微生物降解典型高分子量多環(huán)芳烴的研究進展

吳潔婷， 許 琪， 張 營， 趙 磊， 陳忠林， 于英潭， 于 暢， 許海萍， 馬 放*

1.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院， 遼寧 沈陽 110036 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)， 城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室， 黑龍江 哈爾濱 150090 3.營口市大石橋生態(tài)環(huán)境分局， 遼寧 營口 115100

高分子量多環(huán)芳烴 (high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons，HMW-PAHs)是指具有4個或更多苯環(huán)的多環(huán)芳烴，其為具有致突變性、致癌性和致畸性的持久性污染物，自然條件下不易降解，可以廣泛分布在不同的環(huán)境介質(zhì)中，如水、土壤和大氣[1-2]. 多環(huán)芳烴通過大氣粉塵沉降、污水排放、地表徑流、土壤徑流等形式進入河流，并對水質(zhì)產(chǎn)生不利影響. Yu等[2]研究表明，多環(huán)芳烴在我國地表水中普遍存在，并且各流域苯并[a]芘的濃度均超過GB 3838—2002《地表水環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)》中的規(guī)定值(2.8 ng/L)，這表明我國河流流域多環(huán)芳烴的健康風(fēng)險普遍較高. 一般來說，土壤是PAHs停留的最終介質(zhì)[3]，西班牙2005年9號皇家法令(RD 9/2005)根據(jù)毒性參數(shù)制定的基于污染物的土壤篩選等級(Risk-Based Soil Screening Levels，RBSSL)中，對既不是城市也不是工業(yè)的“其他用途(other uses)”類土壤中苯并[a]芘的規(guī)定濃度為0.02 mg/kg；而Boente等[4]研究表明，過渡煤區(qū)土壤中的PAHs以HMW-PAHs為主，其中苯并[a]芘的含量為0.24 mg/kg，超過規(guī)定限值的10倍，對當(dāng)?shù)丨h(huán)境安全造成了嚴(yán)重威脅. 大氣顆粒物中的PAHs絕大部分來源于人為排放[5]. Iakovides等[6]研究了城市大氣PM2.5中多環(huán)芳烴的含量，結(jié)果表明，所有多環(huán)芳烴的終生癌癥風(fēng)險預(yù)測值約為美國環(huán)境保護局(US EPA)預(yù)測數(shù)值的7倍，城市大氣環(huán)境中的PAHs對人類健康造成巨大威脅.

環(huán)境中的HMW-PAHs可以通過揮發(fā)、光氧化、化學(xué)氧化、生物降解等多種途徑被降解[7-9]. 在眾多降解方式中，微生物降解可以將有害HMW-PAHs分解或轉(zhuǎn)化成危害較小或無毒的化合物，具有更好的安全性和對環(huán)境的最小干擾性[10-11]. 目前，微生物修復(fù)技術(shù)已成功地應(yīng)用于對HMW-PAHs降解的相關(guān)研究，該文以芘和苯并[a]芘2種典型HMW-PAHs為例，綜述了微生物對其進行降解過程中的影響因素，介紹了促進降解的強化方式，對芘和苯并[a]芘在降解過程中的鄰苯二甲酸和低環(huán)降解等途徑進行了總結(jié)，進一步闡述主要降解酶對微生物降解芘和苯并[a]芘過程的調(diào)控機制，最后對目前HMW-PAHs研究中存在的瓶頸問題進行總結(jié)及對未來研究方向進行展望，以期為微生物降解HMW-PAHs的相關(guān)研究提供參考.

1 HMW-PAHs的組成、結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

早在20世紀(jì)80年代初，US EPA就將16種未帶分支的PAHs確定為環(huán)境中優(yōu)先檢測的污染物，包含10種HMW-PAHs[6]，其具體結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)見表1[12-14]. 土壤中具有2～3個苯環(huán)的低分子量多環(huán)芳烴(low molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons，LMW-PAHs)的半衰期為5.7年，HMW-PAHs則長達9.1年，因此HMW-PAHs通常情況下比LMW-PAHs更難被去除[15-16]；并且與LMW-PAHs相比，HMW-PAHs對人體具有更高的基因毒性[17]. 在HMW-PAHs中，芘是一種結(jié)構(gòu)對稱的無色或黃色的晶體狀固體4環(huán)芳烴，通常存在于空氣、水和土壤中，性質(zhì)穩(wěn)定，不易被降解，長期以來被定義為HMW-PAHs研究的模型化合物. 近年來，針對芘微生物降解而進行的相關(guān)研究愈發(fā)緊密. Vasconcelos等[18]研究了Tolypocladiumsp. CBMAI 1346對芘的降解及其機制，證實了海洋源真菌修復(fù)PAHs環(huán)境污染的潛力；Agrawal等[19]發(fā)現(xiàn)新型真菌菌株Coriolopsisbyrsinasp. APC5對芘的降解率達到51.85%，意味著該菌株可以作為環(huán)境污染修復(fù)的潛力菌株. Zeng等[20]則通過在分離步驟中用菲代替芘的方式建立了一種改良的分離芘降解菌株的方法.

表1 美國環(huán)境保護局列為優(yōu)先污染物的HMW-PAHs的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)[12-14]

除此之外，苯并[a]芘也因其對哺乳動物和水生生物的誘導(dǎo)突變、致畸和致癌作用而被作為一種典型的HMW-PAHs備受關(guān)注[18]. Guo等[21]研究證明，生物表面活性劑能夠促進水體和土壤中苯并[a]芘的生物降解，可有效用于多環(huán)芳烴污染的水和土壤的現(xiàn)場修復(fù)，進而解決苯并[a]芘由于水溶性較差導(dǎo)致的其在土壤和水中的生物降解效率低下的問題. Bhatt等[22]對枯草芽孢桿菌BMT4i(MTCC 9447)降解苯并[a]芘的途徑進行了探索并提出了在降解過程中存在多種途徑的設(shè)想. Lu等[23]的研究揭示了蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)在細胞色素P450羥化酶的催化下對苯并[a]芘的降解的代謝網(wǎng)絡(luò)，為HMW-PAHs的生物轉(zhuǎn)化調(diào)控提供了參考.

2 微生物降解過程中的影響因素

2.1 溫度

溫度可影響微生物對HMW-PAHs的降解[24-25]. 一方面，當(dāng)溫度升高時，多環(huán)芳烴的溶解度增加，從而提高了其生物利用度; 另一方面，HMW-PAHs的微生物降解一般由雙加氧酶催化進行，而過高的溫度會抑制微生物中酶的降解活性[12,26](見圖1). Wang等[27]研究表明，OchrobactrumMB-2在25 ℃時對芘的降解率達到最大值(41%)，而當(dāng)溫度為10和35 ℃時，降解率分別降至17.2%和35.65%. 但也存在一些嗜熱菌對高溫具備良好的適應(yīng)能力，Tao等[28]的研究表明，嗜熱菌AeribacilluspallidusSL-1在60 ℃時能夠降解80%的菲和50%的芘，這可能是由于該菌產(chǎn)生的生物乳化劑在各種環(huán)境條件下均具有穩(wěn)定的乳化活性，因而保證了菌株在高溫條件下的降解能力.

2.2 pH

極端的酸性或堿性條件會對微生物的利用能力產(chǎn)生破壞性影響，研究[27]表明，部分酸性介質(zhì)中的氫離子容易與酶的氨基或羧基結(jié)合，改變了酶原有的結(jié)構(gòu)特征，從而削弱了酶對多環(huán)芳烴的結(jié)合能力. 此外，酸性或堿性條件也會影響營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度和轉(zhuǎn)運過程. 大多數(shù)化學(xué)異養(yǎng)微生物如真菌和細菌都傾向于在中性pH條件下對多環(huán)芳烴進行生物降解[25,29]. Wang等[27]的研究表明，當(dāng)pH為4和5時，OchrobactrumMB-2對芘的降解率分別為7.0%和15.9%，而當(dāng)pH為7時降解率則達到了最大值(41%). Govarthanan等[30]研究表明，Halomonassp. 對芘和苯并[a]芘的最高降解率體現(xiàn)在pH為7時，分別為67.5%和59.5%，隨著pH的升高，降解率出現(xiàn)明顯下降，其中pH為10時菌株對芘和苯并[a]芘的降解率均在40%以下.

2.3 共代謝作用

微生物通常通過共代謝作用降解HMW-PAHs. 一般來說，不同分子量的多環(huán)芳烴在降解過程中存在相互作用. 以萘和芘的相互作用為例，Jiang等[31]研究表明，在含有50和100 mg/L萘的降解體系中，Acinetobacterjohnsonii完全降解芘的時間(155和151.5 h)比只含有單一底物芘的對照組(157 h)更快. 這可能是由于在萘和芘雙底物協(xié)同生物降解體系中，低濃度萘作為生長底物可以為微生物細胞的生長提供穩(wěn)定的碳源和能量，從而增強生物降解活性；其次在大量萘存在下，菌體內(nèi)催化PAHs裂解的降解酶水楊酸羥化酶和兒茶酚2,3-二加氧酶被大量誘導(dǎo)分泌，增強了其降解能力. 除此之外，Wang等[27]根據(jù)構(gòu)建的萘與芘的共降解動力學(xué)方程推測，由于與萘的結(jié)構(gòu)相似，芘會搶占大部分降解酶的活性位點，最終導(dǎo)致芘的降解得到了促進，而萘的降解則被抑制(見圖2).

圖2 萘和芘在微生物降解過程中存在相互作用[27]Fig.2 Naphthalene and pyrene interact during microbial degradation[27]

3 促進降解的強化方式

3.1 添加表面活性劑

研究[32-33]表明，非離子型表面活性劑被分解成小分子后增加了細菌對多環(huán)芳烴的生物利用度，進而提高了降解率，另外，表面活性劑的添加還有助于提高混合水平和細胞表面的生理性質(zhì). 吐溫80是一種良效的化學(xué)表面活性劑. Al-Farraj等[32]研究表明，在添加不同表面活性劑(SDS、吐溫20、Triton X100、吐溫80、TDTMA)的降解體系中，吐溫80培養(yǎng)物中菌株Hortaeasp.B15對芘的降解率最高(>80%)，相比之下在含有吐溫20和TDTMA的降解體系中，芘的降解率不足70%. Guo等[21]從養(yǎng)豬廢水中提取的一種生物表面活性劑能夠有效地促進苯并[a]芘在污染水中的生物降解，在1、2、3、4和5 CMC(critical micelle concentration，臨界膠束濃度)下，該生物表面活性劑使苯并[a]芘的水溶性分別提高了1.4、2.6、4.0、5.2和6.6倍；當(dāng)該生物表面活性劑用量分別為1和3 CMC時，苯并[a]芘濃度分別降至1.015 mg/L(降解率為47.9%)和0.675 mg/L(降解率為65.4%).

3.2 固定化處理微生物

進行固定化操作可以保護目標(biāo)微生物免受極端pH和有毒化合物的污染，同時減少與本地微生物的競爭，進而提高HMW-PAHs的降解率[34]. 研究表明，生物炭是微生物降解HMW-PAHs的優(yōu)質(zhì)固定化材料. Ma等[35]研究表明，將分枝桿菌固定在改性花生殼粉上可以提高土壤脫氫酶活性和微生物多樣性，促進土壤中HMW-PAHs的降解，添加生物制劑后，與對照相比，降解45 d后4環(huán)和5環(huán)PAHs的降解率分別增加了53%和55%. Mandal等[36]研究表明，將酵母菌團固定在經(jīng)過化學(xué)改性的木屑粉中后能夠使苯并[a]芘的降解率從游離菌株狀態(tài)的64.2%提高至82.5%，對芘的降解率則從58.3%提高至75.1%，推測降解率的提高可能是由木屑表面化學(xué)改性使其孔隙率提高所致，孔隙率的增加增強了氧的擴散，促進了酵母菌團的吸附和生長，從而增加了微生物活性和生物降解能力.

3.3 構(gòu)建基因工程菌

構(gòu)建高效、降解能力強的工程菌可以大幅提高PAHs的降解效率[37-38]. 對HMW-PAHs而言，微生物在對其進行降解的過程中具有共同的降解基因及其編碼的酶[39-40]. 因而在本土微生物物種沒有表現(xiàn)出HMW-PAHs降解能力或降解率很低的情況下，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因微生物可作為降解HMW-PAHs的有效方式[39,41].

降解HMW-PAHs工程菌株的構(gòu)建往往通過在受體中表達降解基因來完成. Mardani等[42]研究表明，通過植入編碼鄰苯二酚2,3-雙加氧酶(catechol 2,3-dioxygenase，C23O)的nahH基因構(gòu)建的工程菌株假單胞菌(Pseudomonasputida)在培養(yǎng)90 d后對芘和菲共降解體系的降解率(>90%)優(yōu)于天然菌株的降解率(<20%). Cao等[43]研究表明，將控制銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaBSFD5)中鼠李糖脂合成基因的rhlABRI盒克隆并轉(zhuǎn)化到惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaKT2440)的染色體中，構(gòu)建出的重組菌株惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaKT2440-rhlABRI)在培養(yǎng)30 d后對芘的降解率達到了79%，高于未加菌對照組的43%.

4 典型HMW-PAHs的降解途徑

4.1 芘的降解途徑

芘(pyrene，PYR)由4個苯環(huán)組成，由于結(jié)構(gòu)與其他致癌的HMW-PAHs物質(zhì)相似，因此常被作為模型化合物用于研究HMW-PAHs的降解過程[15]. PAHs中相當(dāng)于菲環(huán)9、10位的區(qū)域為K區(qū)，研究[44-45]表明，通過K區(qū)氧化降解進入三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)是芘降解的主要途徑之一，而二氫二醇、鄰苯二甲酸鹽、原兒茶酸則是該途徑重要的中間產(chǎn)物. 在該途徑下芘的降解還可分為3種途徑(見圖3)： ①芘在K區(qū)被降解為二羥基菲(dihydroxy phenanthrene)，二羥基菲隨后被轉(zhuǎn)化為鄰苯二甲酸(phthalic acid)，鄰苯二甲酸繼續(xù)被降解并最終進入TCA循環(huán)完成反應(yīng)，該途徑在Hortaeasp. B15中得到證實(見圖3中A途徑)[32]；②芘首先在K區(qū)進行雙加氧反應(yīng)生成二氫二醇，二氫二醇繼續(xù)反應(yīng)生成鄰苯二甲酸鹽(phthalate)，鄰苯二甲酸鹽被進一步降解為原兒茶酸(protocatechuate)，其繼續(xù)轉(zhuǎn)化為TCA循環(huán)的中間體進入中心代謝完成降解，該途徑在分枝桿菌屬MycobacteriumvanbaaleniiPYR-1中得到證實(見圖3中B途徑)[46]；③芘首先在K區(qū)被氧化為4,5二羥基芘(4,5 dihydroxy pyrene)，隨后進行氧化和環(huán)裂解反應(yīng)生成菲和鄰苯二甲酸二異丙酯(pthalic acid diisopropyl ester)，鄰苯二甲酸二異丙酯繼續(xù)被氧化為苯甲酸2-羥基戊酯(benzoic acid 2-hydroxy pentyl ester)，其繼續(xù)被降解為苯甲酸(benzoic acid)，最終被轉(zhuǎn)化為丙酮酸進入代謝生成CO2，該途徑在軟蓋革孔菌CoriolopsisbyrsinaAPC5被證實(見圖3中C途徑)[19].

圖3 芘的降解途徑[19,32,46-49]Fig.3 Degradation pathways of pyrene[19,32,46-49]

HMW-PAHs在開環(huán)降解過程通常會進入低環(huán)途徑，芘已被證實可以通過菲和萘酚的途徑被降解. 即芘首先被還原為4,5-二氫芘(4,5-dihydro-pyrene)，再進一步氧化還原生成1-羥基-2-萘甲酸或在C-C鍵裂解生成菲，進一步降解為CO2和H2O(見圖3中D、E途徑)，而1-羥基-2-萘甲酸通?？梢酝ㄟ^鄰苯二甲酸或萘酚2種途徑進行降解(見圖3中F途徑)，該途徑在假單胞菌屬Pseudomonassp. LX2和克雷伯氏菌屬Klebsiellasp.LZ6中被證實[47-49]. Wang等[50]的研究同樣證實芘可以通過菲的途徑被降解.

4.2 苯并[a]芘的降解途徑

苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene，BaP)是一種HMW-PAHs，國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)已經(jīng)將苯并[a]芘列為已知的致癌物之一[51]. 苯并[a]芘不易被降解，常被視為研究HMW-PAHs的模型化合物[52].

圖4 苯并[a]芘的降解途徑[53-55]Fig.4 Degradation pathways of Benzo[a]pyrene[53-55]

5 微生物對典型HMW-PAHs的降解機制

在微生物群落中，細菌是PAHs污染修復(fù)中被廣泛研究的類群，其對HMW-PAHs的降解通常由基因編碼的氧合酶引發(fā)，經(jīng)一系列生化反應(yīng)后將HMW-PAHs轉(zhuǎn)化進入TCA循環(huán)完成降解(見圖5)[12,56]. 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可降解芘的細菌有假單胞菌屬(Pseudomonassp.)[47,57]、分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)[46,58]、紅球菌屬(Rhodococcussp.)[20]等. 可降解苯并[a]芘的細菌有芽孢桿菌屬(Bacillussp.)[22-23]和假單胞菌屬(Pseudomonassp.)[59]等.

圖5 微生物對HMW-PAHs的代謝機制[12,56]Fig.5 Metabolic mechanism of microorganism to HMW-PAHs[12,56]

5.1 雙加氧酶催化HMW-PAHs羥基化

羥基化是HMW-PAHs降解過程中的重要步驟，而這一過程通常由雙加氧酶催化進行. 細菌和藻類對多環(huán)芳烴的降解主要涉及雙加氧酶和部分單加氧酶介導(dǎo)的反應(yīng)[12]. 分枝桿菌屬的細菌通常在雙加氧酶作用下將芘代謝為4,5-二氫二醇，假單胞菌菌株中也存在類似的降解途徑[46,57]. Jin等[57,60]研究表明，假單胞菌Pseudomonassp. JPN2能夠在由nahAa、nahAb、和nahAcAd組成的萘雙加氧酶的作用下降解芘，其中編碼雙加氧酶α亞基的nahAc基因在多環(huán)芳烴的二羥基化反應(yīng)中起關(guān)鍵作用. Kim等[46]研究表明，在MycobacteriumvanbaaleniiPYR-1中，由基因nidA3B3編碼的雙加氧酶能夠?qū)④帕u基化分解代謝為芘順-4,5-二氫二醇(pyrene cis-4,5-dihydrodiol)或芘順-1,2-二氫二醇(pyrene cis-1,2-dihydrodiol). PAH環(huán)羥化雙加氧酶(PAH-RHDα)是催化HMW-PAHs降解過程中重要的雙加氧酶，通常由PAH-RHDα基因家族編碼[61]. Thomas等[62]研究表明，多環(huán)芳烴(包含HMW-PAHs)污染土壤中13株P(guān)AHs降解菌株的PAH-RHD酶由基因PAH-RHDa編碼，并催化HMW-PAHs環(huán)羥基化降解[63]. Miao等[64]研究同樣證明，RhodococcusaetherivoransIcdP1對茚并[1,2,3-cd]芘的環(huán)羥基化是由主要分布在PAH降解區(qū)域A中(1 977 937～2 019 582 bp)的基因所編碼的環(huán)羥化雙加氧酶RHOs1892-1894、RHOs1917-1920和RHOs4740-4741引導(dǎo)進行的. 除此之外，Wang等[50]還發(fā)現(xiàn),在降解芘的過程中Cycloclasticussp. P1體內(nèi)編碼雙加氧酶(RHD-1和RHD-4)-亞基的兩對同源基因Q91_0875/Q91_0876和Q91_0870/Q91_0871顯著上調(diào)，其中RHD-1能夠催化芘的羥基化降解.

5.2 細胞色素P450單加氧酶氧化HMW-PAHs

細胞色素P450(cytochrome P450，CYP)酶是廣泛存在于微生物、動植物及人體中與膜結(jié)合的血紅蛋白類酶，具有羥基化、環(huán)氧化、脫烷基等多種生物催化活性[65]. 許多真菌用包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶、細胞色素P450和環(huán)氧水解酶在內(nèi)的酶來代謝多環(huán)芳香烴，其中非木質(zhì)素真菌初始氧化多環(huán)芳烴酸的主要途徑涉及細胞色素P450單加氧酶的活性[66]. 研究[65,67-68]表明，細胞色素P450單加氧酶可以將多芳香烴氧化為芳烴氧化物. 在曲霉菌屬、青霉菌屬和小克銀漢霉菌屬中，多環(huán)芳烴的初始轉(zhuǎn)化通常由細胞色素P450單加氧酶和O2氧化產(chǎn)生芳烴氧化物和水[69]. Kashyap等[70]研究表明，CandidatropicalisMTCC184中的細胞色素P450單加氧酶能夠?qū)④叛趸癁槎涠紡亩龑?dǎo)降解過程. Vasconcelos等[18]發(fā)現(xiàn)，Olypocladiumsp. CBMAI 1346對芘的降解主要由細胞色素P450系統(tǒng)中的單加氧酶引發(fā)，這些酶與環(huán)氧水解酶結(jié)合將芘羥基化為4,5-反式二羥基芘. Lu等[23]的研究則表明，在芘降解的過程中，Bacillusthuringiensis的P450酶可以催化氧化苯并[a]芘進行環(huán)裂解.

6 結(jié)論與展望

a) 過高或過低的溫度及pH通過改變酶的活性來影響著微生物的降解性能，并且不同分子量的多環(huán)芳烴在降解過程中存在相互作用. 由于HMW-PAHs降解過程中的中間產(chǎn)物多而復(fù)雜，因此探究降解中間產(chǎn)物對微生物降解性能的影響是未來的研究方向之一. 另外，對共代謝機制進行深入探索以最大程度地發(fā)揮微生物的降解能力也是HMW-PAHs未來研究的重點.

b) 有多種方法可以對HMW-PAHs的微生物降解進行強化，其中表面活性劑吐溫80對降解的促進作用較為明顯；將微生物固定在生物炭上也能夠有效促進HMW-PAHs的降解；通過在受體菌株中表達降解基因來構(gòu)建基因工程菌是促進HMW-PAHs的有效方法，但是基因工程菌降解性能的長期穩(wěn)定性等問題對該技術(shù)的廣泛應(yīng)用造成阻礙，未來通過監(jiān)測和調(diào)控環(huán)境因子，綜合降解機理分析并進行基因重組構(gòu)建新型高效且穩(wěn)定的降解菌株應(yīng)是HMW-PAHs微生物降解的研究方向之一.

c) K區(qū)氧化降解和通過低環(huán)途徑降解是芘和苯并[a]芘微生物降解的主要途徑，雙加氧酶和細胞色素P450酶是能夠催化HMW-PAHs氧化降解的重要降解酶. 隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，利用全基因組測序技術(shù)鑒定未表達的降解基因，綜合多組學(xué)數(shù)據(jù)從基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白和代謝水平對HMW-PAHs的降解機制進行全面深入的闡釋是未來研究的重點.