雷帕霉素經(jīng)自噬/Nrf2途徑調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞功能在膀胱癌進(jìn)展中的作用①

曹振學(xué) 馬坦途 孫巍 劉貝貝 劉建民 郭園園（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，蚌埠233004）

膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，難以抑制的高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率是膀胱癌的重要特征。然而，針對膀胱癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的治療方式改進(jìn)緩慢，以鉑類為基礎(chǔ)的系統(tǒng)化療仍為晚期和轉(zhuǎn)移性膀胱癌的主要治療手段。近期研究顯示膀胱癌的發(fā)生和基因高突變率密切相關(guān)，其中超過40%的基因突變集中于mTOR信號通路，這表明mTOR通路可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色［1-2］。盡管臨床前研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)mTOR抑制劑對膀胱癌細(xì)胞具有顯著抑制作用，但轉(zhuǎn)化性臨床研究顯示膀胱癌患者并未從靶向mTOR的藥物治療中得到額外的生存獲益［3-6］。

腫瘤微環(huán)境可能是基礎(chǔ)到臨床研究轉(zhuǎn)化失敗的影響因素之一，巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細(xì)胞，在炎癥與腫瘤發(fā)生調(diào)節(jié)過程中起關(guān)鍵性作用。近期研究發(fā)現(xiàn)mTOR抑制劑雷帕霉素誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）自噬能夠影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，但TAMs自噬對其功能的影響以及在膀胱癌進(jìn)展中的作用尚不清楚。本研究在觀察雷帕霉素誘導(dǎo)TAMs自噬對膀胱癌細(xì)胞影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了TAMs自噬對細(xì)胞功能的作用及其機(jī)制，為mTOR抑制劑雷帕霉素治療膀胱癌的基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化提供了依據(jù)，具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料THP-1細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；雷帕霉素、3-MA、PMA（佛波酯）、LC3購自美國Sigma公司；人重組IL-4購自美國R&D公司；CD206抗體購自艾博抗（Abcam）公司；CD206-APC流式抗體購自美國BD公司；PCR引物由生工公司合成；SYBR Green Real-time PCR Master Mix，Rever-Tra Ace qPCR RT試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；HRP標(biāo)記的二抗、熒光二抗購自碧云天公司。激光共聚焦顯微鏡（D-Eclipse-C1）購于日本Nikon；PCR系統(tǒng)（GeneAmp970）購自美國PE公司；流式細(xì)胞儀（BD FACSCelesta）購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 TAMs極化及鑒定THP-1人單核細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5%CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液。選擇對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞，在其細(xì)胞匯合率達(dá)80%左右時(shí)，重置細(xì)胞密度為1×106～4×106個(gè)/cm2，按10 ng/ml的濃度加入PMA作用細(xì)胞72 h，刺激THP-1細(xì)胞單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，然后繼續(xù)以IL-4 20 ng/ml的濃度刺激細(xì)胞極化為TAMs。然后通過以下方式鑒定極化成功：①流式細(xì)胞術(shù)檢測TAMs表面分子CD206；②qRT-PCR檢測arg-1、il-10、vegf和mgl-1等TAMs相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)。

1.2.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測巨噬細(xì)胞CD206表達(dá)極化成功的TAMs細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，離心棄上清，PBS漂洗細(xì)胞2次后重懸細(xì)胞，按照1∶100加入CD206-APC抗體，4℃孵育1 h，離心棄上清，PBS漂洗后重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.3 免疫熒光檢測細(xì)胞或組織CD206和LC3表達(dá)組織切片需經(jīng)脫蠟、梯度乙醇脫水、抗原修復(fù)、PBS漂洗、3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶等步驟；細(xì)胞需行細(xì)胞爬片、多聚甲醛固定步驟。然后組織切片和細(xì)胞爬片用血清室溫封閉30 min，1∶100加入CD206或（和）LC3抗體，4℃孵育過夜。漂洗后滴加熒光二抗，室溫孵育1 h，PBS漂洗后滴加DAPI避光孵育10 min，隨后PBS漂洗、封片，應(yīng)用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4 RT-PCR檢測TAMs相關(guān)分子的表達(dá)根據(jù)Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA，cDNA逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。qPCR反應(yīng)采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix，使 用ABI 7500系統(tǒng)上機(jī)檢測，具體檢測步驟及反應(yīng)條件設(shè)置按照試劑盒說明書進(jìn)行，所有樣品做3個(gè)復(fù)孔，RNA相對表達(dá)量以2-ΔΔCt方法計(jì)算。引物見表1。

表1 TAMs相關(guān)細(xì)胞因子引物序列Tab.1 Primer sequences for TAMs related lytokines

1.2.5 ELISA檢測TAMs相關(guān)分子取雷帕霉素處理的TAMs細(xì)胞，離心并收集細(xì)胞上清液。取標(biāo)準(zhǔn)品和未稀釋的上清液各100 μl，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行檢測細(xì)胞上清液中TGF-β、VEGF、IL-10、Arg-1的蛋白表達(dá)。

1.2.6 組織標(biāo)本收集收集我科臨床病例診斷明確的肌層浸潤性膀胱癌（MIBC）患者，術(shù)中留取膀胱癌及對應(yīng)的癌旁組織（PC）樣本各20例，留取組織后立即多聚甲醛固定，制作石蠟標(biāo)本，用于免疫組化和免疫熒光檢測。該方案經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過（倫科批字［2017］第008號），且患者簽署知情同意書。

1.2.7 電鏡檢測細(xì)胞自噬小體將藥物干預(yù)的TAMs制作細(xì)胞爬片，3%戊二醛固定后送電鏡室進(jìn)一步處理和電鏡觀察。

1.2.8 TAMs與膀胱癌細(xì)胞共培養(yǎng)模型將TAMs以2×105個(gè)/ml密度接種于半透膜孔徑為0.4μm的6孔Transwell板下室中，待TAMs貼壁后，在上室中接種T24人膀胱癌細(xì)胞，構(gòu)建非接觸共培養(yǎng)體系。

1.2.9 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力將藥物預(yù)處理的TAMs鋪板后，與T24人膀胱癌細(xì)胞共培養(yǎng)。10μl槍頭在T24細(xì)胞培養(yǎng)皿中劃線，PBS輕輕沖洗去除劃下的細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察劃痕變化。

1.2.10 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力將藥物預(yù)處理的TAMs鋪板后，與T24人膀胱癌細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，然后將T24細(xì)胞的上室取出，直接放置于加有10% FBS和培養(yǎng)基500μl的下室中，放入37℃孵箱培養(yǎng)24 h，取出上室并吸去多余液體，PBS清洗2次，加入結(jié)晶紫染液染色5 min，清洗后鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均用±s表示，組間比較選用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAMs誘導(dǎo)和鑒定THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA刺激后，細(xì)胞由懸浮轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁生長，同時(shí)形態(tài)由類圓形變?yōu)椴灰?guī)則并伸出偽足，表明THP-1分化成為巨噬細(xì)胞（M0）。進(jìn)一步用IL-4刺激巨噬細(xì)胞向TAMs極化，IL-4刺激后細(xì)胞形態(tài)變化不明顯（圖1A）。流式細(xì)胞學(xué)檢測TAMs膜標(biāo)記物CD206，結(jié)果顯示IL-4刺激后CD206陽性的巨噬細(xì)胞顯著增多（圖1B、C，P＜0.01）。此外，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)TAMs細(xì)胞因子il-10、vegf和mgl-1等表達(dá)顯著增加（圖1D，P＜0.05，P＜0.01）。以上結(jié)果表明，THP-1細(xì)胞被成功誘導(dǎo)極化為TAMs。

圖1 TAMs的誘導(dǎo)和鑒定Fig.1 Induction and identification of TAMs

2.2 雷帕霉素誘導(dǎo)TAMs自噬增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲雷帕霉素處理TAMs后，電鏡觀察細(xì)胞自噬小體變化，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素增加了TAMs的自噬小體數(shù)量（圖2A）。免疫熒光表明雷帕霉素處理后TAMs自噬標(biāo)記物L(fēng)C3表達(dá)增加，自噬抑制劑3-MA能夠抑制LC3的表達(dá)（圖2B）。以上結(jié)果證明，雷帕霉素能夠誘導(dǎo)TAMs自噬。將雷帕霉素干預(yù)的TAMs與膀胱癌細(xì)胞共培養(yǎng)，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測膀胱癌遷移和侵襲能力（圖3A、B），結(jié)果表明，雷帕霉素預(yù)處理的TAMs能夠明顯促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲，同時(shí)可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞N-cadherin、Snail和Slug等間質(zhì)樣因子的表達(dá)（圖3C），說明雷帕霉素可能通過誘導(dǎo)TAMs自噬增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。

圖2 雷帕霉素誘導(dǎo)TAMs自噬Fig.2 Rapamycin induces autophagy in TAMs

圖3 雷帕霉素干預(yù)的TAMs增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力Fig.3 Rapamycin treated TAMs increase migration and invasion of bladder cancer cells

2.3 雷帕霉素誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)TAMs Nrf2及細(xì)胞因子表達(dá)應(yīng)用Western blot和ELISA方法分別檢測雷帕霉素增強(qiáng)自噬的TAMs細(xì)胞因子的基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，雷帕霉素明顯增加了VEGF、IL-10和Mgl1等細(xì)胞因子的基因和蛋白表達(dá)，而3-MA能夠抑制雷帕霉素的作用（圖4A、B，P＜0.05，P＜0.01），表明雷帕霉素通過誘導(dǎo)自噬影響TAMs分泌功能。除此之外，通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達(dá)和核內(nèi)轉(zhuǎn)移，3-MA抑制自噬可部分逆轉(zhuǎn)雷帕霉素的作用（圖5A），且通過siRNA干擾TAMs Nrf2表達(dá)可部分抑制雷帕霉素對arg-1、vegf和il-10等細(xì)胞因子表達(dá)的增強(qiáng)作用（圖5B，P＜0.05，P＜0.01），以上結(jié)果說明雷帕霉素誘導(dǎo)自噬通過Nrf2增強(qiáng)TAMs的功能。

圖4 雷帕霉素促進(jìn)TAMs相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)Fig.4 Rapamycin increases expression of TAMs related cytokines

圖5 雷帕霉素誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)TAMs Nrf2及細(xì)胞因子表達(dá)Fig.5 Rapamycin induced autophagy enhances Nrf2 and cytokines expressions of TAMs

2.4 膀胱癌及癌旁組織腫瘤相關(guān)腫瘤細(xì)胞和自噬的表達(dá)通過免疫熒光雙染技術(shù)檢測膀胱癌組織及癌旁組織中TAMs標(biāo)記物CD206和自噬標(biāo)記物L(fēng)C3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中CD206和LC3表達(dá)均明顯增加，且大部分CD206陽性細(xì)胞的LC3表達(dá)增加（圖6A）。此外，免疫組化結(jié)果顯示膀胱癌組織中N-cadherin和Vimentin侵襲相關(guān)分子的表達(dá)增加（圖6B）。以上結(jié)果表明TAMs自噬表達(dá)增加與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

圖6 TAMs自噬在膀胱癌及癌旁組織中的表達(dá)Fig.6 Expressions of TAMs autophagy in bladder cancer and adjacent tissues

3 討論

腫瘤免疫微環(huán)境是調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的重要機(jī)制，作為免疫微環(huán)境中主要的間質(zhì)細(xì)胞，巨噬細(xì)胞主要通過兩種極化表型（M1和M2型）在膀胱癌進(jìn)展中發(fā)揮不同作用［7］。孫穎浩和許傳亮教授團(tuán)隊(duì)［8］通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析及臨床組織樣本免疫組化等方法，發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞為膀胱癌組織中浸潤的主要免疫細(xì)胞，進(jìn)一步分析表明M2巨噬細(xì)胞浸潤程度與膀胱癌組織學(xué)類型、分期、組織學(xué)分級及患者預(yù)后密切相關(guān)。MARTINEZ等［9］通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及膀胱癌臨床樣本分析證實(shí)BMP4能夠刺激巨噬細(xì)胞向M2型極化，從而促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展。本研究探討了mTOR抑制劑雷帕霉素對TAMs功能的影響及機(jī)制，以及對膀胱癌細(xì)胞的影響，探討臨床改善雷帕霉素對膀胱癌的療效提供思考方向。

自噬是細(xì)胞將胞質(zhì)中受損的細(xì)胞器和積聚的蛋白降解并再利用的過程，是細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)的機(jī)制之一。TONG等［10］研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤缺氧環(huán)境中，饑餓誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)，并通過TGF-β1/smad3途徑促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞EMT發(fā)生，并能夠激活HIF-1α從而增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞吉西他濱耐藥，而這些作用能夠被自噬抑制劑3-MA阻斷［11］。除此之外，氯喹能夠抑制自噬促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)對放療的敏感性［12］。近期研究發(fā)現(xiàn)TAMs自噬能夠影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，但對于不同腫瘤細(xì)胞的作用并不一致。SHAO等［13］研究結(jié)果顯示增強(qiáng)TAMs自噬有效抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，并增強(qiáng)癌細(xì)胞對放療的敏感性。另一方面，YANG等［14］研究則表明Cathepsin S介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬能夠刺激其向M2巨噬細(xì)胞極化，并增強(qiáng)SL4結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移能力。然而，巨噬細(xì)胞自噬在膀胱癌遷移侵襲中的作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中巨噬細(xì)胞主要為M2型巨噬細(xì)胞，且其自噬增強(qiáng)。體外研究證實(shí)雷帕霉素增強(qiáng)TAMs自噬并促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲，該結(jié)果為TAMs自噬對腫瘤細(xì)胞的作用增加了證據(jù)。

Nrf2是調(diào)控細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，近年發(fā)現(xiàn)Nrf2參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且該過程多與Nrf2對炎癥因子的調(diào)控相關(guān)。ERI H.KOBAYASHI等［15］通過ChIP-seq和ChIP-qPCR分析發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞Nrf2結(jié)合于促炎基因IL-6及IL-1β的鄰近區(qū)域，通過抑制RNA聚合酶Ⅱ的招募，從而阻斷炎癥因子的表達(dá)，證實(shí)Nrf2是細(xì)胞介質(zhì)生成的調(diào)節(jié)因子并發(fā)揮抗炎作用。FENG等［16］發(fā)現(xiàn)肝癌（Hep G2和Huh 7）和胰腺癌（SUIT2和Panc-1）細(xì)胞能夠活化單核細(xì)胞Nrf2表達(dá)并促使向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，Nrf2除可下調(diào)IL-6及IL-1β表達(dá)外，還可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞VEGF的表達(dá)和分泌，從而反饋性促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。最新研究證實(shí)通過雷帕霉素干預(yù)細(xì)胞自噬可通過活化Nrf2影響軟骨細(xì)胞的干細(xì)胞特性，抑制氧化應(yīng)激損傷和老化［17］。在本研究中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可通過自噬促進(jìn)Nrf2表達(dá)和入核，從而增強(qiáng)TAMs抗炎因子表達(dá)，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，TAMs在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色。本研究發(fā)現(xiàn)TAMs能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，雷帕霉素誘導(dǎo)自噬并進(jìn)一步通過Nrf2途徑增強(qiáng)TAMs功能。該研究充實(shí)了膀胱癌腫瘤免疫微環(huán)境理論，為mTOR抑制劑雷帕霉素控制膀胱癌進(jìn)展提供了理論依據(jù)。