基于脊髓大麻素受體CB2介導(dǎo)的MAPK信號通路探討電針治療膝骨性關(guān)節(jié)炎慢性痛的機(jī)制研究①

樊靜杰 袁普衛(wèi)鄭潔董博趙莉平（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，西安712046）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee ostearthritis，KOA）是一類復(fù)雜的全關(guān)節(jié)疾病，其特征為關(guān)節(jié)軟骨完整性破壞以及關(guān)節(jié)邊緣軟骨下骨板病變，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)功能喪失。KOA疼痛起初表現(xiàn)為間斷性、負(fù)重時(shí)疼痛，逐漸發(fā)展為持續(xù)性、慢性疼痛。KOA疼痛具有感受傷害性成分，涉及神經(jīng)病理性機(jī)制，尤其在KOA慢性、持續(xù)性疼痛中發(fā)揮不容忽視的作用［1］。脊髓敏化是急性痛向慢性痛轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)，也是神經(jīng)病理性疼痛的重要特征［2］。研究發(fā)現(xiàn)，KOA疼痛大鼠脊髓背角感覺神經(jīng)元活性顯著增強(qiáng)，其機(jī)制可能涉及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路（以P38和ERK為主）激活［3-4］。大麻素受體2（cannabinoid receptor 2，CB2R）是內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)重要組成部分，脊髓CB2R激活可通過抑制MAPK信號通路發(fā)揮抑制神經(jīng)病理性疼痛作用［5］。電針改善KOA慢性疼痛療效可靠，但相關(guān)鎮(zhèn)痛機(jī)制尚未明確。本研究以脊髓敏化參與KOA慢性疼痛為切入點(diǎn)，觀察電針對谷氨酸鈉碘乙酸（monoiodoacetate，MIA）誘導(dǎo)的KOA慢性疼痛大鼠行為學(xué)、脊髓背角炎癥因子及CB2R和MAPK信號通路的影響，探討電針治療KOA慢性疼痛的機(jī)制是否與電針激活脊髓CB2R進(jìn)而抑制MAPK信號通路及脊髓敏化相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級健康雌性SD大鼠32只，體重220～260 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號：SCXK（川）2015-030。培養(yǎng)于室溫（20±2）℃，12 h光照/12 h黑暗環(huán)境中，自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作和處理符合國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用準(zhǔn)則，保證完成實(shí)驗(yàn)的前提下，盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)。

1.1.2 主要試劑與儀器MIA（上海源葉生物科技有限公司）；水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；0.9%氯化鈉溶液（齊都藥業(yè)）；增強(qiáng)型RIPA裂解液、光譜磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒、HRP-羊抗兔F、Western blot專用一抗二抗稀釋液（武漢博士德）；Anti-CB2R、Antip38、Anti-ERK1+ERK2、Anti-CREB（美國ABCAM公司）；Western blot轉(zhuǎn)印濾紙（美國Bio-Rad公司）；PVDF（mil）0.45（瑞士Roche公司）；AB135-S電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；微量注射器（上海高鴿工貿(mào)有限公司）；IKA組織勻漿儀（德國IKA公司）；Allegra X-30R離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；37℃孵育箱（北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司）；Bio-Rad 680酶標(biāo)儀、PL-200熱刺痛儀（成都泰盟軟件有限公司）；Von Frey針刺痛覺測試套件（美國stoelting公司）；云龍牌針灸針（吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司）；華佗牌電針儀（SDZ-Ⅱ型）（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模32只大鼠隨機(jī)分為空白組（8只）、鹽水組（8只）和造模組（16只），造模成功后隨機(jī)分為模型組（8只）和電針組（8只）。模型復(fù)制采用MIA關(guān)節(jié)腔注射法［6］。10%水合氯醛（3.5 ml/kg）對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，左膝關(guān)節(jié)去毛，碘伏消毒關(guān)節(jié)周圍區(qū)域，采用微量注射器從髕骨下極髕腱外緣向髁間窩方向進(jìn)針，抵達(dá)股骨髁后回抽1 mm，注射50μl MIA（80 mg/ml），注射完畢后屈伸膝關(guān)節(jié)若干次使MIA均勻分布于關(guān)節(jié)腔。鹽水組以同樣方法注射50μl生理鹽水。

1.2.2 干預(yù)方法電針組在關(guān)節(jié)腔注射后14 d開始電針干預(yù)。治療穴位選取左側(cè)陽陵泉和犢鼻穴（外膝眼），取穴以中國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)分會(huì)制定的《常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位定位圖譜》并參照國家標(biāo)準(zhǔn)《腧穴名稱與定位》（GB/T12346-2006）進(jìn)行定位。陽陵泉（Yanglingquan GB 34）位于膝部，當(dāng)腓骨頭前下方凹陷處，犢鼻（Dubi ST 35）位于膝部，髕骨與髕韌帶外側(cè)凹陷中。選擇0.18 mm×13 mm一次性針灸針，待針直刺入適宜深度，常規(guī)提插或捻轉(zhuǎn)操作，接通SDZ-Ⅱ型電針儀，疏密波，頻率2/100 Hz交替，電流強(qiáng)度＜2 mA，1次/d，15 min/次，5次為1療程，共治療2個(gè)療程。各療程結(jié)束后間歇1 d測定痛性行為，再進(jìn)行下一療程治療。

1.2.3 指標(biāo)觀察分別于實(shí)驗(yàn)第0（造模前1 d）、3、7、10、14、20、26天進(jìn)行機(jī)械性痛覺超敏測定和熱痛覺過敏測定，評估大鼠痛性行為動(dòng)態(tài)變化。電針干預(yù)2療程后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉，生理鹽水灌注，取左側(cè)脊髓L3-L5部分。預(yù)冷生理鹽水沖洗，稱重，放入事先標(biāo)記好的EP管內(nèi)，剪碎，加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，冰上勻漿，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清至新標(biāo)記的EP管，-80℃保存用于ELISA和Western blot檢測。

1.2.4 痛性行為學(xué)評價(jià)

1.2.4.1 機(jī)械性痛覺超敏測定采用von Frey細(xì)絲測定大鼠機(jī)械痛縮足閾（methanical withdrawl threshold，MWT）。安靜環(huán)境中，室溫（20±2）℃，將大鼠分別置于27 cm×22 cm×28 cm鼠籠內(nèi)（帶腳墊），適應(yīng)20 min。按照up-down法，將一系列Von Frey細(xì)絲（0.08、0.2、0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0、26.0、60.0、100.0、180.0 g）從2.0 g力度開始垂直刺激大鼠左腳掌中部皮膚，使纖維彎曲5 s，短暫退縮或爪部退縮為陽性反應(yīng)［7］。重復(fù)試驗(yàn)3次取平均值。

1.2.4.2 熱痛覺過敏測定采用熱輻射測痛儀測定大鼠熱縮足潛伏期（thermal withdrawl latence，TWL）。安靜環(huán)境中，室溫（20±2）℃，將大鼠分別置于透明丙烯酸室內(nèi)（17 cm×11.5 cm×14 cm），適應(yīng)20 min，將輻射熱設(shè)置為50℃并置于后爪足底表面，爪子收縮表明誘發(fā)大鼠痛覺，導(dǎo)致紅外線源停止，記錄反應(yīng)時(shí)間（s）。重復(fù)試驗(yàn)3次取平均值。

1.2.5 ELISA檢測左側(cè)L3-L5脊髓背角中IL-1β及TNF-α含量取脊髓背角上清，按照BCA蛋白定量試劑盒說明測定上清中蛋白濃度，分別按照IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測，酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-1β、TNF-α含量。

1.2.6 Western blot檢測大鼠左側(cè)L3-L5脊髓背角CB2R及MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)取脊髓背角上清，BCA法測定上清中蛋白濃度，將蛋白樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液以4：1混合，煮沸5 min，取50μg等量蛋白樣品在15%SDS-PAGE凝膠電泳中分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，將膜與稀釋的β-actin抗體、CB2R抗體、p-P38、p-ERK抗體、CREB抗體4℃孵育過夜；將一抗孵育后的PVDF膜取出，洗滌10 min×3次，加入稀釋好的二抗HRP-羊抗兔F，室溫下緩慢振動(dòng)孵育1 h，TBST洗滌10 min×3次，特超敏ECL化學(xué)發(fā)光液使膜可視化，Bio-Rad軟件曝光，化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)成像，Image J軟件分析各條帶灰度。以CB2R/β-actin、p-P38/β-actin、p-ERK/β-actin及CREB/β-actin表達(dá)作為CREB、p-P38、p-ERK和CREB相對表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)采用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時(shí)組間比較采用SNK法，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針干預(yù)可明顯提高KOA慢性疼痛大鼠MWT、TWL如圖1所示，MIA注射前，各組大鼠MWL、TWL差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MIA注射后，模型組大鼠MWL、TWL持續(xù)下降，第14天開始維持較低水平，各時(shí)間點(diǎn)MWL、TWL與空白組差異顯著（P＜0.001）；電針組MIA注射后到干預(yù)前（3 d、14 d），MWL、TWL持 續(xù)下 降，與 空 白組 差 異顯 著（P＜0.001），與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），電針干預(yù)后（14 d、26 d）MWL、TWL明顯升高，與模型組差異顯著（P＜0.001）。

圖1 各組大鼠左側(cè)MWL、TWLFig.1 Left MWL and TWL of rats in each group

2.2 電針可降低KOA慢性疼痛大鼠脊髓背角IL-1β和TNF-α含量模型組脊髓背角IL-1β和TNF-α含量顯著升高，與空白組差異顯著（P＜0.01）；電針組脊髓背角IL-1β和TNF-α含量與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與模型組差異顯著（P＜0.01，圖2）。

圖2 各組大鼠脊髓背角IL-1β、TNF-α含量Fig.2 IL-1β and TNF-α contents in spinal dorsal horn of rats in each group

2.3 電針上調(diào)KOA慢性疼痛大鼠脊髓背角CB2R蛋白表達(dá)，下調(diào)p-P38、p-ERK、CREB蛋白表達(dá)與空白組相比，模型組和電針組脊髓背角CB2R呈高表達(dá)（P＜0.001）；與模型組相比，電針組CB2R蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001）。與空白組相比，模型組和電針組脊髓背角p-P38蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.001，P＜0.01）；電針組p-P38蛋白表達(dá)顯著低于模型組（P＜0.01）。模型組p-ERK和CREB蛋白表達(dá)較空白組顯著上調(diào)（P＜0.01，P＜0.001）；電針組p-ERK和CREB蛋白表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.01），與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠脊髓背角CB2R、P38、ERK、CREB蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions of CB2R，P38，ERK and CREB proteins in spinal dorsal horn of rats in each group

3 討論

KOA疼痛的病理機(jī)制復(fù)雜，涉及軟骨、軟骨下骨、滑膜、肌肉和韌帶等關(guān)節(jié)局部組織病變，同時(shí)涉及外周和中樞神經(jīng)機(jī)制，尤其是脊髓水平的中樞敏化在KOA慢性疼痛過程中起重要作用。臨床研究顯示，在不伴有關(guān)節(jié)中重度放射學(xué)病理改變的膝KOA慢性疼痛患者中，脊髓敏化可能是造成疼痛的主要原因，且決定疼痛嚴(yán)重程度［8-9］。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)由大麻素受體（主要包括CB1R和CB2R）、內(nèi)源性配體（內(nèi)源性大麻素）及參與合成和降解內(nèi)源性大麻素的酶組成。大麻素內(nèi)源性配體通過激活CB1R和/或CB2R發(fā)揮藥理作用。內(nèi)源性大麻素存在于整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個(gè)疼痛調(diào)節(jié)區(qū)域，包括中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、延髓腹側(cè)區(qū)和脊髓背角，這些區(qū)域的內(nèi)源性大麻素水平在慢性疼痛模型中顯著升高，并通過作用于CB1R和CB2R發(fā)揮疼痛調(diào)節(jié)作用［10］。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在MIA誘導(dǎo)的KOA大鼠脊髓痛覺通路敏化過程中呈現(xiàn)適應(yīng)性變化，表現(xiàn)為脊髓內(nèi)源性大麻素含量顯著升高，CB2R在脊髓背角神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中呈高表達(dá)，內(nèi)源性大麻素配體通過作用于CB2R發(fā)揮疼痛抑制作用，MIA誘導(dǎo)的CB2R高表達(dá)轉(zhuǎn)基因KOA小鼠痛性行為明顯減少［11-13］。提示脊髓CB2R活化具有抑制KOA疼痛作用，其機(jī)制與CB2R活化減輕脊髓痛覺通路超敏化相關(guān)。

細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路是慢性痛發(fā)生與維持的重要機(jī)制。MAPK是一組進(jìn)化上保守的細(xì)胞內(nèi)信號分子，在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，激活后通過轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)誘導(dǎo)和維持不同持續(xù)性疼痛條件下的痛敏反應(yīng)。MAPK家族中的P38和ERK在神經(jīng)病理性疼痛進(jìn)程中的調(diào)控作用己被廣泛認(rèn)可［14］。MIA誘導(dǎo)的KOA大鼠痛性行為與大鼠脊髓水平MAPK信號通路激活密切相關(guān)［15］。研究顯示，CB2R活化可下調(diào)腰5神經(jīng)損傷大鼠脊髓背角P38和ERK磷酸化水平，緩解神經(jīng)損傷大鼠機(jī)械性觸摸痛［13］。提示KOA大鼠脊髓背角CB2R激活通過MAPK信號通路（下調(diào)p-38和ERK磷酸化水平）抑制脊髓水平的中樞敏化，發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

電針治療KOA療效的系統(tǒng)性回顧和薈萃分析表明，電針干預(yù)KOA的療效確切，可緩解膝KOA疼痛，改善KOA綜合癥狀，提高KOA患者生活質(zhì)量［3］。電針治療KOA時(shí)，多以局部選穴為主，其中以犢鼻、陽陵泉、梁丘、血海、足三里和阿是穴較為常用［16-17］；電針治療參數(shù)無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，頻率以2 Hz和100 Hz最為常用。電針鎮(zhèn)痛機(jī)制研究涉及各種急、慢性疼痛，如炎癥性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛、腫瘤痛和內(nèi)臟痛等，而電針抑制KOA疼痛的針對性機(jī)制研究較少。近年研究發(fā)現(xiàn)，電針刺激可抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)：如TU等［18］通過電針刺激慢性限制性損傷（CCI）大鼠模型的同側(cè)足三里和陽陵泉穴發(fā)現(xiàn)，電針對慢性神經(jīng)損傷性疼痛過敏有顯著改善作用，與小膠質(zhì)細(xì)胞活性受抑制密切相關(guān)；WANG等［19］發(fā)現(xiàn)電針陽陵泉、環(huán)跳穴可顯著抑制CCI神經(jīng)痛大鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子釋放，減輕痛敏反應(yīng)。提示電針可抑制神經(jīng)病理痛模型脊髓水平的痛覺敏化起鎮(zhèn)痛作用，其機(jī)制與電針通過p38和ERK信號通路抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化相關(guān)。

MIA關(guān)節(jié)腔注射是目前國際上廣泛采用的KOA慢性疼痛造模方法，一般在注射第14天后出現(xiàn)類似神經(jīng)病理性痛成分［20］。本研究顯示，MIA誘導(dǎo)的KOA慢性痛大鼠脊髓背角IL-1β和TNF-α等炎癥因子含量明顯升高，與既往研究報(bào)道一致，表明KOA慢性疼痛具有神經(jīng)病理性成分［3］；MIA關(guān)節(jié)腔注射后，大鼠脊髓背角MAPK信號通路明顯活化，CB2R表達(dá)適應(yīng)性上調(diào)，給予“陽陵泉”“犢鼻”電針處理可顯著上調(diào)CB2R表達(dá)，下調(diào)p-P38、p-ERK和CREB表達(dá)，抑制MAPK信號通路活性，抑制KOA大鼠痛性行為。提示電針治療KOA慢性疼痛的作用機(jī)制可能與抑制脊髓水平的中樞敏化密切相關(guān)，這一效應(yīng)可能通過活化CB2R進(jìn)而抑制MAPK信號通路實(shí)現(xiàn)。

綜上，脊髓敏化參與OA慢性疼痛過程，其中脊髓背角感覺神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞激活發(fā)揮重要作用；脊髓背角感覺神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞CB2R活化后可通過MAPK信號通路（下調(diào)p-38和ERK磷酸化水平）抑制脊髓水平的痛覺敏化，發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)；電針可通過MAPK信號通路抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化，進(jìn)而抑制脊髓敏化，達(dá)到緩解神經(jīng)病理性疼痛效應(yīng)。因此，課題組提出科學(xué)假說：電針通過CB2R調(diào)控脊髓敏化發(fā)揮OA鎮(zhèn)痛效應(yīng)，這一效應(yīng)與活化的CB2R對脊髓MAPK信號通路（包括p38和ERK）的抑制作用密切相關(guān)，并通過本研究進(jìn)行了驗(yàn)證。