窄譜抗菌肽的篩選及其溶血性分析

杭柏林,徐軍,李杰,趙雪芹,魏曉曉,張慧輝,胡建和

（1.河南科技學院動物科技學院,河南新鄉(xiāng)453003；2.新鄉(xiāng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心,河南新鄉(xiāng)453003）

窄譜抗菌肽的篩選及其溶血性分析

杭柏林1,徐軍1,李杰2,趙雪芹1,魏曉曉1,張慧輝1,胡建和1

（1.河南科技學院動物科技學院,河南新鄉(xiāng)453003；2.新鄉(xiāng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心,河南新鄉(xiāng)453003）

通過抗菌活性試驗篩選了具有窄譜特性的抗菌肽,并分析了其溶血性.結(jié)果表明：抗菌肽C僅對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抗菌活性,而對其他6種革蘭陰性菌、2種革蘭陽性菌和3種真菌沒有抗菌活性,對兔紅細胞有較低的溶血性.結(jié)果為臨床用藥提供了幫助.

窄譜抗菌肽；篩選；溶血性；抗菌活性

Abstract:To screen the antimicrobial peptide with narrow spectrum,the antimicrobial peptides were screened with narrow spectrum characteristics through the antibacterial activity test,and its hemolytisis was analyzed.The results showed that the antibacterial peptide C had antibacterial activity only on Escherichia coli and Staphylococcus aureus, but had no antibacterial activity on the other six kinds of Gram-negative bacteria,two kinds of Gram-positive bacteria and three kinds of fungi,and had lower hemolytic on rabbit red blood cells.The result provides help for clinical medication.

Key words:narrow spectrum antibacterial peptide；screening；hemolysis；antibacterial activity

傳統(tǒng)抗生素的大量使用或濫用導致耐藥菌株不斷產(chǎn)生[1],以及使用后產(chǎn)生的殘留和環(huán)境污染問題威脅著人類健康[2].因此,尋求副作用低的抗生素或抗生素替代物成為必然選擇.抗菌肽（antimicrobial peptide,AMP）是生命機體內(nèi)的重要免疫分子,具有抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和中和體內(nèi)毒素等生物學活性[3].由于抗菌肽的細胞選擇性和不易產(chǎn)生耐藥性等特點,人們認為抗菌肽是抗生素的理想替代品[4-5].目前,抗菌肽數(shù)據(jù)庫APD3已收錄了2 842種抗菌肽[6].不同的抗菌肽有著不同的抗菌譜,這一點與抗生素相似.廣譜抗生素能破壞腸道微生物組,而窄譜抗生素如Debio1452對腸道微生物組僅有微小影響[7].廣譜抗菌肽同樣不能區(qū)分體內(nèi)的正常菌群,這可能會限制抗菌肽的應用,而窄譜抗菌肽僅針對較少的病菌具有抗菌活性.因此,窄譜抗菌肽對由特殊病原所致疾病的治療具有重要意義.本研究利用實驗室保存的抗菌肽,并根據(jù)已知抗菌肽設計了幾種新抗菌多肽,通過抑菌試驗分析了這些多肽的抗菌活性,對篩選的窄譜抗菌肽進行溶血性分析,為臨床治療藥物的篩選提供幫助.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 抗菌肽抗菌肽P3、JH-0、JH-1、JH-2和JH-3的氨基酸序列來自文獻[8],JH-4和JH-5是根據(jù)JH-3的序列修改的多肽,A和B是從雞內(nèi)源性抗菌肽NK-lysin序列中挑選的一段序列,C是根據(jù)牛源抗菌肽indolicidin序列修改的多肽,D是根據(jù)豬內(nèi)源性抗菌肽protegrin-5序列修改的多肽.抗菌肽P3、JH-0、JH-1、JH-2和JH-3以及多肽A、B、C和D由上海吉爾生化有限公司合成,多肽JH-4和JH-5由無錫亞肽生物科技有限公司合成,多肽純度≥95%.

1.1.2 試驗菌株雞致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、鼠傷寒沙門菌、多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌2型、副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌為實驗室分離自臨床病例,青霉和曲霉分離自空氣,產(chǎn)氣腸桿菌和普通變形桿菌、炭疽桿菌（疫苗株）由實驗室保存.

1.1.3 試劑及儀器TSB（Tryptic Soy Broth）培養(yǎng)基、氨芐青霉素和制霉菌素均為Solarbio公司產(chǎn)品,小牛血清為上海哈靈公司產(chǎn)品,胰蛋白胨和酵母提取物為Oxoid公司產(chǎn)品,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）為邦泰生物工程公司產(chǎn)品.其他實驗室常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純.打孔器（Φ為3 mm）為北京普波斯生物有限公司產(chǎn)品,高壓蒸汽滅菌器為上海申安公司產(chǎn)品,生物安全柜為蘇州金凈公司產(chǎn)品,恒溫培養(yǎng)箱為上海一恒公司產(chǎn)品,高速離心機和酶標儀為Thermo公司產(chǎn)品.

1.1.4 動物紅細胞從兔耳緣靜脈無菌采集血液,用肝素抗凝,4℃保存,備用.

1.2 試驗方法

1.2.1 抗菌活性檢測用瓊脂糖平板擴散法[9]測定抗菌肽對受試細菌的抗菌活性.將培養(yǎng)的受檢菌株混于1 mL底層培養(yǎng)基（TSB 0.1 g,超純瓊脂糖0.1 g,加超純水至10 mL,pH 7.4）中,凝固后打孔（直徑約3 mm）,封底；每孔中加5 μL抗菌肽樣品,陽性對照用氨芐青霉素（針對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌）,陰性對照用PBS；37℃倒置1 h；添加10 mL上層覆蓋培養(yǎng)基（TSB 0.6 g,超純瓊脂糖0.1 g,加超純水至10 mL,pH 7.4,50℃左右）；37℃倒置過夜培養(yǎng)；根據(jù)有無抑菌圈來判定所測抗菌肽有無抗菌活性.

按照文獻[10]的方法測定抗菌肽的抗真菌活性.取10 μL抗菌肽樣品加入96孔板的小孔中,再加入用SDA液體培養(yǎng)基調(diào)好濃度的真菌孢子懸液100 μL,同時設PBS為陰性對照,設置霉菌素為陽性對照, 28℃培養(yǎng)48 h（白色念珠菌）或72 h（青霉和曲霉）,用肉眼觀察法觀察培養(yǎng)液渾濁度,根據(jù)渾濁度判斷所測抗菌肽有無抗真菌活性.

1.2.2 溶血性測定按照文獻[11]的方法進行抗菌肽的溶血性測定.抗凝血經(jīng)1 300 r/min離心5 min,用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌沉淀3次,再用PBS配制1%紅細胞.用PBS將抗菌肽質(zhì)量濃度調(diào)整為16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL,加入等體積的紅細胞懸液.以PBS為陰性對照,以1%Tritonx-100為陽性對照,37℃作用1 h,1 300 r/min離心5 min,將上清液依次加入96孔板,用酶標儀測540 nm處的OD值.溶血率/%=（檢測孔OD值-陰性孔OD值）/（陽性孔OD值-陰性孔OD值）×100.

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽的抗菌活性

抗菌肽對7種革蘭陰性菌、3種革蘭陽性菌和3種真菌的抗菌活性結(jié)果如表1所示.

由表1可知,抗菌肽P3、JH-0、JH-1、JH-2僅對1種革蘭陰性菌沒有抗菌活性,抗菌肽JH-4、JH-5和A對2種革蘭陰性菌沒有抗菌活性,抗菌肽B對3種革蘭陰性菌沒有抗菌活性,抗菌肽C對6種革蘭陰性菌沒有抗菌活性,而抗菌肽D對7種所試革蘭陰性菌均沒有抗菌活性；抗菌肽P3、JH-2、JH-3僅對1種革蘭陽性菌沒有抗菌活性,抗菌肽JH-0、JH-1、JH-4、JH-5、C對2種革蘭陽性菌沒有抗菌活性,而抗菌肽A、B、D菌株對3種革蘭陽性菌均無抗菌活性；抗菌肽P3、JH-3僅對1種真菌沒有抗菌活性,抗菌肽JH-2、JH-4、JH-5對2種真菌沒有抗菌活性,而抗菌肽JH-0、JH-1、A、B、C、D對3種真菌均無抗菌活性.綜合分析,抗菌肽C為窄譜抗菌肽.

表1 抗菌肽對細菌和真菌的抗菌活性Tab.1 Antibacterial activityofantimicrobial peptides against bacteria and fungi

2.2 溶血性分析

對抗菌肽C進行溶血性分析,結(jié)果如圖1所示.

圖1 抗菌肽C對兔紅細胞的溶血性分析Fig.1 Hemolysis analysis ofantimicrobial peptide Ctorabbit erythrocyte

從圖1可以看出：在8 μg/mL的質(zhì)量濃度下,溶血率約為8%；在20 μg/mL的質(zhì)量濃度下,溶血率約為13%；40 μg/mL的質(zhì)量濃度下,溶血率約為16%.由此可見,隨著濃度的升高,溶血率也隨之升高,但在質(zhì)量濃度超過20 μg/mL時,溶血率升高緩慢.

3 結(jié)論與討論

抗菌肽因其獨特的氨基酸組成、電荷、空間構(gòu)像與結(jié)構(gòu)、兩親性、疏水性等特征而有著獨特的作用機制[12].一般認為,抗菌肽的作用機制主要為膜作用機制和胞內(nèi)作用機制,但還沒有一個涵蓋所有抗菌肽作用機制的理論[13].不同的抗菌肽可作用于不同的靶標而發(fā)揮作用.廣譜抗菌肽可作用于通用靶標而發(fā)揮抗菌作用,窄譜抗菌肽可作用于特異的靶標而發(fā)揮抗菌作用.Qiu等[14]獲得一個窄譜的嵌合抗菌多肽,其對糞腸球菌萬古霉素抵抗株具有較好的殺滅作用,能使糞腸球菌萬古霉素抵抗株感染小鼠存活.地衣芽胞桿菌M-4株分泌的抗菌肽fungicin M4僅對犬小孢子菌、毛霉、申克孢子絲菌、巨大芽胞桿菌、谷氨酸棒狀桿菌有抑菌活性[15].解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種ST91KM產(chǎn)生的細菌素ST91KM是一種對奶牛乳房炎相關細菌有抑菌活性的窄譜多肽[16].

臨床上應用抗菌肽治療疾病時,可采用類似于抗生素的“降階梯治療（de-escalation therapy）”策略[17],即感染初始使用廣譜抗菌肽,在細菌培養(yǎng)和藥敏結(jié)果獲得之后,使用針對性的窄譜抗生素.本研究獲得窄譜抗菌肽C僅對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌活性,但其對腸道微生物組的影響還不甚清楚,值得深入探討.

雖然抗菌肽的溶血機制還不是很清楚,但是抗菌肽的溶血性會限制抗菌肽的開發(fā)與應用.因此,低溶血性或無溶血性的抗菌肽具有較好的應用前景.抗菌肽的陽離子性和雙親性結(jié)構(gòu)是抗菌肽溶血性的基礎.低溶血性或無溶血性的抗菌肽的抗菌機制除了陽離子性和雙親性外可能還有其他的機制.因此,本研究篩選到的低溶血性窄譜抗菌肽C可能還有其他的抗菌機制.

本研究通過抑菌試驗分析11種抗菌肽對受試的革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌的抗菌活性,篩選到抗菌肽C為窄譜抗菌肽,其僅對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抗菌活性,對兔紅細胞有較低的溶血性.

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[16]PIETERSE R,TODOROV S D,DICKS L M.Bacteriocin ST91KM,produced by Streptococcus gallolyticus subsp.macedonicus ST91KM,is a narrow-spectrum peptide active against bacteria associated with mastitis in dairy cattle[J].Canadian Journal of Microbiology,2008,54（7）：525-531.

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（責任編輯：盧奇）

Screening of antimicrobial peptide with narrow spectrum and analysis of hemolysis

HANG Bolin1,XU Jun1,LI Jie2,ZHAO Xueqin1,WEI Xiaoxiao1,ZHANG Huihui1,HU Jianhe1
（1.College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine,Henan Institute ofScience and Technology, Xinxiang453003,China；2.XinxiangCenter ofMonitor and Inspection for QualityofLivestock Production,Xinxiang453003,China）

S859

A

1008-7516（2017）04-0037-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2017.04.007

2017-05-17

國家自然科學基金（31672559）；河南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃（15IRTSTHN）；河南科技學院高層次人才啟動項目（2014020）；河南科技學院“百農(nóng)英才”創(chuàng)新項目（BNYC2015-2-07,BNYC2015-2-09）

杭柏林（1978—）,男,江蘇海安人,博士,講師.主要從事動物病原與新獸藥研究.

胡建和（1968—）,男,河南輝縣人,博士,教授.主要從事動物病原與新獸藥的研究.