基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討女貞子治療肝癌的機(jī)制

張 飛 劉杰民 趙 琦

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，貴州貴陽 550025；2.貴州省人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡科室，貴州貴陽 550002；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州貴陽 550003

在當(dāng)今世界范圍內(nèi)，肝癌是最為常見的致命性惡性腫瘤[1]。肝癌的主要病因包括肝炎病毒的感染、黃曲霉素、飲水污染及遺傳因素等[2]。根據(jù)肝癌的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其屬于“積聚”“鼓脹”等疾病，傳統(tǒng)的中醫(yī)藥治療廣泛應(yīng)用于臨床肝癌的治療中[3-4]。

女貞子系木犀科植物女貞（Ligustrum lucidum Ait）的干燥成熟果實(shí)。首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)等功效。其味苦涼，歸經(jīng)屬于肝、腎兩經(jīng)。女貞子作為補(bǔ)益藥，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分對(duì)肝癌的治療有顯著的效果[5]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)女貞子的抗肝癌功效做整體探討，為今后臨床上使用女貞子提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 女貞子的有效成分收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中國(guó)知網(wǎng)、萬方醫(yī)學(xué)網(wǎng)、PubMed 對(duì)女貞子的化合物成分進(jìn)行檢索，其檢索時(shí)限為2011 年1 月至2020 年8 月。通過口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18或通過SwissTargetPrediction 網(wǎng)站的藥代動(dòng)力學(xué)及藥物相似性對(duì)女貞子的化合物進(jìn)行初步篩選。

1.2 藥物作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

將女貞子收集得到的有效化合物利用TCMSP 中目標(biāo)信息選項(xiàng)或者SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)中的SwissTarget 預(yù)測(cè)選項(xiàng)對(duì)其有效成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，并通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將所的到的靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的基因名稱。

1.3 構(gòu)建化合物和預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 軟件的構(gòu)圖功能，將篩選出來的化合物與預(yù)測(cè)靶點(diǎn)相結(jié)合，構(gòu)建女貞子的成分與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 肝癌靶點(diǎn)基因的收集

利用GeneCards 和在線人類孟德爾遺傳（online Mendelian inheritance in man，OMIM）數(shù)據(jù)庫(kù)以“l(fā)iver cancer”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，然后把得到的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整合，從而得出肝癌的疾病基因。

1.5 藥物和疾病的交集靶點(diǎn)

利用生物信息學(xué)與進(jìn)化基因組學(xué)網(wǎng)站中的計(jì)算與繪制維恩圖選項(xiàng)，對(duì)所得到的藥物靶點(diǎn)基因和肝癌基因進(jìn)行交集分析處理，并以維恩圖的形式體現(xiàn)出來，最終得到兩者的交集靶點(diǎn)基因。

1.6 構(gòu)建蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)

將得出的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）分析，將搜索類型限定為“智人”，根據(jù)需要設(shè)置靶點(diǎn)間的要求和得分得出結(jié)果，并導(dǎo)出結(jié)果。隨后，將其得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.7 GO 分析及KEGG 通路富集分析

Metascape 是為實(shí)驗(yàn)生物學(xué)家提供全面的基因列表注釋和分析資源的數(shù)據(jù)庫(kù)[6]。使用該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路富集分析，設(shè)定物種限定為人并篩選出P ＜0.01的結(jié)果值。再將KEGG 分析得出的關(guān)鍵通路與靶點(diǎn)間的聯(lián)系利用Cytoseape 軟件進(jìn)行可視化處理，繪制“靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”的網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 女貞子有效成分的篩選

通過TCMSP、中國(guó)知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)女貞子有效成分進(jìn)行篩選，得到有效成分共有16 種，刪除無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的6 種成分，得到最終具有良好藥效的有效成分有10 種。見表1。

表1 女貞子的有效成分

2.2 藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出來的有效成分進(jìn)行靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，選取對(duì)其評(píng)分值靠前的靶點(diǎn)，導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫(kù)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，共得出預(yù)測(cè)靶點(diǎn)134 個(gè)。將化合物和預(yù)測(cè)靶點(diǎn)通過Excel 表格的整合，導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，得出化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。見圖1。

圖1 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 肝癌靶點(diǎn)收集及維恩圖的制作

通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)得到肝癌靶點(diǎn)1033 個(gè)，將其與藥物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)取交集，得到47 個(gè)共同靶點(diǎn)，即為有效靶點(diǎn)。見圖2、表2。

圖2 有效靶點(diǎn)的獲取

表2 女貞子治療肝癌的有效靶點(diǎn)

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將47 個(gè)有效靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫(kù)得出PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。其中網(wǎng)絡(luò)里包含47 個(gè)節(jié)點(diǎn)和274 個(gè)邊，平均節(jié)點(diǎn)度為11.7。將得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，根據(jù)節(jié)點(diǎn)的大小和邊的粗細(xì)提取排名靠前的11 個(gè)靶點(diǎn)，顏色越深、節(jié)點(diǎn)越大表示靶點(diǎn)越關(guān)鍵，其中AKT1、ESR1、EGFR 等與其他蛋白聯(lián)系較好。見圖4。

圖3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.5 GO 分析

GO 分析得出與疾病最相關(guān)的20 個(gè)條目，女貞子治療肝癌的靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)氮化合物的反應(yīng)、對(duì)淀粉樣β的反應(yīng)、磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽絲氨酸修飾等。見圖5。

圖5 有效靶點(diǎn)的GO 分析

2.6 KEGG 富集分析

KEGG 富集分析得出與疾病最相關(guān)的14 條通路，有效靶點(diǎn)涉及的通路主要為癌癥的途徑、前列腺癌、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、癌癥中的MicroRNA、TNF 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等主要通路。見圖6。將結(jié)果利用Cytoseape 軟件進(jìn)行可視化處理，得到靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。見圖7。

圖6 有效靶點(diǎn)的KEGG 富集分析

圖7 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

肝癌在中醫(yī)學(xué)的范疇屬于“積聚”“臌脹”“黃疸”“脅痛”等疾病[7]。對(duì)于肝癌的病因病機(jī)，徐斌認(rèn)為主要包括飲食不節(jié)、七情內(nèi)郁、濕毒蘊(yùn)結(jié)等，從而產(chǎn)生蘊(yùn)毒、氣滯、濕濁、痰凝、瘀血多種病理因素，不斷積累導(dǎo)致肝癌發(fā)生[8]。隨著中西醫(yī)的興起，中醫(yī)藥的研究也正處于新的時(shí)代。相關(guān)研究表明，女貞子的提取物對(duì)肝癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用[9]，臨床觀察也得出具有女貞子成分的中成藥在聯(lián)合化療治療腫瘤中也具有很好的治療效果，如貞芪扶正分散片[10]。

肝癌的發(fā)生大多與體內(nèi)正邪的變化有著密切的關(guān)系，扶正祛邪在肝癌的治療中有著重大的意義。女貞子屬于補(bǔ)益藥中的補(bǔ)陰藥，有古籍記載女貞子具有主補(bǔ)中、安五臟、養(yǎng)精神、除百疾的功效[11]。該藥補(bǔ)益扶正的藥性對(duì)肝癌的治療有很大的作用。通過構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、羥基酪醇等是該網(wǎng)絡(luò)中的核心有效成分，與靶點(diǎn)聯(lián)系較緊密?，F(xiàn)代研究表明女貞子活性成分β-谷甾醇可通過線粒體途徑將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，抑制肝癌HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡[12]。而槲皮素在體外可抑制肝癌及其他多種腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[13]。其主要機(jī)制包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制腫瘤組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)等，與抑制AKT 信號(hào)通路讓其凋亡等有關(guān)[14]。山柰酚對(duì)肝癌Huh7 細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用[15]。羥基酪醇也可以誘導(dǎo)多種腫瘤增殖抑制及凋亡發(fā)生[16]。綜上結(jié)果所示，本研究中的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)展現(xiàn)了女貞子多成分和多靶點(diǎn)共同作用治療肝癌的特點(diǎn)。

通過搜集藥物和疾病靶點(diǎn)，經(jīng)過整合得出兩者的共同靶點(diǎn)為47 個(gè)，經(jīng)過PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析得出AKT1、ESR1、EGFR、RTGS2、SRC 等靶點(diǎn)在該網(wǎng)絡(luò)中處于重要地位，可以作為女貞子治療肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究表明AKT1 基因與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[17]，通過AKT1 還可明顯抑制人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)其凋亡[18]。在肝臟中雌激素只有與雌激素受體，尤其是ESR1 結(jié)合后才能發(fā)揮延緩肝細(xì)胞凋亡、改善肝纖維化、抑制腫瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)功能[19]?？梢奅SR1 可以作為診斷和治療肝癌的重要靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)EGFR 表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力呈正相關(guān)，可作為良好的肝癌檢測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)[20]。SRC 也與肝癌密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)TRIM7 通過抑制SRC-mTORC1 信號(hào)軸的活化發(fā)揮對(duì)肝癌的抑癌效應(yīng)[21]。由KEGG 通路富集分析得出這些靶點(diǎn)與肝癌、肝炎等通路聯(lián)系密切，與上述目前重要靶點(diǎn)的研究結(jié)果及女貞子活性成分和靶點(diǎn)作用于肝癌的治療大致相同。

通過GO 分析顯示，女貞子主要通過細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物、氧化應(yīng)激、氮化合物、淀粉樣β的反應(yīng)等生物進(jìn)程發(fā)揮其治療肝癌的作用。KEGG 通路富集分析得出，其主要富集在癌癥的途徑、前列腺癌、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、癌癥中的MicroRNA、TNF 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等。其中癌癥的途徑、前列腺癌、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、癌癥中的MicroRNA 均直接與癌癥包括肝癌在內(nèi)直接相關(guān)，表明女貞子有較好的抗肝癌效果。女貞子可以調(diào)控癌通路的表達(dá)，達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞的效果。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）是目前發(fā)現(xiàn)的抗癌作用較強(qiáng)的生物因子[22]，另外有研究證實(shí)女貞子提取物通過抑制TNF-α的表達(dá)來發(fā)揮其抗腫瘤作用[23]。這也與本研究所富集在該通路的結(jié)論可很好地吻合，提示該通路在本研究的重要性。楊金蓮[24]初步證實(shí)了酒精通過引起ROS 水平升高，進(jìn)而促進(jìn)NF-κB 信號(hào)通路的活化，從而介導(dǎo)肝癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管的生成，此外NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活對(duì)H-ras12V 轉(zhuǎn)基因雄鼠肝臟腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[25]。以上結(jié)果說明了女貞子活性成分的靶點(diǎn)分別作用于不同的通路，從而體現(xiàn)出其治療肝癌的作用，但是具體的通路機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究顯示女貞子治療肝癌的主要化學(xué)成分可能是槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、羥基酪醇等成分，這些有效成分可以通過AKT1、ESR1、EGFR、RTGS2、SRC 等靶點(diǎn)及對(duì)癌癥的途徑、癌癥中的MicroRNA、TNF、NF-κB 等通路的調(diào)節(jié)，達(dá)到對(duì)肝癌有效的治療作用。本研究通過篩選女貞子治療肝癌的有效化學(xué)成分、有效靶點(diǎn)，以及其主要的生物進(jìn)程和通路，為今后臨床上中醫(yī)中藥治療肝癌提供了新的方向和思路。