微生物法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量不確定度評(píng)估

吳思敏，嚴(yán)家俊，黃鐘標(biāo)

廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東佛山 528300

0 引言

葉酸（Folic Acid），又名蝶酰谷氨酸，是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一。葉酸不能在體內(nèi)合成，需要通過(guò)日常飲食攝入，葉酸的缺乏或過(guò)量攝入都會(huì)對(duì)人體造成傷害[1～3]。因此，通過(guò)有效方法對(duì)含葉酸產(chǎn)品進(jìn)行定量檢測(cè)，確保人體葉酸的攝入在合理的水平具有顯要的意義[4，5]。

目前，嬰幼兒配方乳粉中葉酸的檢測(cè)方法包括儀器法[6～10]、化學(xué)發(fā)光分析法[11～13]、酶聯(lián)免疫法[14，15]和微生物法[16～19]等。相對(duì)于其他檢測(cè)方法，微生物法具有較高的靈敏度及精確度，可以滿足對(duì)于葉酸含量較低、基質(zhì)復(fù)雜樣品的檢測(cè)需求。美國(guó)官方分析家協(xié)會(huì)手冊(cè)及《GB 5009.211—2014 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉酸的測(cè)定》都將微生物法作為葉酸檢測(cè)的首選方法和仲裁方法。但微生物法操作較為繁瑣，并且試驗(yàn)過(guò)程有諸多不確定因素，以致檢測(cè)結(jié)果存在一定的誤差。為了更加客觀公允的表示分析結(jié)果，保證葉酸測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究依據(jù)《GB 5009.211—2014 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉酸的測(cè)定》及相關(guān)不確定度評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)影響嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量測(cè)定結(jié)果的不確定度分量進(jìn)行研究，以此確保檢測(cè)結(jié)果的權(quán)威與公正，從而更好地保障食品質(zhì)量與安全。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus Caseispp.rhamnosus）（ATCC 7469）；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

CL-40M高壓滅菌鍋，GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，1-14K離心機(jī)，ML204電子天平，CP225D分析天平，UV-1900分光光度計(jì)，Vortex-Genie 2渦旋混合器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試樣的提取

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品，精確至0.001 g，轉(zhuǎn)入含80.0000 mL氫氧化鈉乙醇溶液的100.0000 mL容量瓶中，超聲振蕩2～4 h后，用水定容至刻度，搖勻。用水進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

1.3.2 培養(yǎng)管配制

標(biāo)準(zhǔn)曲線系列管：取試管分別加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液0.0000 mL、0.2500 mL、0.5000 mL、1.0000 mL、1.5000 mL、2.0000 mL、2.5000 mL、3.0000 mL、3.5000 mL、4.0000 mL和5.0000 mL，加水至5.0000 mL后，添加5.0000 mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液。每個(gè)梯度做3 次平行。

樣品系列管：取空試管分別加入0.5000 mL、1.0000 mL、2.0000 mL3 個(gè)含量的試樣稀釋液，加水至5.0000 mL后，添加5.0000 mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液。每個(gè)梯度做3 次平行。

1.3.3 滅菌與培養(yǎng)

將所有試管塞好試管塞，于121 ℃滅菌5 min，快速冷卻至室溫。在無(wú)菌條件下向每只試管加入20 μL接種液，另取一只標(biāo)準(zhǔn)管不接種，作為0對(duì)照管，混勻。置于（37±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h。

1.3.4 測(cè)定與結(jié)果計(jì)算

使用混勻振蕩器將培養(yǎng)好的試管混勻，于540 nm處，以0對(duì)照管調(diào)節(jié)吸光度值為0，依次測(cè)定各試管培養(yǎng)液。以標(biāo)準(zhǔn)系列管中葉酸的含量為橫坐標(biāo)，各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)吸光度值的平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算試樣系列管中葉酸的相應(yīng)含量，以此計(jì)算樣品中葉酸的含量。

1.4 建立數(shù)學(xué)模型及識(shí)別不確定的來(lái)源

試驗(yàn)中葉酸含量為下式：

其中，X為試樣中葉酸含量（μg/100 g）；C為試樣稀釋液中葉酸濃度的平均值（ng/mL）；V為試樣提取液的定容體積（mL）；m為試樣的質(zhì)量（g）；f為稀釋倍數(shù)；為由ng/g換算為μg/100 g的系數(shù)。

通過(guò)分析不確定度數(shù)學(xué)模型可知，葉酸的測(cè)量不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程、樣液配制過(guò)程、儀器測(cè)量偏差、重復(fù)性以及檢測(cè)方法等幾方面引入。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的不確定度來(lái)源主要有：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、標(biāo)準(zhǔn)品的稱量、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制以及標(biāo)準(zhǔn)系列管的配制等。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品的純度引入的不確定度

葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的檢定證書(shū)給出其純度≥99.00%，假設(shè)該標(biāo)準(zhǔn)品純度在99.00%～100.00%的范圍內(nèi)服從矩形分布，其中位值為99.50%，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度

根據(jù)分析天平的檢定證書(shū)可知，天平的允差范圍為±0.1 mg，采用矩形分布，包含因子為，本試驗(yàn)使用減重法稱取葉酸標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，共稱重2次，即1 次為空盤(pán)質(zhì)量，1 次為總質(zhì)量。則標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的相對(duì)不確定度為

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程中量具引入的不確定度

稱取20.0 mg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品后，使用1000.0000 mL容量瓶，定容至刻度，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取1.0000 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100.0000 mL容量瓶，定容至刻度，配制成標(biāo)準(zhǔn)中間液。移取1.0000 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液至1000.0000 mL容量瓶，定容至刻度，配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液。該過(guò)程中用到1000.0000 mL容量瓶2 次，100.0000 mL容量瓶1次，1.0000 mL移液槍2 次。根據(jù)《JJG 646 移液器檢定規(guī)程》及《JJG 196 常用玻璃量器檢定規(guī)程》，查得所使用量具的最大允許誤差。選用矩形分布，包含因子為，則移液管和容量瓶的不確定度見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制過(guò)程中量具引入的不確定度

根據(jù)不確定度的合成公式，標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制過(guò)程中，由量具所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

環(huán)境溫度的變化對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制產(chǎn)生一定的影響，試驗(yàn)所用量具校準(zhǔn)的溫度為20 ℃。在實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程中，環(huán)境的溫度波動(dòng)范圍為（20±5）℃，水的體積膨脹系數(shù)約為2.1×10-4。因此，假設(shè)溫度波動(dòng)均勻分布，包含的因子為 3，則由溫度所引入的各量具相對(duì)不確定度均是0.06%，標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制過(guò)程中，由環(huán)境溫度所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)系列管的配制引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)系列管的配制過(guò)程中使用1.0000 mL的移液槍吸取了0.2500 mL、0.5000 mL、1.0000 mL，使用5.0000 mL的移液槍吸取了1.5000 mL、2.0000 mL、2.5000 mL、3.0000 mL、4.0000 mL、5.0000 mL。采用矩形分布，包含因子為，則由吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液體積的移液槍引入的不確定度見(jiàn)表2。標(biāo)準(zhǔn)系列管配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表2 吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液體積的移液槍引入的不確定度

其中，Urel(Qi)為移液槍移取標(biāo)準(zhǔn)工作液體積導(dǎo)致的相對(duì)不確定度。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 樣液的配制過(guò)程引入的不確定度

樣液的配制過(guò)程所引入的不確定度來(lái)源主要有：樣品的稱量、樣品稀釋液的配制以及樣品系列管的配制等。

2.2.1 樣品稱量引入的不確定度

根據(jù)分析天平的檢定證書(shū)可知，天平的允差范圍為±0.001 g，采用矩形分布，包含因子為，本試驗(yàn)使用減重法稱取樣品0.500 g，共稱重2 次，即一次為空盤(pán)質(zhì)量，一次為總質(zhì)量。則樣品稱量引入的相對(duì)不確定度為：

2.2.2 樣品稀釋液配制過(guò)程中引入的不確定度

稱取0.500 g樣品后，使用100.0000 mL容量瓶定容至刻度，從中移取5.0000～100.0000 mL容量瓶，定容至刻度，配制成樣品稀釋液。該過(guò)程中用到100.0000 mL容量瓶2 次，5.0000 mL移液槍1 次。根據(jù)《JJG 646 移液器檢定規(guī)程》及《JJG 196 常用玻璃量器檢定規(guī)程》可知所用量具的最大允許誤差。采用矩形分布，包含因子為，則移液管和容量瓶的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定見(jiàn)表3。

表3 樣品稀釋液液配制過(guò)程量具引入的不確定度

根據(jù)不確定度的合成公式，樣品稀釋液的配制過(guò)程中量具所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

環(huán)境溫度的變化對(duì)樣品稀釋液配制產(chǎn)生一定的影響，試驗(yàn)所用量具的校準(zhǔn)溫度為20 ℃。在實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程中，環(huán)境溫度的波動(dòng)范圍為（20±5）℃，水的體積膨脹系數(shù)約為2.1×10-4。因此，假設(shè)溫度波動(dòng)均勻分布，包含的因子為，則由溫度所引入的各量具相對(duì)不確定度均為0.06%，樣品稀釋液的配制過(guò)程中環(huán)境溫度所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

樣品稀釋液的配制所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 樣品系列管配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品系列管的配制過(guò)程中使用了1.0000 mL的移液槍吸取了0.5000、1.0000 mL，使用5.0000 mL的移液槍吸取了2.0000 mL。采用矩形分布，包含因子為，則由吸取樣品稀釋液液體積的移液槍引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表4。

表4 吸取樣品稀釋液體積的移液槍所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品系列管配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

其中，Urel（xi）為移液槍移取樣品稀釋液體積引入的相對(duì)不確定度。

樣品的配制引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 儀器測(cè)量的偏差引入的不確定度

使用紫外分光光度計(jì)讀取培養(yǎng)后各系列管吸光度值，儀器測(cè)量誤差主要為透射比的示值誤差。由校準(zhǔn)報(bào)告可得，該儀器透射比最大的允許誤差為1.00%，采用矩形分布，包含的因子為，因此儀器測(cè)量的偏差所引入的相對(duì)不確定度為：

2.4 測(cè)量重復(fù)性的不確定度

取同一樣品進(jìn)行6 次葉酸含量檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品重復(fù)測(cè)定結(jié)果（n=6）

重復(fù)測(cè)定所產(chǎn)生的不確定度屬A類(lèi)不確定度[16]，依據(jù)貝塞爾公式計(jì)算由隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

在日常檢驗(yàn)過(guò)程中，報(bào)告結(jié)果一般以2 次測(cè)量結(jié)果平均值表示，則2 次測(cè)量的結(jié)果平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.5 檢測(cè)方法引入的不確定度

選擇同一樣品進(jìn)行6 次加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

假設(shè)分布的類(lèi)型為三角分布，則由檢測(cè)的方法所引入的相對(duì)不確定度為：

2.6 合成不確定度和擴(kuò)展不確定度

本研究的主要不確定度由表7所示。

表7 不確定度分量的匯總

故微生物法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的合成相對(duì)不確定度為：

3 結(jié)論與討論

本研究采用微生物法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量，實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)所測(cè)得的樣品葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（148.49±7.37）μg/100g，k=2。通過(guò)不確定度分量研究可得，影響嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量檢測(cè)的主要因素是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程和樣液配制過(guò)程，其他因素為儀器測(cè)量偏差、重復(fù)性以及檢測(cè)方法。從研究結(jié)果可以看出，標(biāo)液和樣液的配制過(guò)程使用到了大量的量具，包括容量瓶、移液槍等，由量具引入的不確定度較大。因此，試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡量降低量具使用的誤差，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)操作規(guī)范操作，對(duì)試驗(yàn)用量具進(jìn)行定期校準(zhǔn)和維護(hù)。