三七超低溫破壁粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

黃冬芳 韋金玉 梁 潔,2,3 陳輝華 祁金麗 胡 玨 劉 民 趙立春,2,3

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530200；3.廣西優(yōu)勢中成藥與民族藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530200；4.廣西桂盛合中藥制藥有限公司，廣西南寧 532100

三七為五加科植物三七Parmx notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根莖[1]，三七是我國貴重中藥，具祛瘀、止血、滋補等作用[2-3]。三七粉、三七片、熟三七和熟三七粉是三七現(xiàn)有的飲片規(guī)格[4-5]；而三七粉既是目前最常用的飲片形式，也是臨床上最常應(yīng)用的粉末規(guī)格[6-8]。粒徑是影響有效成分溶出的關(guān)鍵因素[9]，中藥材經(jīng)粉碎成細(xì)粉后減小粒徑，由此可提高生物利用度[10]。超微粉碎技術(shù)是近年興起的一種新型技術(shù)，可增加藥材的細(xì)胞破壁率，明顯提高有效成分的溶出[11-14]，有利于與給藥部位直接接觸[15]。2018 年云南省發(fā)布了呈凍干物質(zhì)狀態(tài)的三七、三七粉、三七切片的中藥飲片炮制規(guī)范，表明真空冷凍干燥技術(shù)已開始應(yīng)用于三七的炮制，且可以有效地保存藥效成分[16-17]。真空冷凍干燥技術(shù)，指在超低溫條件下及真空狀態(tài)下獲得的一種物質(zhì)狀態(tài)，能保持藥物的原有特性，提高其穩(wěn)定性[18-19]。

三七粉可內(nèi)服和外用[20]，外用于止血，吞服可用來防治高血壓，對于身體衰弱、食欲不振等癥狀也有一定的功效[21-24]?，F(xiàn)代臨床上常將三七粉用于止血、治療肝損傷、防治冠心病、增強免疫力[25-27]。三七超低溫破壁粉首先是用真空冷凍干燥技術(shù)將藥材進(jìn)行超低溫干燥，再通過破壁技術(shù)的加工而得到的。與普通的三七粉比較，處理后的三七超低溫破壁粉利用價值提升，細(xì)胞、組織破壁可增大有效成分的溶出速度和溶出度，同時還具有細(xì)度穩(wěn)定、不易團聚的優(yōu)勢。目前，超微三七粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)研究較多，但關(guān)于三七超低溫破壁粉質(zhì)量控制方面的顯微鑒別和薄層鑒別研究尚少見，本研究開展三七超低溫破壁粉的較為全面的質(zhì)量研究，為建立三七超低溫破壁粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SQP 電子分析天平（萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；DHG9240A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16G 高速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ5200 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZF-7型暗箱式三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；AFZ-1001-U 艾科浦超純水系統(tǒng)（重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）；硅膠G 板（青島海洋化工有限公司）；HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；BT224S 光學(xué)生物顯微鏡（廈門麥克奧迪實業(yè)有限公司）；Waters e2695 高效液相色譜儀（美國沃特世公司）。

1.2 試藥

10 批三七超低溫破壁粉（廣西桂盛合中藥制藥有限公司，批號：20200301、20200302、20200303、20200501、20200502、20200503、20200601、20200602、20200603、20200701）；對照品[人參皂苷Rb1（批號：wkq19012107-wkq20010707）、人參皂苷Rg1（批號：wkq19040208-wkq20022711）、三七皂苷R1（批號：wkq19043009-wkq20022804）]均來源于四川省維克奇生物科技有限公司，純度≥98%；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀特征

10 批三七超低溫破壁粉粉末的粗細(xì)程度、顏色、氣味等形狀特征基本一致，均為灰黃色的粉末，氣微，味苦回甜。

2.2 顯微特征

取本品粉末適量，加水合氯醛透化后制成蠟片，于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)其薄壁細(xì)胞碎片眾多，偶見完整細(xì)胞。淀粉粒甚多，單粒圓形、半圓形或圓多角形，直徑4～30 μm；復(fù)粒由2～10 余分粒組成。樹脂道碎片直徑21～165 μm，含黃色分泌物。導(dǎo)管為梯紋導(dǎo)管、網(wǎng)紋導(dǎo)管及螺紋導(dǎo)管，碎片長20～280 μm，直徑15～55 μm。木薄壁細(xì)胞團偶見，長95～160 μm，寬45～85 μm。草酸鈣簇晶少見，直徑50～80 μm。見圖1。

圖1 三七超低溫破壁粉顯微特征圖

2.3 薄層色譜鑒別

取本品粉末0.5 g，加水5 滴，攪勻，加水飽和的正丁醇5 ml，密塞，振搖10 min，離心，取上清液，加3 倍量正丁醇飽和的水，搖勻，放置使分層，取正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇1 ml 使溶解，作為供試品溶液。

另取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1及三七皂苷R1，加甲醇制成每1 ml 各含0.5 mg的混合溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各1 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇:水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸溶液（1→10），105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；置紫外光燈（365 nm）下檢視，顯相同的熒光斑點。10 批樣品按照上述方法進(jìn)行檢驗，10 批樣品與對照品均有相似的斑點，薄層鑒別見圖2。

圖2 10 批樣品的薄層色譜圖

2.4 水分、灰分及浸出物檢測

參照2020 版《中華人民共和國藥典》（四部）[28]通則水分測定法、灰分測定法、浸出物測定法對樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。結(jié)合實際應(yīng)用，初步擬定本品水分不得過12%，總灰分不得過4%，酸不溶性灰分不得過2%，醇浸出物含量不得少于15%。

表1 三七超低溫破壁粉的水分、總灰分、酸不溶性灰分及醇浸出物測定結(jié)果（%）

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件 Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序為（0～12 min，19%B；12～60 min，36%B，60～65 min，38%B）；進(jìn)樣量為10 μl；柱溫為30℃；流速為0.8 ml/min；檢測波長為203 nm。理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計算應(yīng)不低于4000。

2.5.2 混合對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1適量，加甲醇制成每l ml含人參皂苷Rg10.5033 mg/ml、人參皂苷Rb10.5667 mg/ml、三七皂苷R10.1958 mg/ml的混合溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液制備 取三七超低溫破壁粉（批號：20200501）約0.6 g，精密稱定，精密加入甲醇30 ml，稱定重量，放置2 h 后，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。對照品及三七超低溫破壁粉高效液相色譜圖見圖3。

圖3 混合對照品及三七超低溫破壁粉高效液相色譜圖

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密稱取三七皂苷R12.35 mg、人參皂苷Rg16.04 mg、人參皂苷Rb16.8 mg，分別制成0.7833、2.0133、2.2667 mg/ml的貯備液。精密吸取三七皂苷R1貯備液適量，制成一系列濃度為0.0196、0.0979、0.1958、0.3917、0.5875、0.7833 mg/ml，精密吸取人參皂苷Rg1貯備液適量，制成一系列濃度為0.0503、0.2517、0.5033、1.0067、1.5100、2.0133 mg/ml，精密吸取人參皂苷Rb1貯備液適量，制成一系列濃度為0.0567、0.2833、0.5667、1.1333、1.7000、2.2667 mg/ml，注入高效液相色譜儀，以濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)X，峰面積積分值Y 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系實驗結(jié)果

2.5.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μl，按照“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD 值分別為1.62%、1.55%、1.62%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗 取三七超低溫破壁粉（批號：20200501）6 份，按“2.5.3”項下方法配制成供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量的RSD 值分別為2.62%、2.65%、2.55%，結(jié)果表明本方法具有較好的重復(fù)性。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗 取三七超低溫破壁粉（批號：20200 501）按“2.5.3”項下方法配制成供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行測定，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD 值分別為2.52%、2.41%、2.91%，結(jié)果表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.8 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的三七超低溫破壁粉（批號：20200501）6 份，加入相應(yīng)量（1∶1）的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1，按“2.5.3”項下方法處理后，按“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)行含量測定，計算回收率，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的平均加樣回收率分別為102.8%、97.2%、96.0%，RSD 分別為1.59%、1.48%、1.45%。

2.5.9 樣品的含量測定 取10 批樣品，每批樣品平行測定3 次，按“2.5.3”項下方法制備，按“2.5.1”項色譜條件進(jìn)行測定，含量測定的結(jié)果見表3。

由表3 可知，樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量分別在0.62%～0.64%，3.07%～3.96%，2.25%～2.49%，按干燥品計算，10 批三七超低溫破壁粉中每批含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的總量在6.15%～6.88%，每批總量均≥6.00%，故建議按干燥品計算三七超低溫破壁粉含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的總量不得少于6.00%。

表3 10 批樣品含量測定結(jié)果（%）

3 討論

在薄層鑒別的考察中，嘗試過同時鑒別4 種皂苷成分，人參皂苷Re 和三七皂苷R1的Rf 值相近，很多展開系統(tǒng)難以分開，結(jié)合本研究中的含量測定指標(biāo)成分有人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1，考慮到薄層鑒別與含量測定盡量選擇一致的指標(biāo)性成分進(jìn)行研究，能更好、更精準(zhǔn)地進(jìn)行質(zhì)量控制。故最后只選用了人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1作為對照品進(jìn)行薄層的鑒別。

對于色譜條件的選擇，參考2020 年版《中華人民共和國藥典》一部[1]中三七的含量測定項下色譜條件，但經(jīng)過考察，最終選擇流速為0.8 ml/min，在該流速下色譜峰分離度最佳；且對洗脫梯度進(jìn)行了調(diào)整，因人參皂苷Rb1出峰時間很靠后，故將梯度洗脫的時間延長至65 min，保證各個峰都能有較好的分離效果。

真空冷凍干燥技術(shù)和破壁技術(shù)的相結(jié)合是為順應(yīng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的需要而發(fā)展起來的一種新型藥材加工技術(shù)，真空冷凍干燥技術(shù)可最大程度地保持藥材的營養(yǎng)價值；對藥材進(jìn)行破壁處理，有效成分能實現(xiàn)更大的利用價值，但其粉體性質(zhì)發(fā)生了某些變化，這些變化可能會對三七超低溫破壁粉的質(zhì)量有影響。因此，開展對三七超低溫破壁粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，可進(jìn)一步完善三七超低溫破壁粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究所建立的方法簡便、準(zhǔn)確且可靠，可以作為三七超低溫破壁粉的質(zhì)量控制方法。