態(tài)浮床水芹處于莖端繁殖期、幼苗期和成熟期的3階段植物取回，稱取鮮質(zhì)量約150 g植物樣本，用超純水清洗表面附著物，迅速置于1 L的超純水中，各階段樣品3個重復(fù)處理，其中莖端繁殖期的匍匐莖直接放入水體，而幼苗期和成熟期種苗將根部置于水體，一周后取出水樣，立即進(jìn)行活性代謝物質(zhì)檢測. 為更好地反映水芹浮床實際應(yīng)用時生長水體中的活性代謝物情況，水培試驗環(huán)境為此時期南京市自然環(huán)境條件.

1.1.2質(zhì)控樣本

選擇3個不同發(fā)育時期樣本等量混合制備質(zhì)控樣本(quality control, QC)，與待測樣本同時檢測分析，以確保整個檢測過程中系統(tǒng)穩(wěn)定和數(shù)據(jù)可靠[23].

1.1.3主要儀器與試劑

主要儀器：臺式快速離心濃縮干燥器(Alpha1-4, 德國Christ公司)；氮?dú)獯祾邇x(Reacti-Thermo, 美國Thermo公司)；超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography,UltiMate 3000, 美國Thermo公司)；質(zhì)譜儀(Q Exactive, 美國Thermo公司).

主要試劑：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid Chromatography Mass Spectrometry, LC-MS)甲醇(美國Fisher Chemical公司)；LC-MS乙腈(美國Fisher Chemical公司)；LC-MS甲酸(美國Fisher Chemical公司)；LC-MS水(美國Fisher Chemical公司)；氯仿(國藥集團(tuán))；異丙醇(美國Fisher Chemical公司)；固相萃取柱(Sep-Pak C18 1 cc Vac Cartridge, 100 mg Sorbent, 美國Waters公司).

1.2 試驗方法

1.2.1樣本處理

將水樣均分為45 mL后冷凍干燥；加入500 μL甲醇水溶液〔甲醇∶水(體積比)為7∶3，含有0.1%甲酸〕復(fù)溶；4 ℃下 12 000 r/min離心10 min，取上清轉(zhuǎn)移到色譜瓶中上機(jī).

1.2.2LC-MS檢測

該試驗采用液相色譜-電噴霧離子源-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry, LC-ESI-MS)分析方法[24]，對樣品中化合物進(jìn)行檢測. 為確保檢測過程中系統(tǒng)穩(wěn)定和數(shù)據(jù)可靠，對各樣品檢測2次，具體分析條件和分析方法如下.

色譜系統(tǒng)采用Thermo DGLC雙三元超高效液相系統(tǒng). 根據(jù)化合物的性質(zhì)，分別采用Waters BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)和Waters BEH Amide (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)液相色譜柱進(jìn)行分離，進(jìn)樣量為2 μL. 反相色譜條件為流動相A (0.1%甲酸-水溶液)和流動相B (0.1%甲酸-乙腈)，流速為0.30 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為40 ℃. 正相色譜條件為流動相A (100 mmol/L NHAC-水溶液)和流動相B (乙腈)，流速為0.30 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為40 ℃[25-26].

質(zhì)譜系統(tǒng)采用美國Thermo公司的Q exactive高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，配有ESI和Xcalibur工作站. 采用ESI，處理好的樣品在正負(fù)離子同時掃描下，以全掃描檢測模式進(jìn)行分析，最大程度地檢測可能的化合物[27-28]. 優(yōu)化的質(zhì)譜分析條件為鞘氣40 arb、輔助氣10 arb、離子噴霧電壓+3 000 V (-2 800 V)、溫度350 ℃、離子傳輸管溫度320 ℃.

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件CD3.0進(jìn)行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊，最終得到一個保留時間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣. 將MS和MS/MS質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配. 主要數(shù)據(jù)庫為mzCloud (https://www.mzcloud.org)[29]等公共數(shù)據(jù)庫以及自建的數(shù)據(jù)庫.

利用SIMCA-P+14.0軟件包(Umetrics, Ume?, Sweden)和R語言對數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA) (利用procomp函數(shù)計算)、(正交)偏最小二乘法分析和相關(guān)性分析. 利用R語言中g(shù)gplot2、corrplot、pheatmap包對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化[30].

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制分析

質(zhì)量控制是獲得可靠且高質(zhì)量代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ). 樣品經(jīng)色譜分離流出的組分不斷進(jìn)入質(zhì)譜連續(xù)掃描，每次掃描得到1張質(zhì)譜圖，將每張質(zhì)譜圖中所有離子強(qiáng)度相加，得到總離子流強(qiáng)度. 然后以時間為橫坐標(biāo)、離子強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制總離子色譜(total ion current, TIC)圖(見圖1). 從圖1可以看出：采用Waters BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)液相色譜柱的樣品正、負(fù)模式TIC圖峰形良好，分布相對均勻；采用Waters BEH Amide (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)液相色譜柱的樣品正、負(fù)模式TIC圖峰分離度高，峰形良好.

采用PCA分析觀測各樣品之間的總體分布和組間的離散程度(見圖2)[31]評價QC重復(fù)性，結(jié)果顯示QC聚合度較高，說明該試驗重復(fù)性好、分析系統(tǒng)穩(wěn)定、獲得數(shù)據(jù)可靠，能為該研究提供有效參數(shù).

2.2 不同階段浮床水芹種植水中活性代謝物偏好性分析

對不同生長階段的水芹種植水進(jìn)行LC-ESI-MS檢測，共得到306種代謝物的相對含量. 為明確浮床水芹不同生長階段種植水中代謝物的偏好性差異，以不同樣本各代謝物相對含量為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，利用R語言procomp函數(shù)并以scale=TRUE為參數(shù)進(jìn)行PCA分析(見圖2)，結(jié)果顯示PC1和PC2分別可解釋28.42%和23.45%的方差變異，說明該模型能夠較好地解釋樣本間代謝物差異[30]. 圖2中箭頭代表各代謝物的載荷向量，由圖2可知，繁殖期、幼苗期和成熟期種植水中代謝物的種類與含量具有明顯偏好性差異. 利用R語言scale函數(shù)對所有樣本代謝物含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，可顯示不同樣本中各代謝物含量差異，并利用R包pheatmap對標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類并繪制熱圖(見圖3)，相對含量大小與變化趨勢見圖3右上方顏色標(biāo)尺的數(shù)值標(biāo)注，數(shù)值越大顏色越紅，表明代謝物在該樣品中的相對含量越高. 左側(cè)聚類樹狀圖的分支距離越近，表明所分析代謝物相對含量變化趨勢越接近. 由圖3可知，不同階段種植水中相對含量較高的代謝物聚類差異顯著，說明不同時期浮床水芹釋放至種植水中的活性代謝產(chǎn)物存在明顯偏好性差異.

2.3 不同階段浮床水芹種植水中主要代謝物篩選及統(tǒng)計分析

對已發(fā)現(xiàn)的306種代謝物進(jìn)行主要代謝物與含量占比統(tǒng)計，以占比大于1%的代謝物為主要代謝物種類進(jìn)行篩選分析. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處于繁殖期、幼苗期和成熟期種植水中的主要代謝物分別有23、21和19種，共計29種，其中各階段共有主要代謝物13種(見表1)，包括甜菜堿(Betaine)、異氟爾酮(Isophorone)、肉豆蔻酸甲酯(Ethyl myristate)、硬脂酸(Stearic acid)、芥酸酰胺(Erucamide)等. 繁殖期有4種特異的主要代謝物，即膽堿(Choline)、油酰胺(Oleamide)、2-嗎啉代苯基-2-糠酸酯(2-morpholinophenyl 2-furoate)、N4-{4-[1-氰基-2-(2-吡啶基)乙烯基]苯基}-5-甲基-3-苯基異惡唑-4-羧酰胺(N4-{4-[1-cyano-2-(2-pyridyl)vinyl]phenyl}-5-methyl-3-phenylisoxazole-4-carboxamide). 幼苗期有3種特異性主要代謝物，即鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate)、D-(-)-奎寧酸〔D-(-)-Quinic acid〕、N-(2-苯并咪唑基)-氨基甲酸甲酯(Carbendazim). 成熟期有1種特異性主要代謝物，即4-胍基丁酸(4-Guanidinobutyric acid).

表1 水芹三階段種植水中主要代謝物種類與占比大小

注： 每個方塊代表一個樣品中某一代謝物的含量，顏色越紅代表含量越高，顏色越藍(lán)代表含量越低；各時期1～3為3個生物學(xué)重復(fù)，A～B為2個技術(shù)重復(fù).圖3 不同時期水芹種植水中各代謝物含量熱圖Fig.3 Heatmap of metabolites contents in different stages of water dropwort

注： 左縱坐標(biāo)軸及下橫坐標(biāo)軸刻度為樣本對應(yīng)刻度；右縱坐標(biāo)軸及上橫坐標(biāo)軸刻度為載荷向量對應(yīng)刻度.圖2 代謝物含量的主成分分析示意Fig.2 Principe components analysis diagram of metabolites contents

除3個階段共有代謝產(chǎn)物外，十六酰胺(Hexadecanamide)、胸腺嘧啶(Thymidine)和尿嘧啶(Uridine)為繁殖期與幼苗期共有的3種主要代謝物；DL-肉堿(DL-Carnitine)、去檳榔堿(Guvacoline)和三乙醇胺(Triethanolamine)為繁殖期與成熟期共有的3種主要代謝物；2-氧雜四環(huán)素[6.3.1.1～6,10～0～1,5～]十三烷-3-酮(2-oxa-4-azatetracyclo[6.3.1.1～6,10～0～1,5～]tridecan-3-one)和1-(4-溴苯基)-2-苯基乙烷-1-酮〔1-(4-bromophenyl)-2-phenylethan-1-one〕為幼苗期與成熟期共有的主要代謝物.

2.4 不同階段浮床水芹種植水中顯著性差異代謝物篩選及分析

單變量統(tǒng)計分析利用R語言t.test函數(shù)對不同的樣本間代謝物相對含量進(jìn)行T檢驗，并計算差異倍數(shù)(fold change, FC). 以FC>2(|log2FC|>1)、P<0.05(-lgP>1.30)為單變量統(tǒng)計顯著差異代謝產(chǎn)物篩選標(biāo)準(zhǔn)，利用ggplot2包繪制火山圖(見圖4)，直觀地顯示兩兩樣本之間的代謝物相對含量變化的顯著差異.

多元統(tǒng)計分析利用(正交)偏最小二乘法分析〔(orthogonal) partial least squares discrimination analysis，(O)PLS-DA〕區(qū)分各組間代謝輪廓總體差異，變量權(quán)重值(variable important in projection, VIP)大于1的變量為差異變量. 綜合單變量統(tǒng)計分析中在繁殖期、幼苗期和成熟期種植水中均存在顯著差異的代謝物有5種，分別為硬脂酸、D-(-)-奎寧酸、3-甲氧基苯乙酸(3-Methoxyphenylacetic acid)、2-嗎啉代苯基-2-糠酸酯和2,2,6,6-四甲基-4-哌啶醇(2,2,6,6-Tetramethyl-4-piperidinol). 其中，硬脂酸和2,2,6,6-四甲基-4-哌啶醇在三階段種植水中均為主要代謝物，而D-(-)-奎寧酸為幼苗期主要代謝物，2-嗎啉代苯基-2-糠酸酯為繁殖期主要代謝物，3-甲氧基苯乙酸在各時期均不是主要代謝物.

注： 橫虛線以上為P<0.05(-lg P>1.30)，豎虛線兩側(cè)為FC>2(|log2 FC|>1). 圖4 單變量統(tǒng)計分析火山圖Fig.4 Volcano plot of univariate statistical analysis

T檢驗P值小于0.05的代謝物定義為差異代謝物，共發(fā)現(xiàn)112種代謝物在不同時期種植水中存在顯著差異. 表2～4列舉了3個階段浮床水芹種植水兩兩樣本間的差異代謝產(chǎn)物，其中繁殖期與幼苗期間、繁殖期與成熟期間均有35種代謝物含量存在差異，而幼苗期和成熟期間有80種代謝物的含量存在顯著差異.

表2 繁殖期與幼苗期兩階段間水芹種植水中存在顯著性差異的代謝物統(tǒng)計

表3 繁殖期與成熟期兩階段間水芹種植水中存在顯著性差異的代謝物統(tǒng)計

表4 幼苗期與成熟期兩階段間水芹種植水中存在顯著性差異的代謝物統(tǒng)計

續(xù)表4

2.5 浮床水芹種植水活性代謝物質(zhì)與環(huán)境修復(fù)功能間的關(guān)聯(lián)分析

如前所述，植物釋放至水體中的活性代謝產(chǎn)物，主要影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)、植物-根際微生物互作效應(yīng)及化感抑制水華藻類的暴發(fā)[14,17-18]. 分析該研究發(fā)現(xiàn)的306種代謝物，發(fā)現(xiàn)與植物-根際微生物互作相關(guān)的代謝物有10種[17,32-33]，包括胸腺嘧啶、胞嘧啶(Cytidine)、D-(-)-奎寧酸、膽堿、水楊酸、煙酸 (Nicotinic acid)、脯氨酰亮氨酸(Prolylleucine)、亮氨酸脯氨酸(Leucylproline)、油酰胺和芥酸酰胺；與植物化感作用相關(guān)的代謝物有13種[34]，包括棕櫚油酸(Palmitoleic acid)、硬脂酸、肉豆蔻酸(Myristic acid)、DL-乳酸(DL-Lactic Acid)、壬二酸(Azelaic acid)、3-羥基丁酸(3-Hydroxybutyric acid)、癸酸(Decanoic acid)、咖啡酸(Caffeic acid)、阿魏酸(Ferulic acid)、水楊酸(Salicylic acid)、兒茶酚(Catechol)、苯甲酸(Benzoic acid)和3,5-二羥基苯甲酸(3,5-Dihydroxybenzoic acid). 這23種環(huán)境修復(fù)相關(guān)代謝物相對含量如圖5所示(經(jīng)lg函數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化)，癸酸、3-羥基丁酸、胞嘧啶、3,5-二羥基甲苯酸在各階段種植水中含量相對較少，而硬脂酸、胸腺嘧啶、D-(-)-奎寧酸、膽堿、油酰胺和芥酸酰胺這6種代謝物至少在1個時期為主要代謝物，其中硬脂酸和芥酸酰胺在3階段均為主要代謝物.

注： 每個方塊代表一個樣品中某一代謝物的含量，顏色越紅代表含量越高，顏色越藍(lán)代表含量越低； 各時期1～3為3個生物學(xué)重復(fù)，A～B為2個技術(shù)重復(fù).圖5 環(huán)境修復(fù)相關(guān)代謝物含量熱圖Fig.5 Heatmap of environmental remediation related metabolites

將上述23種環(huán)境修復(fù)相關(guān)代謝物相對含量進(jìn)行差異性分析，發(fā)現(xiàn)其中13種具有含量差異，即硬脂酸、壬二酸、3-羥基丁酸、癸酸、咖啡酸、阿魏酸、水楊酸、兒茶酚、苯甲酸、3,5-二羥基苯甲酸、胸腺嘧啶、D-(-)-奎寧酸、棕櫚油酸. 相關(guān)性分析(見圖6)發(fā)現(xiàn)，壬二酸、肉豆蔻酸、兒茶酚、3,5-二羥基苯甲酸、阿魏酸、水楊酸、D-(-)-奎寧酸、硬脂酸、咖啡酸和苯甲酸之間具有高相關(guān)性(r>0.6,P<0.01)，其中除D-(-)-奎寧酸外均為有機(jī)酸和酚類化感物質(zhì). 說明浮床水芹可能趨向于同時合成并釋放以上9種化感物質(zhì). 此外，胞嘧啶與上述化感物質(zhì)均呈顯著負(fù)相關(guān)(r<-0.7,P<0.001)，說明水芹體內(nèi)胞嘧啶合成與有機(jī)酸和酚類化感物質(zhì)合成具有一定的拮抗作用.

注： 圖中圓點代表兩個代謝物間的相關(guān)性系數(shù)，顏色越深、圓點越大代表相關(guān)性系數(shù)越高，藍(lán)色代表正相關(guān)，紅色代表負(fù)相關(guān)；空白代表兩個代謝物相關(guān)性分析結(jié)果不顯著(P>0.05).圖6 環(huán)境修復(fù)相關(guān)代謝物相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of environmental remediation related metabolites

3 討論

隨著代謝組學(xué)的快速發(fā)展，利用非靶向代謝組學(xué)手段研究浮床植物修復(fù)環(huán)境機(jī)制，有助于深度挖掘根系分泌物介導(dǎo)的植物-根際微生物效應(yīng)互作機(jī)制和新型高效的生物抑藻劑的開發(fā).

3.1 生態(tài)浮床水芹活性代謝物開發(fā)利用潛力

該研究采用LC-ESI-MS分析平臺對生態(tài)浮床水芹繁殖期、幼苗期和成熟期種植水中的活性代謝物進(jìn)行無靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了306種次生代謝產(chǎn)物，并通過單變量統(tǒng)計分析和OPLS-DA分析得到112個差異代謝物. 說明基于無土栽培技術(shù)應(yīng)用水芹生態(tài)浮床時，種植水體中存在種類豐富的活性代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)可能在浮床水芹與其根際微生物協(xié)同修復(fù)效應(yīng)中發(fā)揮重要作用，也是抑制富營養(yǎng)化水體滋生藍(lán)藻的重要原因，具有很大的開發(fā)應(yīng)用潛力. 值得注意的是，各發(fā)育階段浮床水芹種植水中存在多種共有主要代謝物(見表1)，說明甜菜堿、異氟爾酮、肉豆蔻酸甲酯、硬脂酸、芥酸酰胺等13種代謝物在種植水中的含量與浮床水芹發(fā)育階段相關(guān)性較低. 其中硬脂酸和芥酸酰胺不僅在水芹各生長時期均具有較高含量，也是參與環(huán)境修復(fù)過程的重要代謝物[32-34]，在水芹體內(nèi)分離提取以硬脂酸、芥酸酰胺為主的活性代謝物環(huán)境修復(fù)試劑，取材可忽略發(fā)育階段的影響. 而膽堿和油酰胺為莖端繁殖期特有主要代謝物，提取酰胺類代謝物應(yīng)選取莖端繁殖期水芹. 此外，壬二酸、肉豆蔻酸、兒茶酚、3,5-二羥基苯甲酸、阿魏酸、水楊酸、硬脂酸、咖啡酸和苯甲酸等9種重要酚類均與脂肪酸類化感物質(zhì)含量顯著相關(guān)，均在幼苗期含量最高(見圖5、6)，因此提取制備酚類和脂肪酸類混合成分抑藻劑應(yīng)選取幼苗期水芹.

3.2 水芹種植水中促進(jìn)水芹-根際微生物協(xié)同效應(yīng)的功能代謝物

水生植物與根系微生物間的協(xié)同效應(yīng)在富營養(yǎng)化水體氮磷等營養(yǎng)鹽的消減過程中起重要作用[18]. 一方面，無土栽培技術(shù)的浮床水生植物具有龐大的根系，能為功能微生物提供生長附著場所和營養(yǎng)物質(zhì)，形成根區(qū)“厭氧-兼氧-好氧”微環(huán)境助力硝化、反硝化以及厭氧氨氧化等脫氮微生物的生長繁殖與同步驅(qū)動[35-38]; 另一方面，根際微生物通過對污染物的轉(zhuǎn)化與降解，以及通過根系分泌物改變根際環(huán)境的pH與氧化還原電位等直接或間接促進(jìn)植物對營養(yǎng)元素的吸收利用[39-40]. 多種代謝物與植物和微生物互作過程密切相關(guān)，如豆科植物根系分泌異黃酮類代謝物是豆科植物與根瘤菌的特異性互作的關(guān)鍵[41]；植物根系分泌的氨基酸和碳水化合物也能夠為根際微生物提供生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)[32]；Zhalnina等[33]結(jié)合代謝組學(xué)、宏基因組學(xué)技術(shù)，在燕麥屬植物Avenabarbata根系分泌物中發(fā)現(xiàn)13種在植物與根際微生物互作過程中起積極作用的代謝物. 另外，浮萍根系能夠通過分泌芥酸酰胺、油酰胺等酰胺類代謝物富集假單胞桿菌屬(Pseudomonasputida)并促進(jìn)水體中氮的削減[17]. 水芹種植水中存在至少8種已證實在植物與微生物互作過程中起積極作用的代謝物，分別為D-(-)-奎寧酸、膽堿、水楊酸、煙酸、脯氨酰亮氨酸、亮氨酸脯氨酸、油酰胺和芥酸酰胺，其中芥酸酰胺在水芹各時期種植水中均為主要代謝物，含量占比均在2%左右且差異不顯著. 說明浮床水芹具有持續(xù)向水體分泌芥酸酰胺的能力，推測其在水芹適應(yīng)外界環(huán)境和生態(tài)修復(fù)中起重要作用，有待進(jìn)一步研究.

3.3 水芹種植水中化感抑藻功能代謝物作用潛力

水生植物通過釋放化感物質(zhì)以抑制藻類生長被認(rèn)為是其獲得競爭優(yōu)勢并保持水體清澈的重要機(jī)制之一[34,42]. 非靶標(biāo)代謝組學(xué)能盡可能廣泛的檢測分析樣品中的代謝產(chǎn)物，是研究植物化感作用的重要手段之一. Ho等[43]利用非靶向代謝組學(xué)研究，從水稻的甲醇浸提物中鑒定出20種化感作用代謝物；Misra等[44]利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究了化感作用物質(zhì)對小麥體內(nèi)代謝物的影響；Song等[45]利用代謝組學(xué)手段發(fā)現(xiàn)，銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)通過亞油酸和一氧化氮互作途徑抑制小球藻(Chlorellavulgaris). 該研究得出水芹種植水中具有多種化感作用代謝物，如硬脂酸、肉豆蔻酸、壬二酸代等13種，其中硬脂酸已經(jīng)在狐尾藻和苦草等沉水植物水培液中檢出，并被證明對銅綠微囊藻等藻類有顯著的抑制所用；而肉豆蔻酸能夠在黑藻水培液中被檢出[46]. 壬二酸首次在紅樹根分泌物中檢測到，能促使海洋原甲藻(Prorocentrummicans)細(xì)胞裂解，降低其光合作用效率，顯著抑制其生長[47]； 同時，植物的化感作用大多可能是由多種化感作用物質(zhì)互作的結(jié)果[48]. 如對-羥基苯甲酸(P-Hydroxybenzoic Acid)、香草醛(Vanillin)、阿魏酸3種酚酸類化感物質(zhì)單獨(dú)處理棉花幼苗均具有顯著抑制作用，但是2種或2種以上化感物質(zhì)混合化感作用效果降低[49]. 楊小燕等[50]卻發(fā)現(xiàn)，苯甲酸型混合酚酸對萵苣根長的抑制率顯著高于單一酚的抑制作用. 含量差異代謝物相關(guān)性分析結(jié)果表明，壬二酸、肉豆蔻酸、兒茶酚、3,5-二羥基苯甲酸、阿魏酸、水楊酸、硬脂酸、咖啡酸和苯甲酸兩兩含量之間均呈顯著相關(guān)，且在水芹幼苗期含量最高. 由此可推測，浮床水芹對水華藍(lán)藻的抑制效應(yīng)可能是以上正相關(guān)化感作用物質(zhì)共同作用的效果，幼苗期水芹更適于水芹提取物抑藻劑開發(fā). 然而，這些代謝物間的相互作用機(jī)制及其如何配比可實現(xiàn)化感抑藻效應(yīng)最大化，還需進(jìn)一步研究.

3.4 甜菜堿可能在水芹耐低溫適應(yīng)中起重要作用

植物抗寒能力是富營養(yǎng)水體環(huán)境修復(fù)型植物選擇的重要指標(biāo)，很多植物在冬季枯萎凋落至水體中對環(huán)境形成二次污染[51]. 該研究所利用的四季水芹具有優(yōu)異的抗寒性，四季常綠，初冬生長較春秋季節(jié)緩慢，但是寒冬能夠在冰下存活，有效避免了浮床植物修復(fù)產(chǎn)生的二次污染問題，降低了管理成本[5]. 植物抵御低溫脅迫是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，是植物體內(nèi)生物膜結(jié)構(gòu)變化、低溫相關(guān)蛋白表達(dá)、抗氧化酶活性升高和保護(hù)性代謝物積累等多種因素共同作用的結(jié)果[52-54]，其中脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿是重要的保護(hù)代謝物. 對代謝物含量進(jìn)行初步分析發(fā)現(xiàn)，水芹種植水中雖未檢測到脯氨酸和可溶性糖的存在，而甜菜堿在所有水芹生長時期的種植水中的含量均超過總代謝物含量的1%. 利用外源甜菜堿處理紫花苜蓿(MedicagosativaL.)能夠有增強(qiáng)苜蓿幼苗的抗寒性，并增加可溶性糖和游離脯氨酸的含量，顯著提高抗氧化酶活性以及非酶抗氧化物質(zhì)含量[55]. 水芹種植水中甜菜堿的積累，可能同樣在水芹抗寒過程和越冬特性中起到重要作用.

4 結(jié)論

a) 對繁殖期、幼苗期和成熟期3個不同生長階段的水芹種植水進(jìn)行LC-ESI-MS檢測，共檢測出306種代謝物. 13種代謝物在各時期種植水中的相對含量均超過1%，其中包括甜菜堿、硬脂酸和芥酸酰胺等參與植物抗凍、化感作用和富營養(yǎng)化水體修復(fù)過程的重要代謝物. 不同時期浮床水芹釋放至種植水中的活性代謝產(chǎn)物存在明顯偏好性差異. 繁殖期與幼苗期間、繁殖期與成熟期間均有35種代謝物含量存在顯著差異，而幼苗期和成熟期間有80種代謝物含量存在顯著差異.

b) 水芹種植水中含有至少23種與水環(huán)境修復(fù)密切相關(guān)代謝物. 其中與植物-根際微生物互作相關(guān)的代謝物有10種，包括胸腺嘧啶、胞嘧啶、D-(-)-奎寧酸、膽堿、水楊酸、煙酸、脯氨酰亮氨酸、亮氨酸脯氨酸、油酰胺和芥酸酰胺；含有與植物化感作用相關(guān)的代謝物有13種，包括棕櫚油酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、DL-乳酸、壬二酸、3-羥基丁酸、癸酸、咖啡酸、阿魏酸、水楊酸、兒茶酚、苯甲酸和3,5-二羥基苯甲酸. 硬脂酸和芥酸酰胺2個環(huán)境修復(fù)相關(guān)代謝物在3個不同生長階段水芹種植水中均為主要代謝物.

c) 水芹種植水中，壬二酸、肉豆蔻酸、兒茶酚、3,5-二羥基苯甲酸、阿魏酸、水楊酸、硬脂酸、咖啡酸和苯甲酸等9種有機(jī)酸含量均與酚類化感物質(zhì)含量呈顯著相關(guān)，且在水芹幼苗期含量最高，表明有機(jī)酸和酚類化感物質(zhì)間可能存在協(xié)同作用，幼苗期水芹更適于水芹提取物抑藻劑開發(fā). 與此同時，分析發(fā)現(xiàn)水芹種植中甜菜堿的積累，可能在水芹抗寒越冬過程中起到重要作用.