植物源與微生物源生物制劑復(fù)配防治根結(jié)線蟲病

舒潔 張仁軍 梁應(yīng)沖 陳雅瓊 張娟 郭建 陳穗云

（1. 云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650091；2. 云南省作物病害生物防控技術(shù)研究中心，昆明 650091；3. 云南省煙草公司昆明市公司，昆明 650051；4. 峨山彝族自治縣化念鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，玉溪 653202；5. 云南省煙草公司紅河州公司，彌勒 652399；6. 云南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，昆明 650091）

番茄（Solanum lycopersicum）是全球重要經(jīng)濟(jì)作物，全世界年產(chǎn)量達(dá)1.7 億t［1］。隨著我國(guó)番茄種植面積逐漸擴(kuò)大，番茄根結(jié)線蟲（Meloidogyrnespp.）病、青枯病、早疫病等病害日趨嚴(yán)重［2-3］，尤其根結(jié)線蟲病在國(guó)內(nèi)番茄種植區(qū)中普遍發(fā)生［4-5］。根結(jié)線蟲是一種能侵染多種農(nóng)作物的雜食性植物病原蟲［4］，通過在寄主植物根部細(xì)胞間隙運(yùn)動(dòng)使侵染部位形成大小不一的瘤狀凸起，輕發(fā)時(shí)植株表現(xiàn)為營(yíng)養(yǎng)不良、生長(zhǎng)緩慢，病重時(shí)植株停止生長(zhǎng)甚至萎蔫死亡，常見寄主植物如番茄、煙草（Nicotiana tabacum）等茄科作物［4］。目前針對(duì)根結(jié)線蟲的傳統(tǒng)防治方法有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治。農(nóng)業(yè)防治如深耕、輪作、培育抗性品種等［5-6］，但由于根結(jié)線蟲寄主范圍十分廣泛，且國(guó)內(nèi)缺乏高抗作物品種，農(nóng)業(yè)防治的效果并不理想［6］?；瘜W(xué)防治是防治田間根結(jié)線蟲病的常用手段之一，由于使植物帶有農(nóng)殘、對(duì)環(huán)境造成污染，讓線蟲產(chǎn)生耐藥性等負(fù)面效應(yīng)無法消除，如“克百威”、“滅線磷”等化學(xué)藥劑已陸續(xù)被禁止使用［7］。因此，近年來的研究焦點(diǎn)已經(jīng)放在尋找安全、環(huán)保、高效的新防治方法上，如生物防治、基因工程等。

生物防治是利用植物或微生物，通過在土壤中添加植株提取液、微生物發(fā)酵液等方式達(dá)到防治線蟲的目的［8-9］。用天然植物材料防治線蟲的作用機(jī)理是通過抑制線蟲抗氧化酶系活性、影響其神經(jīng)系統(tǒng)興奮傳導(dǎo)、損傷線蟲體壁和消化道等方式［9-10］。目前約有300 余種植物被研究報(bào)道具有殺線蟲或使線蟲致病活性，如用于防治南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incongnita）的千里光（Senecio scandens）；防治爪哇根結(jié)線蟲（Meloidogyne javanica）的印楝（Azadirachta indica）等［10］。Kazuhiko等人首次發(fā)現(xiàn)苦參（Sophora flavescens）中提取的苦參堿具有殺線蟲活性［11-12］，但其殺蟲作用具體靶點(diǎn)尚未探明［13］。印楝素因其具有廣譜殺蟲活性且對(duì)環(huán)境低污染的優(yōu)點(diǎn)被廣泛研究，作用機(jī)制為胃毒、觸殺等，是一種較為環(huán)保安全的植物源農(nóng)藥［14-15］。我國(guó)利用植物源農(nóng)藥防治線蟲的研究起步較晚，尚未找出致死線蟲的關(guān)鍵因子。加之植物源活性物質(zhì)在土壤中易降解，其應(yīng)用效果不穩(wěn)定的問題有待研究［16-19］。除植物源殺線劑外，微生物源制劑對(duì)根結(jié)線蟲的防治也有報(bào)道。Dong等［20］研究發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉（Purpureocillium lilacinum）殺線蟲的重要機(jī)制是分泌幾丁質(zhì)酶破壞蟲體壁和卵囊壁，近年來在煙草（Nicotiana tabacum）［21］、番茄［22］、黃瓜（Cucumis sativus）［23］等作物上均有生防應(yīng)用實(shí)例。穿刺巴氏桿菌（Pasteurria penetrans）、哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）通過侵染并寄生于根結(jié)線蟲體內(nèi)，通過分泌代謝產(chǎn)物對(duì)根結(jié)線蟲J2產(chǎn)生毒性作用［24-27］。但是單一微生物菌劑仍然受到土壤環(huán)境條件的制約，在應(yīng)用中防治效果穩(wěn)定性不佳［28］。

本研究中旨在以生物防治的理念為出發(fā)點(diǎn)，通過分離土壤微生物篩選出抑殺根結(jié)線蟲的生防菌，再將初篩有效抑殺根結(jié)線蟲的生防菌發(fā)酵液和植物源殺線劑進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，以篩選出一種更高效的復(fù)配制劑防治根結(jié)線蟲的方案。經(jīng)盆栽實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證復(fù)配制劑對(duì)根結(jié)線蟲的防治效果，試圖探索出適應(yīng)綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需求的一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

南方根結(jié)線蟲（M. incongnita）來源為云南省玉溪市峨山縣番茄病根；供試菌株SJ5（Pseudomonas psychrotolerans）、SJ17（Chryseobacterium gleum）、SJ19（Bacillus subtilis）從云南省昆明市番茄地土壤中分離，由本實(shí)驗(yàn)室保存；使用番茄品種為美的1號(hào)番茄，由云南省玉溪市峨山縣化念鎮(zhèn)番茄種植合作社惠贈(zèng)；盆栽土壤為泥炭基質(zhì)土。

供試藥劑為41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑（拜耳公司北京分公司），20%噻唑膦水乳劑（山東大農(nóng)藥業(yè)有限公司），1%苦參印楝素乳油劑（云南綠戎生物產(chǎn)業(yè)開發(fā)股份有限公司），SJ5、SJ17、SJ19液體菌劑（云南大學(xué)發(fā)酵，有效活菌數(shù)≥3.0 億個(gè)/mL）。試驗(yàn)在云南大學(xué)溫室大棚于2020 年10 月-2021 年1 月進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 根結(jié)線蟲J2的毒力測(cè)定 測(cè)試菌種接種于200 mL LB液體培養(yǎng)基（pH 7.4），于28℃，140 r/min進(jìn)行48 h震蕩培養(yǎng)，得到生防菌發(fā)酵液，低溫條件下6 500 r/min離心3 min后，上清液經(jīng)無菌濾膜（0.22 μm）除菌獲得發(fā)酵上清濾液。設(shè)置5個(gè)處理，每處理5 個(gè)皿（直徑35 mm），每皿20 uL根結(jié)線蟲J2懸液（約100 條），每皿添加100 μg/mL利福平，20 μg/mL青霉素，50 μg/mL鏈霉素；超凈工作臺(tái)中放置12 h后統(tǒng)計(jì)校正死亡率，重復(fù)3次。

處理1：3 000 μL對(duì)照LB液體培養(yǎng)基；處理2：3 000 μL SJ5發(fā)酵濾液；處理3：3 000 μL SJ17發(fā)酵濾液；處理4：3 000 μL SJ19發(fā)酵濾液；處理5：3 000 μL苦參印楝素稀釋液（1000 倍）；

校正死亡率=（處理組致死率-對(duì)照組致死率）/（1-對(duì)照組致死率）×100%。

1.2.2 生防菌的分子生物學(xué)鑒定 提取生防菌基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增16S rRNA基因并測(cè)序（北京擎科生物科技有限公司昆明分公司）。測(cè)序得到的序列在NCBI Blast中進(jìn)行對(duì)比，于數(shù)據(jù)庫（GenBank）中檢索下載近源菌株序列，利用MEGAX軟件進(jìn)行菌株系統(tǒng)發(fā)育分析，用鄰接法（neighbour-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，檢驗(yàn)自舉支持率（Bootstrap）重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000，根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定菌種。

1.2.3 拮抗測(cè)試 LB培養(yǎng)基滅菌降溫至50℃后加入稀釋1 000 倍的1%苦參印楝素，倒板靜置。調(diào)節(jié)生防細(xì)菌菌懸液濃度為5×106CFU/mL，吸取50 μL均勻涂布在平板，再分別吸取5 μL另外兩株生防菌懸液點(diǎn)板，封膜后置于28℃恒溫箱倒置培養(yǎng)24 h，觀察有無抑菌圈產(chǎn)生，有抑菌圈代表菌株不能共同生長(zhǎng)，無抑菌圈表示兩菌株相容，能共同生長(zhǎng)。

1.2.4 盆栽試驗(yàn) 選擇對(duì)根結(jié)線蟲易感病的番茄作為盆栽材料，盆栽土使用泥炭基質(zhì)土，用30 d苗齡的番茄苗進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，番茄苗移栽3 d后，設(shè)置7個(gè)處理，每個(gè)處理5盆，試驗(yàn)重復(fù)3次。

CK0：不接種線蟲，不施用任何殺線蟲藥劑的陰性對(duì)照；CK1：每盆接種根結(jié)線蟲3 000 條，不施用任何殺線蟲藥劑的陽性對(duì)照；T1：每盆接種根結(jié)線蟲3 000 條，施用200 mL氟吡菌酰胺稀釋液（1 000 倍）；T2：每盆接種根結(jié)線蟲3 000 條，施用200 mL噻唑膦稀釋液（1 000 倍）；T3：每盆接種根結(jié)線蟲3 000 條，施用200 mL苦參印楝素稀釋液（1 000 倍）；T4：每盆接種根結(jié)線蟲3 000 條，各施用20 mL三種液體菌劑，15 d后重復(fù)1次；T5：每盆接種根結(jié)線蟲3 000 條，各施用20 mL三種液體菌劑，100 mL苦參印楝素稀釋液（1 000 倍），15 d后重復(fù)1次。

根結(jié)線蟲病級(jí)指數(shù)［19］：0 級(jí)，根系未被侵染，無根結(jié)，健康完整；1 級(jí)，有極少數(shù)根結(jié)，根結(jié)占根系體積10%以下；3 級(jí)，少量根結(jié)，根結(jié)占根系體積的11%-25%；5 級(jí)，根結(jié)明顯，根結(jié)占根系體積26%-50%；7 級(jí)，根系相連，根結(jié)占全根系的51%-75%；9 級(jí)，多數(shù)主根和側(cè)根結(jié)癭并呈畸形，甚至腐爛，根結(jié)占全根系的75%以上。

根結(jié)指數(shù)［3］=∑（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)嚴(yán)重度）/（調(diào)查總株數(shù)×最高等級(jí)數(shù)9）×100

相對(duì)防效（%）［3］=（對(duì)照組根結(jié)指數(shù)-處理組根結(jié)指數(shù)）/對(duì)照組根結(jié)指數(shù)×100

2 結(jié)果

2.1 SJ5、SJ17、SJ19生防菌的鑒定

2.1.1 菌體形態(tài) SJ5菌株呈粉白色，圓形，表面明 亮，微透明；SJ17菌株呈金黃色，圓形，表面明亮，不透明；SJ19菌株呈乳白色，圓形，表面明亮，不透明（圖1）。

圖1 SJ5、SJ17、SJ19菌體形態(tài)Fig.1 Morphology of strain SJ5，SJ17，and SJ19

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)菌株SJ5、SJ17、SJ19的16S rDNA測(cè)序序列通過NCBI進(jìn)行同源性比對(duì)并檢索下載近源物種序列，用標(biāo)準(zhǔn)菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2-圖4所示，菌株SJ5與耐冷假單胞菌 （Pseudomonas psychrotolerans）聚為一支，序列同源性為100%；SJ17菌株與粘金黃桿菌（Chryseobacterium gleum）聚為一支，序列同源性為100%；SJ19菌株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚為一支，序列同源性為100%；因此SJ5、SJ17、SJ19分別被鑒定為耐冷假單胞菌、黏金黃桿菌、枯草芽孢桿菌。

圖2 菌株SJ5系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of SJ5

圖3 菌株SJ17系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of SJ17

圖4 菌株SJ19系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of SJ19

2.2 線蟲J2的毒力測(cè)定

普通光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)處理12 h的J2死亡情況（圖5），對(duì)照①處理后的南方根結(jié)線蟲J2在12 h內(nèi)無死亡現(xiàn)象?？鄥⒂￠靥幚?2 h后線蟲的校正死亡率達(dá)70.81%，而生防菌SJ5、SJ17、SJ19發(fā)酵上清濾液處理后12 h線蟲大量死亡，生防菌SJ5、SJ17、SJ19對(duì)J2校正死亡率分別達(dá)89.23%、87.95%、88.97%（圖6）。

圖5 顯微鏡下觀察線蟲毒力測(cè)定Fig.5 Virulence determination of nematodes under microscope

2.3 生防菌株以及生防菌與植物源制劑之間相 容性

生防菌株SJ5、SJ17、SJ19均能在含有苦參印楝素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且共同培養(yǎng)的菌株之間均未產(chǎn)生抑菌圈（圖7）。

圖7 相容性測(cè)定Fig.7 Compatible test results

2.4 不同處理對(duì)番茄根結(jié)線蟲的防治效果

盆栽45 d后，對(duì)照組CK1被根結(jié)線蟲侵害嚴(yán)重，根短且布滿根結(jié)，處理組T5根部發(fā)育狀態(tài)較好，根結(jié)數(shù)量少且不明顯（圖8）。不同藥劑處理的番茄根結(jié)線蟲根結(jié)指數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低（圖9）。氟吡菌酰胺（T1）和噻唑膦（T2）處理組防治效果較高，達(dá)到71.24%和69.73%，二者無顯著性差異。生防菌與苦參印楝素復(fù)配制劑處理組T5防效為67.75%，與化學(xué)藥劑處理組T1、T2無顯著性差異；苦參印楝素處理組T3防效最低，為46.40%。

圖8 不同處理對(duì)番茄根系的影響（45 d）Fig.8 Effects of different treatments on tomato root system（45 d）

圖9 不同處理對(duì)番茄根結(jié)線蟲病的防治效果（45 d）Fig.9 Control effects of different treatments on tomato root-knot nematode disease（45 d）

2.5 不同處理對(duì)番茄植株長(zhǎng)勢(shì)的影響

番茄移栽后45 d，統(tǒng)計(jì)株高、莖圍、植株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量（圖10）。生防菌與苦參印楝素復(fù)配制劑處理組T5株高、苗鮮重、苗干重、根鮮重與其他處理組存在顯著差異，且顯著高于空白處理組CK0。莖圍、根干重各組無顯著性差異。

圖10 不同處理對(duì)番茄植株長(zhǎng)勢(shì)的影響（45 d）Fig.10 Agronomic traits of tomato plants under different treatments（45 d）

3 討論

植物線蟲病每年致全球損失至少1 570 億美元，目前市場(chǎng)上的防治線蟲產(chǎn)品仍以化學(xué)藥劑為主，噻唑膦和棉隆等常見化學(xué)藥劑在市場(chǎng)容量中占比共達(dá)73.52%［29］?；瘜W(xué)農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致土壤惡化、作物產(chǎn)量與品質(zhì)下降、病害加重，對(duì)生態(tài)環(huán)境和食品安全造成了嚴(yán)重威脅［30］。通過近幾年“兩減”戰(zhàn)略的有力推行，2020 年底我國(guó)順利完成化肥農(nóng)藥減量提效預(yù)期目標(biāo)［31］，進(jìn)一步擴(kuò)大研發(fā)安全高效、環(huán)境友好的生物制劑勢(shì)必更能滿足人民對(duì)綠色、高端農(nóng)產(chǎn)品的需求。

生物防治資源開發(fā)近年來取得了較大進(jìn)展，一些研究表明生防菌復(fù)合使用能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)并提高防效［32-37］。Mendoza等［35］人研究發(fā)現(xiàn)無毒鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（Bacillus.firmus）聯(lián)合使用可有效降低香蕉穿孔線蟲（Radopholus similis）的種群密度。Siddiqui等［36］提出，與單獨(dú)使用一種菌劑相比，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）與哈茨木霉（Trichodermaharzianum）協(xié)同作用能夠提高生防菌的防效。不同微生物在土壤環(huán)境中發(fā)揮不同功能，混合微生物功能更加豐富，對(duì)病害防控的效果更好［27］。生物防治手段在綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了越來越重要的作用，然而生物防治效果不穩(wěn)定是目前制約國(guó)內(nèi)外生物防治應(yīng)用與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要因素［37］，主要原因是微生物對(duì)土壤環(huán)境的適應(yīng)性不穩(wěn)定，植物源農(nóng)藥相比化學(xué)藥劑更易被自然環(huán)境分解，隨著作物生長(zhǎng)，藥效會(huì)逐漸減弱［37］。

目前關(guān)于植物源與微生物源制劑聯(lián)合防治根結(jié)線蟲病鮮有報(bào)道，復(fù)配制劑防治根結(jié)線蟲的機(jī)制復(fù)雜，其中必須要考慮的因素是制劑之間的相容性［38］。本研究中測(cè)試的3株生防菌與苦參印楝素共生長(zhǎng)時(shí)未發(fā)生拮抗作用，證明本研究復(fù)配方案中選擇的兩種生物制劑相容性良好。復(fù)配防治按照應(yīng)用方式可以分為：混合發(fā)酵、分別發(fā)酵后混合施加、分別發(fā)酵后間隔一定時(shí)間施加等［39-40］。已有研究表明微生物制劑復(fù)配時(shí)，分別發(fā)酵后混合施加的效果優(yōu)于其他施用方式［41］，故本研究在參考傳統(tǒng)復(fù)配方案的基礎(chǔ)上，本研究采用生防菌分別發(fā)酵后的發(fā)酵濾液與苦參印楝素混合施加灌根的優(yōu)化復(fù)配方案，結(jié)果表明施用發(fā)酵48 h的3種生防菌濾液（發(fā)酵液中有效活菌數(shù)≥3.0 億個(gè)/mL）與苦參印楝素稀釋液（1 000 倍）復(fù)配制劑處理的防效比單獨(dú)使用植物源制劑和單獨(dú)使用生防菌劑的處理組分別顯著提高了18.61%和7.79%。

自然環(huán)境中植物寄生線蟲生防菌資源豐富［42］。本研究中的3株生防菌均分離自番茄根際土壤，更有利于應(yīng)用時(shí)在土壤中定殖。Liu等［43］發(fā)現(xiàn)了耐冷假單胞菌具有能夠提高宿主植物養(yǎng)分吸收并幫助宿主固氮的有益特性。Bhise等［44］研究證明粘金黃桿菌能夠在鹽脅迫土壤中生存，并能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)。枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生嗜鐵素，嗜鐵素不僅是促生長(zhǎng)因子，還能防治病害［45］，Ramyabharathi［46］、Mazzuchelli［47］、Abd等［48］通過試驗(yàn)證明枯草芽孢桿菌能夠用于對(duì)非洲菊（Gerbera jamesonii）、甘蔗（Saccharum officinarum）等作物根結(jié)線蟲病的防控，且效果較好。本研究首次發(fā)現(xiàn)耐冷假單胞菌發(fā)酵濾液和粘金黃桿菌發(fā)酵濾液具有抑殺根結(jié)線蟲J2的作用。盆栽試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，3株生防菌發(fā)酵濾液與苦參印楝素復(fù)配施加后在控制根結(jié)線蟲病情的同時(shí)還能促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)，具體體現(xiàn)在株高、苗鮮重、苗干重、根鮮重與空白對(duì)照組相比均有顯著提高。

目前生物防治根結(jié)線蟲病的研究主要集中在單一菌株的防病促生作用，復(fù)配研究較少。本研究將微生物制劑與植物源制劑復(fù)配進(jìn)行生物防治，初步發(fā)現(xiàn)復(fù)配制劑對(duì)于番茄根結(jié)線蟲病防效更佳、且對(duì)番茄植株有顯著促生長(zhǎng)作用的結(jié)果，為番茄根結(jié)線蟲病的防治提供了更豐富的生物資源。在番茄根結(jié)線蟲病害防治中，隨著人們對(duì)生物防治資源的不斷挖掘和更多新型藥劑的研發(fā)，化學(xué)農(nóng)藥減量將成必然趨勢(shì)。利用微生物與植物源制劑之間的協(xié)同作用提高對(duì)番茄根結(jié)線蟲病的防治效率，適應(yīng)于新型藥劑的開發(fā)趨勢(shì)，一方面使生物防治效果更加穩(wěn)定，另一方面可顯著減少農(nóng)藥用量，具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力和廣闊的發(fā)展前景。目前對(duì)本研究使用的復(fù)配制劑殺蟲的活性成分與大田環(huán)境下的作用時(shí)效尚不清楚，因此將殺蟲機(jī)理與大田應(yīng)用作為今后的研究重點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究從土壤分離出耐冷假單胞菌（P. psychrotolerans）、粘金黃桿菌（C. gleum）和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）3株生防細(xì)菌，通過室內(nèi)毒力測(cè)試顯示了12 h內(nèi)對(duì)根結(jié)線蟲的較高毒力；采用平板抑菌圈法證明生防菌與植物源制劑之間無拮抗作用。盆栽試驗(yàn)初步驗(yàn)證，發(fā)酵48 h的3種生防菌發(fā)酵液（有效活菌數(shù)≥3.0 億個(gè)/mL）與苦參印楝素稀釋液（1 000 倍）復(fù)配制劑處理組對(duì)根結(jié)線蟲病的防效達(dá)67.75%，與化學(xué)農(nóng)藥（氟吡菌酰胺、噻唑膦）處理組相比防效無顯著性差異，且番茄株高、莖圍、苗和根部的生物量均顯著性增加，試驗(yàn)結(jié)論初步發(fā)現(xiàn)復(fù)配方案具有防治番茄根結(jié)線蟲病害應(yīng)用潛力。